Name: Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Aprenda a observar interações proteína-DNA em nível de molécula única usando pinças ópticas duplas e microscopia de fluorescência. Este método permite controlar a tensão do DNA e rastrear proteínas com precisão nanométrica.

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Agradecemos Gijs wuite, Erwin JG Peterman, e Peter Gross para ajudar com a microfluídica e Alessia Tempestini para obter ajuda com a preparação da amostra. Esta pesquisa foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7 / 2007-2013) ao abrigo do contrato de subvenção n ° 284464 e do Ministério da Educação italiano, Universidade e Pesquisa FIRB 2011 RBAP11X42L006, Futuro em Ricerca 2013 RBFR13V4M2, e no âmbito da Projeto Nanomax Flagship.

1 Pinças Ópticas instalação com nanômetro Estabilidade A configuração experimental deve fornecer duas pinças ópticas com apontando estabilidade a nível nanométrico e intensidade flutuações do laser de aprisionamento abaixo de 1%. Combinação dessas condições vai garantir estabilidade nanômetros do haltere sob tensão normal (1 PN - algumas dezenas de pn), rigidez armadilha (0,1 PN / nm) e largura de banda de medição (taxa de aquisição de imagem de 20 seg -1). Um esquema da montagem experimental é mostrada na Figura 1. <ol><li> Projeto pinças ópticas e de construção 15,17: <ol><li> Monte o aparato experimental em uma mesa óptica com isoladores de ativos para reduzir as vibrações mecânicas. Montar a estrutura microscópio sobre isoladores elastoméricos para absorver o ruído acústico e ressonâncias mecânicas da estrutura microscópio. </li><li> Inserir um isolador óptico no percurso do laser aprisionamento, perto da fonte de luz laser, para reduce flutuações de amplitude aleatórias devido a realimentação óptica. </li><li> Reduza o comprimento do caminho do laser armadilhas, tanto quanto possível e coloque todo o caminho em uma caixa selada para reduzir as flutuações do laser apontadores devido às correntes de ar e turbulência. </li><li> Criar pinças ópticas duplas dividindo uma única fonte de laser infravermelho próximo (Nd: YAG, 1064 nm de comprimento de onda) em dois feixes com polarizações ortogonais. Não use armadilhas compartilhada em tempo, pois causam oscilação do haltere sob tensão 12. </li><li> Use defletores óptico-acústico (EDAO) impulsionado por sintetizadores digitais Diretos (DDSS) para permitir movimentos finos de (pelo menos) uma armadilha e regulação precisa da tensão DNA. DDSs permitir uma melhor estabilidade armadilha de osciladores de tensão controlada (VCOs). </li><li> Inserir dois fotodiodos detector quadrante (QDPs) no plano focal posterior do condensador para detectar a posição dos grânulos presas com precisão sub-nm. </li></ol></li><li> Verifique se a intensidade fluctuations do laser de aprisionamento na entrada microscópio são inferiores a 1%, utilizando um fotodiodo, com uma largura de banda maior do que a taxa de aquisição de imagem. </li><li> Verifique apontando estabilidade dos dois lasers de captura: <ol><li> Preparar grânulos de sílica em tampão fosfato: Diluir 20 uL de esferas de sílica (1,54 ^ M, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de tampão fosfato 50 mM, lavar duas vezes, e finalmente ressuspender em 100 ul de 50 mM de tampão de fosfato. </li><li> Calibrar pinças ópticas com contas de sílica: preparar uma célula de fluxo, anexando uma lamela para uma lâmina de microscópio utilizando fita dupla adesiva (cerca de 60 mm de espessura). Fluxo de 1 mg / ml de BSA e esperar 3 min. Fluxo de grânulos de sílica diluído 1/1000 em tampão de fosfato e vedar a câmara de fluxo com massa de silicone. Armadilha uma pérola em cada armadilha e calibrar as armadilhas, utilizando o método de espectro de potência 18. </li&gt; <li> Preparar grânulos de sílica em acetato de pentilo e nitrocelulose: Diluir 20 ul de pérolas de sílica (1,54 uM, 10% de sólidos) em 1 ml de acetona, sonicar 30 seg, vortex brevemente, e centrifugar 2 min a 19.000 x g. Ressuspender em 1 ml de acetona e lavagem repetida. Ressuspender em 1 ml de acetato de pentilo e lavar duas vezes. Finalmente ressuspender los em acetato de pentilo com 0,1% de nitrocelulose, dissolvido em acetato de pentilo. </li><li> Espalhe 2 ul de esferas de sílica 1,54 um de diâmetro dissolvidos em acetato de pentilo + 0,1% de nitrocelulose sobre a superfície de uma lamela (24 x 24 mm), utilizando uma segunda lamela (24 x 60 mm). Fixe a lamela para uma lâmina de microscópio, usando dois pedaços de fita dupla face para criar uma célula de fluxo. Encha a célula de fluxo com tampão fosfato 50 mM e selá-lo com graxa de silicone. </li><li> Imagem de um talão de sílica em microscopia de campo claro com ampliação 2,000X. O campo de visão deve ser de 7 x 5 mm adquirido em 768 x 576 pixels, para que a imagem do grânulo tem um diâmetro de 190 pixels. Compensar desvios térmicas com um software de feedback que, tal como na ref. 17, calcula a posição xy partir do centro da imagem e z a partir dos anéis de difracção e corrige desvios que se deslocam com uma fase de piezo-nm ou melhor precisão. </li><li> Sobrepor ao centro da armadilha esquerda com o centro da pérola (os níveis de sinal xy do QDP deve ser a mesma medida durante a calibração) e medir o ruído e a sua posição de desvio padrão da QDP. Repita a medição para a armadilha direita. </li></ol></li></ol> 2. Single Molecule localização com nanômetro Precisão <ol><li> Projeto de microscopia de fluorescência e construção 15,19 <ol><li> Use uma alta eficiência quântica e CCD multiplicou-elétron para alcançar os altos índices necessários para a precisão nanométrica localização sinal-ruído. </li><li> Escolha óptica para obter uma imagem de pixel de tamanho ~ 80 nm (por exemplo, uma ampliação da imagem ~ 200X com um tamanho de pixel de câmara de 16 mm). Este é suficientemente pequena a negligenciar erro de localização devido a pixelização 8, mas suficientemente grande para recolher um número considerável de fótons por pixel. </li><li> Como fonte de excitação, que utilizam a luz do laser é não polarizada (por passagem através de uma fibra óptica não mantendo-polarização), ou polarizada circularmente (passando através de um λ / 4 waveplate) para maximizar a excitação de cromóforos únicos, independentemente da sua orientação. </li><li> Escolha filtros de banda de emissão que eficiência de corte tanto excitação e armadilhas luzes de laser. Nota: Em nossos experimentos, rotulado nossa proteína com corante Atto532 e utilizado um filtro passa-banda de emissão centrada em 600 nm com largura de banda de 100 nm. </li></ol></li></ol> 3. microfluídica Para conseguir um controlo preciso de troca de tampão e a montagem &quot;haltere&quot;, isto é, a fixação de uma única molécula de ADN entre as duas microesferas opticamente armadilhados, um fluxo laminar multicanal integrado personalizadosistema tem de ser desenvolvido. Este é composto por uma câmara de fluxo, uma pressão do reservatório e um sistema de controlo de pressão (Figura 2). <ol><li> Preparação da célula de fluxo NOTA: A câmara de fluxo usado para experiências de molécula única a interacção ADN-proteína tem de preferência quatro entradas e uma saída, para permitir que até quatro fluxos de tampão em paralelo, cada uma contendo um dos diferentes elementos necessários para a experiência: grânulos, ADN, proteína, e tampão de imagiologia por fluorescência marcado. A separação dos componentes dos canais de fluxo permite uma montagem eficiente de haltere. Além disso, o canal de imagem é útil para evitar a fluorescência de fundo, a partir de proteínas de difusão e atingir a elevada relação de sinal-para-ruído necessário para a localização da proteína de ligação a DNA com uma precisão da ordem de alguns nanómetros. <ol><li> Faça furos de 1 mm de diâmetro na lâmina do microscópio (76 x 76 x 1 mm) com um diamante-ponta, a fim de criar 4 entradas e uma saída. </li><li> Limpe ªe lâminas de microscópio com etanol e o centro da porta com o anel de vedação inserido e o anel de adesivo na corrediça circundante dos orifícios de acesso. É fundamental o uso de luvas durante este passo para evitar impressões digitais, o que pode perturbar o processo de colagem. </li><li> Fixe as NanoPorts para o slide, e colocá-lo no forno pré-aquecido a 180 ° C por 1 hora para permitir a ligação completa. </li><li> Desenhar o padrão do contorno da célula de fluxo de um pedaço de papel. Os canais devem ser ~ largura de 3 mm e corresponder à posição de orifícios na lâmina de microscópio. </li><li> Coloque o desenho por cima de dois pedaços de Parafilm e com um bisturi afiado e fazer cortes contínuos ao longo do contorno desenhada. Remova qualquer protuberância formada. Descarte a camada inferior Parafilm, que é usado apenas para garantir um suporte limpo. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio contendo o NanoPorts ligados de cabeça para baixo no suporte metálico. </li><li> Alinhe cuidadosamente o contorno câmara Parafilm com os orifícios, certificando-thno parafilme não obtrude as entradas e saída da câmara. </li><li> Cubra com lâminas de microscópio limpa (62 x 56 x 0,15 milímetros) e retire cuidadosamente o excesso de Parafilm torno da câmara. </li><li> Colocar dois blocos de calor, previamente aquecido a 120 ° C, na parte superior da célula de fluxo para aplicar pressão constante sobre ele. Deixe o Parafilm derreter por aproximadamente 25 min. </li></ol></li><li> Reservatório de pressão e recipientes de tampão O reservatório de pressão deve ser feita de Plexiglas (ou semelhante) e permitir a acomodação de seis recipientes de tampão. A possibilidade de dispor de, pelo menos, dois recipientes de tampão adicional melhora a flexibilidade do instrumento. Note que os recipientes transparentes e tubos ajudam consideravelmente na manipulação do sistema de fluxo e solução de problemas de bolhas de ar presas. Luer estéril e descartável seringas lock-ponta (2,5 ml), a partir do qual os êmbolos foram removidos, são recipientes tampão boas e permitem uma fácil ligação com o tubo de entrada. Certifique-se de queo volume total de fluido é pequena em comparação com o volume de ar no interior do reservatório de pressão, uma condição essencial para se obter um fluxo suave e estável. <ol><li> Conecte válvulas de corte na saída dos recipientes tampão para transformar o fluxo tampão ligado ou desligado durante os experimentos. </li><li> Montar a célula de fluxo na platina do microscópio. Ligue as válvulas de corte para as entradas de câmara de fluxo com tubos polieteretercetona (diâmetro ~ 150 um interno) e acessórios sem flange. Adicionar ~ 3 cm da tubagem de etileno propileno fluorado (~ 500 mm de diâmetro interno) como uma ligação entre o tubo e os conjuntos NanoPort da célula de fluxo. Este passo é essencial para reduzir o fluxo de tampão na câmara de entrada para evitar a ruptura da célula de fluxo ou NanoPort descolamento do vidro. O uso de tubos de grande diâmetro interno sozinho, por outro lado, iria exigir grandes volumes de amostras biológicas. </li><li> Ligue a saída da câmara de fluxo para um tubo Falcon aberto à pressão atmosférica. Estetubo serve como disposição para o buffer que sai da câmara de fluxo. </li></ol></li><li> Sistema de controle de pressão <ol><li> Construir um sistema de controlo de pressão capaz de ajustar com precisão a pressão de ar no interior do reservatório de pressão. Isto pode ser feito por meio de duas válvulas solenóides controladas por computador, que está ligado a uma fonte de pressão de 0,5 atm (compressor) e o segundo à pressão atmosférica. As válvulas solenóides são repetidamente aberto durante aproximadamente 7 mseg para aumentar ou diminuir a pressão na linha até que o valor desejado seja alcançado. NOTA: esta abordagem foi adaptada de Carlos Bustamante 20, e produz um fluxo mais suave do que usar uma bomba de seringa motor de passo 21. </li><li> Adicionar um transdutor de pressão controlada por um software de escrita à medida para monitorizar a pressão efectiva exercida sobre o reservatório de pressão. Pressões típicas de trabalho são da ordem de 20 mbar para montagem haltere e 200 mbar para lavar os componentes do sistema de fluxo. </li></ol></li&gt; </ol> 4. ADN Tailing com biotinilado Desoxicitidina trifosfato (biotina-dCTP) A molécula de DNA deve ser maior do que 1 pm a facilitar a sua extensão e sob fluxo de ancoragem para os grânulos de presas. Além disso, um ADN de comprimento vai evitar que a luz IR aprisionamento de iluminar a proteína de ligação de ADN. Isto tem uma importância especial, pois a absorção de luz IR de um cromóforo animado resulta em aumento da fotodegradação. NOTA: No presente estudo, a molécula de DNA foi de 3,7 mM de comprimento. A molécula continha três cópias do operador principal O1 e uma cópia de cada um dos dois agentes auxiliares, O2 e O3. Estas sequências foram inseridos no meio da molécula, o que resulta, portanto, aproximadamente equidistantes entre as esferas presos e raios laser infravermelhos. <ol><li> Misture 1 pmol de DNA extremidades 3 &#39;lineares com 60 pmol de biotina-14-dCTP, 4 l de 5x Terminal deoxynucleotidyl Transferase tampão (TdT) (1 ca M de potássiocodylate, Tris 125 mM, 0,05% (v / v) de Triton X-100, 5 mM de CoCl2 (pH 7,2 a 25 ° C)) e 1,5 ul de TdT e ddH2O para um volume total de 20 ul. Incubar a mistura a 37 ° C durante 15 min. Isto resultará na adição de até 60 nucleótidos por cada extremidade do ADN. Note-se que o DNA 3&#39;-saliências são atados com maior eficiência do que as extremidades de recesso ou cega. </li><li> Purificar DNA atados com colunas de spin ou fenol / clorofórmio e posterior precipitação etanol para remover CoCl 2 do tampão de reação TdT. </li><li> Após a purificação, o ADN pode ser armazenado a 4 ° C, durante várias semanas, ou a -20 ° C durante períodos mais longos, mas evitar o descongelamento repetidos e recongelação. </li></ol> 5. de marcação de proteínas com grupos tiol Atto532 Rotular através da modificação de resíduos de cisteína não deve alterar a atividade de proteínas. Para ultrapassar este problema, usamos LacI mutante, LacIQ231C, um which transporta apenas uma cisteína por monómero na posição 231 Este mutante preserva as mesmas características do tipo selvagem e as modificações químicas na posição 231 foram mostradas para não interferir com a estabilidade da proteína 22. NOTA: Nós marcado a proteína com ATTO532 maleimide. <ol><li> Certifique-se de que a proteína é dissolvida num tampão com um pH variando de 7,0 a 7,5 e com uma concentração variando de 2 a 10 mg / ml. NOTA: nestas experiências, LacI foi dissolvido em fosfato de potássio 0,3 M, glicose a 5%, pH 7,5 (tampão A). </li><li> Dissolve-se Tris-(2-carboxietil) fosfina (TCEP) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. TCEP solução deve ser preparada antes da utilização. </li><li> Misturar 100 mL da proteína com TCEP e 3 ul de vórtice cuidadosamente. </li><li> Dissolve-se o corante em N, N-dimetilformamida (DMF) a uma concentração final de 10 mg / ml de trabalho em condições de pouca luz. Vortex até dissolver completamente. </li><li> Reação mix: Adicionar 33 mL de corante à proteína + TCEP e vortex cuidadosamente. Rotação rápida para recolher o máximo de solução possível. </li><li> Incubar a mistura de reacção durante 2 horas num agitador (8000 rpm) a 20 ° C (ou a 4 ° CO / N), ao abrigo da luz. </li><li> Dissolver L-glutationa reduzida (GSH) a uma concentração final de 100 mg / ml em H 2 O. Adicionar 3 mL da mistura de reacção e incuba-se com o agitador a 8000 rpm durante 15 min. GSH irá parar a reacção por bloquear a reactividade dos grupos tiol. </li><li> Purifica-se a proteína marcada usando colunas de filtração em gel, padrão de diálise ou concentradores de spin. NOTA: Nestas experiências, marcado LacI foi purificado por meio de 10 kDa concentradores de corte de rotação. <ol><li> Dilui-se a mistura de reacção com um máximo de 12 ml de tampão A, aplicá-lo ao dispositivo concentrador, e centrifuga-se que em 8000 xg, 1 hora, 4 ° C. O LacI assim marcado é concentrada até um volume final de cerca de 500 mL e o excesso de tinta passa a membrana na flow-through. Descarte o flow-through e repita o passo 5.8.1, pelo menos, três vezes. </li></ol></li><li> Dividir a proteína marcada em pequenas alíquotas e armazenam-se a -80 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. </li></ol> 6. combinada óptica Trapping e única molécula Experimentos imagens de fluorescência <ol><li> Adicionar 1 mL de tampão A para os recipientes de tampão e aplicar pressão de 200 mbar para lavar as tubagens de ligação e célula de fluxo. Para maximizar a difusão da proteína de ligação de ADN, aqui e nos passos seguintes, Um tampão pode ser substituída com um tampão de baixa força iónica. NOTA: Nestes experimentos, foram utilizados 0,5 x TBE. </li><li> Verificar a presença de bolhas de ar, o que pode afectar a suavidade do fluxo. Um movimento suave no tubo de saída vai ajudar a eliminar as bolhas restantes. </li><li> Diminuir a pressão de 20 mbar e verificar que todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar eo buffer flui com velocidades semelhantes em todos os canais. </li><li>Preparar as amostras para um volume final de 300 uL: esferas de poliestireno revestidas com estreptavidina, 1,87 m; 20 pM de DNA linear, biotinilado em ambas extremidades, de acordo com o ponto 4; 300 pM de LacI tetramer marcado com Atto532 de acordo com a seção 5. </li><li> Adicionar a cada amostra para um dos recipientes de seringa, na seguinte ordem: Os grânulos no primeiro canal, o DNA no segundo terço do canal, com o tampão de imagem apenas (sistema de tampão A + eliminador de oxigénio) e a proteína marcada no quarto canal. </li><li> Ligue o fluxo em 200 na mbar durante 3 minutos para permitir que as amostras chegam no interior do canal de fluxo. Em seguida, reduzir a pressão de 20 mbar. </li><li> Enquanto a imagem do primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligar as duas pinças ópticas e pegar um talão de poliestireno em cada armadilha. </li><li> Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que outras esferas caem nas armadilhas. Note-se que a chegada do canal de ADN é facilmente perceptível pela extremidade do rebordo de fluxo. </li><li> Usando one AOD, mover uma armadilha (cordão) para trás e para a frente na proximidade do outro cordão para permitir a fixação do ADN estendido de fluxo entre as duas esferas opticamente armadilhados. Quando um haltere de ADN é formado, o talão estático começa a seguir o movimento da esfera que está activamente deslocado para trás e para a frente através da armadilha. </li><li> Mova-se rapidamente para o canal de buffer e desligar o fluxo de buffer. Realizar uma análise da curva da força de extensão de 4,23-25 ​​para verificar a presença de uma única molécula de DNA. Se mais do que uma molécula está presente (isto é, a entalpia, levantando fase da curva de força-de extensão ocorre em um comprimento mais curto do que o comprimento do contorno do DNA), descartar o haltere e começar de novo a partir do passo 6.7. </li><li> Uma vez que um único haltere DNA é obtido, ligue o fluxo de novo e mover o haltere para o canal de proteína. Mudar para a microscopia de fluorescência de campo grande para monitorar a interação do rótulo LacI com DNA. Desligue o fluxo e começar a aquisição. </li></ol>

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<li>Elangovan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+in+vitro+and+in+situ+study+of+kinetics+of+myosin+II+from+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle.</a> J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).</li>
<li>Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+laser+trap%2Fflow+control+video+microscope+for+the+study+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules.</a> Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nat Methods. 5, 517-525 (2008).</li>
<li>Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer+opening+in+LacI-mediated+DNA+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li>
<li>van Mameren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+structure+of+DNA+during+overstretching+by+using+multicolor%2C+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).</li>
<li>Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA with optical tweezers.</a> Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).</li>
<li>Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+precise+algorithm+based+on+maximum+radial+symmetry+for+single+molecule+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization.</a> Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).</li>
<li>Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+accurate+particle+tracking+by+calculation+of+radial+symmetry+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers.</a> Nat Methods. 9, 724-726 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Na última década, as técnicas simples de manipulação de imagem e de moléculas houve um grande progresso em termos de resolução espacial e temporal. A combinação das técnicas de manipulação de imagem e está na base de poderosos instrumentos que agora permitem o controlo das condições mecânicas de um único polímero biológico, tal como ADN, ARN ou filamentos do citoesqueleto, a localização e simultânea de proteínas individuais de interagir com o mesmo polímero . Controlando as condições mecânicas do polímero de presa é de ...

Molécula única (SM) técnicas têm muito desenvolvido ao longo dos últimos 30 anos para responder à necessidade de superar algumas das limitações dos tradicionais, as medições da solução a granel 1-3. A manipulação de moléculas biológicas únicas criou a oportunidade para medir as propriedades mecânicas de biopolímeros 4 e controlar as propriedades mecânicas da proteína-proteína 5 e interacções proteína-ADN 6,7. Detecção de fluorescência SM, por outro lado, representa uma ferramenta extremamente versátil para estudar a actividade da proteína in vitro e in vivo, conduzindo a possibilidade de localizar e rastrear as moléculas individuais com uma precisão nanométrica. Através da montagem do instrumento de ponto de espalhamento de função para a imagem SM, na verdade, pode-se realizar com uma precisão de localização, dependendo principalmente da razão sinal-para-ruído (SNR) e atingir um limite de cerca de 8,9 um nanómetro. Estas metodologias encontrar poderosoaplicações no estudo da dinâmica das proteínas de motor, bem como dos processos de difusão subjacentes alvo em busca de proteínas de ligação de ADN. A capacidade de determinar constantes de difusão como uma função da sequência de DNA, o tempo de residência no alvo e medir com precisão o comprimento do DNA explorado durante os eventos de difusão unidimensional, representam uma ferramenta poderosa para o estudo da dinâmica de interacção proteína-ADN e para a investigação dos mecanismos de busca alvo específico. Recentemente, a combinação destas duas técnicas produziu uma nova geração de montagens experimentais 10-14, permitindo a manipulação simultânea de um substrato biológico (por exemplo, um filamento de actina ou uma molécula de ADN) e detecção / localização de um parceiro de interacção enzima (por exemplo miosina ou uma proteína de ligação ao ADN). As vantagens destas técnicas descansar principalmente na possibilidade de se exercer um controlo mecânico sobre o polímero aprisionada, assim enaBling o estudo da dinâmica de interação contra forças ou torques. Além disso, a metodologia permite a medição de reacções bioquímicas longe da superfície, evitando uma das principais limitações dos métodos clássicos SM, isto é, a necessidade de imobilização das moléculas em estudo sobre uma superfície (lâmina de vidro ou microesferas). A combinação de duas técnicas únicas moléculas requer superar várias dificuldades técnicas, principalmente decorrente das exigências de estabilidade mecânica e SNR adequada (principalmente quando houver a necessidade de localização com precisão nm) 15. Em particular, quando o acoplamento detecção de fluorescência SM com pinças ópticas, a redução do ruído e fotodegradação dos lasers infravermelhos armadilhas 16 eo controle de buffers bioquímicos para a montagem dos complexos biológicos e realização das medidas experimentais 11 são de suma importância. Aqui, descrevemos os métodos para a realização bem-sucedidamedições em uma configuração de localização trapping / SM fluorescência dupla. A metodologia é ilustrada com o exemplo da proteína do repressor da lactose (LacI), marcado por fluorescência (com Atto532) e detectada, uma vez que se liga a uma molécula de ADN (presa entre duas pinças ópticas), contendo sequências de ligação LacI específicos (isto é, os operadores). Nós demonstrar a eficácia do método em detectar a ligação de Lacl ao ADN e ao longo do seu contorno difusão no processo de busca de alvo. O método é aplicável a qualquer combinação de sequências de ADN e de proteína de ligação de ADN, bem como para outros sistemas de microtúbulos (ou os filamentos de actina e proteínas que interagem com eles a motor).

<table><tbody><tr><td>Isoladores elastoméricos</td><td>Newport</td><td>Newdamp</td><td>Escolha o elastômero Newdamp apropriado, dependendo do peso do microscópio e das frequências de ressonância</td></tr><tr><td>Isolador óptico</td><td>Óptica para pesquisa</td><td>IO-3-YAG-VHP</td><td></td></tr><tr><td>Laser Nd:YAG, comprimento de onda de 1.064 nm</td><td>Espectro-Física</td><td>Millennia IR</td><td></td></tr><tr><td>Defletores acústico-ópticos (AODs)</td><td>A& A optoeletrônico</td><td>DTS-XY 250</td><td></td></tr><tr><td>Direct Digital Synthesizers</td><td>Analog Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detector de quadrante fotodiodos</td><td>OSI optoeletrônica</td><td>SPOT-15-YAG</td><td></td></tr><tr><td>DIO e placa FPGA</td><td>National Instruments</td><td>NI-PCI-7830R</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpada halógena</td><td>Schott</td><td>KL 1500 LCD</td><td></td></tr><tr><td>Condensador</td><td>Olympus</td><td>U-AAC 1.4NA Objetiva Aplanat Apchromat</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA imersão</td><td></td>em água</tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>CCD 200X e 2000X</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>XC-ST70 CE</td><td></td></tr><tr><td>CCD multiplicado por elétrons</td><td>Hamamatsu&nbsp;</td><td>C9100-13</td><td></td></tr><tr><td>Platina Piezo com precisão nm</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-527.2CL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Emissão</td><td>Chroma Technologies</td><td>600/100m</td><td></td></tr><tr><td>Contas de Sílica (1.54 mm)</td><td>Bangs Laboratories</td><td>SS04N/5303</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de pentilo&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46022</td><td>Líquido e vapor inflamáveis (No 1272/2008)</td></tr><tr><td>Nitrocelulose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8267-5EA</td><td>Sólido inflamável&nbsp; (n.o 1272/2008)</td></tr><tr><td>Bloco de calor</td><td>MPM Instruments Srl</td><td>M502-HBD</td><td>com 2 blocos removíveis; pré-aquecido a 120 & C</td></tr><tr><td>NanoPort monta</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td>Tubulação de polieteretercetona <td>N-333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Upchurch Scientific Inc.</td><td>1535</td><td></td></tr><tr><td>Suporte metálico caseiro para a montagem do reservatório de pressão da câmara de fluxo feito de</td> seringas de ponta de trava Luer de Plexiglass <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS 02LZ1</td><td></td></tr><tr><td>Válvulas de corte&nbsp;</td><td>Upchurch Científica, Inc.</td><td>P-732</td><td></td></tr><tr><td>Conexões sem flange&nbsp;</td><td>Upchurch Científica, Inc.</td>Tubo de etileno propileno fluorado <td>LT-111</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Upchurch Científica, Inc.</td><td>1549</td><td></td></tr><tr><td>Duas válvulas solenóides controladas por computador</td><td>Clippard, Cincinnati, EUA</td><td>ET-2-H-M5</td><td></td></tr><tr><td>Transdutor de pressão</td><td>Druck LTD</td><td>PTX 1400</td><td></td></tr><tr><td>biotina-14-dCTP&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>19518-018</td><td></td></tr><tr><td>Terminal desoxinucleotidil Transferase (TdT)</td><td>Thermoscientific</td><td>EP0161</td><td></td></tr><tr><td>ATTO532 maleimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68499</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>Líquido Combustível, Nocivo pela absorção pela pele. Irritante Teratógeno. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; Pág. 201; Pág. 261; Pág. 280; Pág. 305; Pág. 351; Pág. 338; P311</td></tr><tr><td>Cloridrato de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutationa reduzida (GSH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4251</td><td>Toxicidade aguda, Oral (Categoria 5), H303</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, Membrana PLQK Ultracel-PL, 10&nbsp; Concentradores de spin de corte kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>grânulos de poliestireno revestidos com estreptavidina 1,87 &micro; m</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando uma única molécula de manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-dna

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

O artigo descreve a combinação de pinças ópticas e detecção de fluorescência de molécula única para o estudo da interação proteína-DNA. O método oferece a oportunidade de investigar as interações que ocorrem em solução (evitando assim problemas devido a superfícies próximas como em outros métodos de molécula única), controlando a extensão do DNA e rastreando a dinâmica da interação em função dos parâmetros mecânicos e da sequência de DNA. Os métodos para estabelecer o aprisionamento óptico bem-sucedido e a localização nanométrica de moléculas únicas são ilustrados. Ilustramos as condições experimentais que permitem o estudo da interação do repressor de lactose (lacI), marcado com Atto532, com uma molécula de DNA contendo sequências alvo específicas (operadores) para ligação ao LacI. O método permite a observação de interações específicas nos operadores, bem como a difusão unidimensional da proteína durante o processo de busca de alvos. O método é amplamente aplicável ao estudo das interações proteína-DNA, mas também a motores moleculares, onde o controle da tensão aplicada ao polímero da trilha parceira (por exemplo, actina ou microtúbulos) é desejável.

Em uma experiência positiva, uma (ou mais) proteínas marcadas passam por ligação / desligação de difusão e / ou unidimensional ao longo da molécula de DNA (Figura 3A). A localização de proteínas ao longo da molécula de ADN permite a quantificação dos parâmetros cinéticos, como uma função da sequência de ADN. Quando são aplicadas as condições do tampão que causam a difusão 1E, é possível seguir trajectórias de proteína, e determinar, por exemplo, o coeficiente de difusão D 1E. <p class="jo...

Aqui nós descrevemos os instrumentos e métodos para a detecção de moléculas de proteína única fluorescently rotulados interagindo com uma única molécula de DNA suspenso entre duas microesferas opticamente presos.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

O objetivo geral deste procedimento é observar a interação dinâmica entre uma única proteína ligadora de DNA e uma molécula de DNA. Isso é alcançado combinando, em um microscópio personalizado, duas técnicas de molécula única: pinças ópticas duplas e microscopia de fluorescência. Esta configuração também é equipada com iluminação de campo claro para visualização e estabilização do amostra em escala nanométrica.Como segundo passo, uma célula de fluxo multicanal integrada a um sistema de fluxo microscópico é construída para permitir até quatro fluxos laminares que recrutem e montem eficientemente todos os componentes necessários para o experimento. Em seguida, o arranjo de molécula única é montado para realização dos experimentos. Primeiramente, duas microesferas revestidas com titina em faixa são capturadas com pinças ópticas duplas no primeiro canal.As duas esferas aprisionadas são então movidas para o segundo canal para permitir a ligação do molde de DNA marcado com biotina em ambas as extremidades. A presença de uma única molécula de DNA é verificada no terceiro canal por meio de uma análise de força e extensão do DNA. Por fim, o conjunto em forma de bastão constituído por esfera-DNA-esfera, denominado bastão de DNA, é movido para o canal de proteína, onde está presente a proteína represora da lactose marcada com fluoróforo.Obtêm-se resultados que demonstram a difusão e a ligação específica de moléculas individuais de LAC eye em uma única molécula de DNA esticada e a quantificação dos parâmetros cinéticos do movimento de LAC eye. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes de molécula única são a possibilidade de controlar a tensão aplicada à molécula de DNA, a possibilidade de rastrear com precisão os movimentos das proteínas ligantes em um ponto estável de nanômetros, bem como a capacidade de operar longe da superfície da lamínula. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as interações entre proteínas e DNA, especialmente sobre a mecânica da regulação da expressão gênica, bem como sobre a dinâmica da difusão proteica ao longo do DNA nos mecanismos de busca de alvo.Esta demonstração deste método é muito útil para mostrar os aspectos práticos da construção da célula de fluxo, do manuseio da amostra e da montagem do construto de DNA ligado a microesferas. Este vídeo demonstrará primeiro como verificar a estabilidade do alinhamento dos dois lasers de aprisionamento usando microesferas fixadas na superfície de uma lamínula como referência. Detalhes sobre o projeto e a construção da configuração de pinças ópticas podem ser encontrados no texto do protocolo correspondente.Use um lamínula de 24 por 60 milímetros para espalhar dois microlitros de microesferas de sílica sobre a superfície de um lamínula de 24 por 32 milímetros. Usando dois pedaços de fita adesiva dupla face, fixe o lamínula de 24 por 32 milímetros em uma lâmina de microscópio para criar uma câmara de fluxo.Encha a célula de fluxo com 50 milimolares de tampão fosfato e sela-a com graxa de silicone. Um microesfera de sílica na microscopia de campo claro com aproximadamente 2000 vezes de aumento. O campo de visão deve ser de aproximadamente sete por cinco micrômetros, adquirido em 768 por 576 pixels, de modo que a imagem da microesfera tenha um diâmetro de aproximadamente 190 pixels. Compense as derivas térmicas com um software de realimentação que calcula a posição XY a partir do centro da imagem e a posição Z a partir dos anéis de difração, corrigindo assim as derivações.Movendo um estágio piezo com precisão de nanômetro ou melhor, sobreponha o centro do armadilhamento esquerdo ao centro da esfera e meça o ruído de posição e seu desvio padrão a partir do fotodiodo de quadrante ou QDP. Repita a medição para o armadilhamento direito. O desvio padrão do ruído de posição deve estar dentro de alguns nanômetros para permitir a localização precisa de proteínas de ligação ao DNA ao montar a câmara de fluxo.Uma ponta de diamante é usada inicialmente para perfurar orifícios de um milímetro de diâmetro em uma lâmina de microscópio de 76 por 76 por um milímetro. Isso cria quatro entradas e uma saída, permitindo até quatro fluxos paralelos de tampão.Cada um contendo um dos diferentes componentes necessários para o experimento: esferas, DNA, proteína marcada com fluoróforo e tampão de imagem. Limpe a lâmina de microscópio com etanol e posicione no centro o orifício com o anel O inserido e o anel adesivo na lâmina ao redor dos orifícios de acesso. É essencial usar luvas durante este passo para evitar impressões digitais, que poderiam interferir no processo de colagem.Com a ajuda de uma segunda lâmina, prenda os nanoconectores à lâmina e coloque-a em uma estufa pré-aquecida a 180 graus Celsius por uma hora para permitir a fixação completa. Enquanto isso, desenhe o padrão do contorno da célula de fluxo em uma folha de papel. O canal deve ter aproximadamente três milímetros de largura e corresponder às posições totais na lâmina do microscópio.Coloque o desenho sobre duas peças de perfil e, com um bisturi, faça cortes precisos e contínuos ao longo do contorno desenhado. Remova quaisquer protuberâncias formadas, descarte a camada inferior de parfum, que é utilizada apenas para garantir um suporte limpo. Em seguida, posicione a lâmina de microscópio contendo os nanoportos fixados virada para baixo no suporte metálico.Alinhe cuidadosamente o contorno da câmara de paraform com os orifícios, certificando-se de que o para não extrude pelas entradas e saída da tampa da câmara; cubra com uma lamínula de microscópio limpa e remova cuidadosamente o excesso de para ao redor da câmara. Coloque dois blocos de aquecimento previamente aquecidos a 120 graus Celsius sobre a célula de fluxo para aplicar pressão homogênea sobre ela. Deixe a película de para derreter por aproximadamente 25 minutos.O próximo passo é preparar o reservatório de pressão e os recipientes de tampão. O reservatório de pressão é feito de plexiglass e permite acomodar até seis recipientes de tampão. Primeiro, conecte as válvulas de fechamento na saída dos recipientes de tampão para ligar o fluxo de tampão com a alavanca da válvula na posição vertical ou desligar na posição girada no sentido horário.Durante os experimentos, fixe a câmara de fluxo na platina do microscópio. Em seguida, conecte as válvulas de fechamento através da tubulação de poli éter, éter cetona ou tubulação peak, e as conexões sem flange às entradas da câmara de fluxo. A tubulação peak possui um diâmetro interno de aproximadamente 150 micrômetros; cerca de três centímetros de tubulação de politetrafluoroetileno com diâmetro interno de aproximadamente 500 micrômetros são utilizados como ligação entre a tubulação peak e os conjuntos de nanoportas da câmara de fluxo.Isso é essencial para reduzir o fluxo do tampão na entrada da câmara, evitando a quebra da célula de fluxo ou o desprendimento do nanoporto do vidro. O uso de tubos com diâmetro interno grande, por outro lado, exigiria grandes volumes de amostras biológicas. Conecte a saída da câmara de fluxo a um tubo Falcon aberto, à pressão atmosférica.Este tubo serve como descarte para o tampão que escoa da câmara de fluxo. Para iniciar este procedimento, adicione um mililitro do tampão A a cada um dos recipientes de tampão e aplique 200 milibares de pressão para lavar os tubos de conexão e a célula de fluxo. Um sistema de controle de pressão é capaz disso.Por fim, ajuste a pressão do ar no interior do reservatório de pressão. Verifique a presença de bolhas de ar, que podem interromper a fluidez do fluxo. Uma leve batida no tubo de saída ajudará a remover quaisquer bolhas remanescentes, reduza a pressão para 20 milibares e verifique se todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar e se o tampão flui com velocidades semelhantes em todos os canais.Prepare as amostras para um volume final de 300 microlitros. Este experimento utiliza microesferas de poliestireno revestidas com strept, DNA linear biotinilado em ambas as extremidades que contém sequências-alvo específicas para ligação do repressor de lactose e proteína fluorescentemente marcada do repressor de lactose. Adicione cada amostra a um dos compartimentos da seringa na seguinte ordem: microesferas no primeiro canal, DNA no segundo, tampão de imagem no terceiro e proteína marcada no quarto canal.Ative o fluxo em 20 milibares e abra as válvulas de bloqueio para permitir que as amostras entrem no canal de fluxo. Isso é facilmente detectável no canal de microesferas. Enquanto imagina o primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligue as duas pinças ópticas e capture uma microesfera de poliestireno em cada armadilha.Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que as outras microesferas caiam nas armadilhas. Observe que a chegada no canal de DNA é facilmente perceptível pelo fim do fluxo de microesferas. Usando um desviador óptico AO ou um movimento OD, mova uma microesfera presa de volta e para frente na proximidade da outra microesfera, permitindo a ligação do DNA estendido pelo fluxo entre as duas microesferas aprisionadas opticalmente.Quando um dumbbell de DNA é formado, a esfera estática começa a seguir o movimento da esfera que é movida ativamente para frente e para trás pela armadilha. Mova-se rapidamente para o canal de tampão e desligue o fluxo de tampão. Realize uma análise de curva de força-extensão para verificar a presença de uma única molécula de DNA.Isso é realizado separando as duas esferas enquanto se mede a tensão do DNA. Uma vez obtido um único dumbbell de DNA, ligue novamente o fluxo e mova o dumbbell para o canal de proteína. Alterne para microscopia de fluorescência de campo amplo para monitorar a interação da proteína repessora da lactose marcada com o DNA, desligue o fluxo e inicie a aquisição.Este método permite a detecção de moléculas individuais de repressor de lactose ou lac eye interagindo com uma molécula de DNA esticada. Neste gráfico CH representativo, uma molécula única de lac eye difunde-se ao longo de sequências de DNA não específicas, enquanto outra molécula de lac eye está ligada especificamente a um operador localizado no centro da molécula de DNA. Este gráfico mostra a posição das duas moléculas de lac eye ao longo da direção que conecta os centros das duas armadilhas.Em função do tempo, as posições das moléculas foram determinadas pelo algoritmo de centro de simetria radial mostrado aqui, que apresenta um gráfico do deslocamento médio quadrático, ou MSD, versus o tempo para uma única molécula de lac eye difundindo ao longo de uma molécula de DNA esticada. O coeficiente de difusão da proteína pode ser facilmente obtido por meio de regressão linear dos dados. A combinação de técnicas de manipulação e de imagem constitui um método poderoso, permitindo controle mecânico sobre um único polímero biológico, como DNA-RNA ou um filamento do citoesqueleto, e a localização simultânea de moléculas individuais de proteína interagindo com o próprio polímero.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a combinação de técnicas de manipulação e imagem em nível de molécula única exige um planejamento cuidadoso da montagem experimental para garantir a estabilidade em nível de nanômetro do polímero suspenso. Por outro lado, é necessário um adequado planejamento da sonda biológica para assegurar separação espacial entre o laser de aprisionamento G e a sonda fluorescente. Consulte o texto do protocolo suplementar para obter detalhes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar a molécula de DNA entre os dois batimentos ópticos rápidos, referentes à montagem deste construto. Os melhores resultados são obtidos com a câmara de fluxo multicanal, para a qual fornecemos uma descrição detalhada. Também indicamos como otimizar o fluxo do tampão e remover as bolhas de ar, as quais, caso contrário, poderiam comprometer seus experimentos.No protocolo combinado de texto, você pode encontrar os protocolos para marcar o DNA com bioTE, o que é necessário para a montagem com as microesferas revestidas de estreptavidina, bem como os protocolos para marcar a proteína. Finalmente, ilustramos as operações passo a passo para quantificar a ligação e a difusão de uma única proteína repressora de lactose em uma molécula de DNA esticada.

combining-single-molecule-manipulation-imaging-for-study-protein-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um modo de tocar microscópio de força atômica método (AFM) para a visualização de DNA plasmídeo, proteínas citoplasmáticas e proteína-DNA complexos é descrito. O método inclui abordagens alternativas para a preparação de amostras para AFM imagem após a manipulação bioquímica. DNA contendo regiões específicas interagindo proteínas são observados em condições quase fisiológica buffer.

Visualização do DNA recombinante e Complexos de Proteínas Usando Microscopia de Força Atômica

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

Imagem de molécula única para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em cortinas de DNA

Microscopia localização fotoativado (PALM), combinada com uma única molécula de rastreamento permite a observação direta e quantificação das interações DNA-proteína em células de Escherichia coli ao vivo.

Visualizando interações DNA-proteína em células bacterianas ao vivo usando fotoativado única molécula de Rastreamento

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar interações DNA-proteína por microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM) usando um substrato de DNA modificado site-specifically λ e um ponto quântico rotulado de proteína.

Visualizando a interação entre a proteína Qdot-etiquetadas e λ Site-specifically modificada de DNA a nível da molécula

Usando DNA marcado com ponto quântico e microscopia de fluorescência de reflexão interna total, podemos investigar o mecanismo de reação das endonucleases de restrição ao usar proteína não marcada. Essa técnica de molécula única permite a observação massivamente multiplexada de interações proteína-DNA individuais, e os dados podem ser agrupados para gerar distribuições de tempo de permanência bem povoadas.

Análise de tempo de permanência de molécula única de clivagem de DNA mediada por endonuclease de restrição

Aqui, descrevemos o uso do método de imagem de molécula única, Cortinas de DNA, para estudar o mecanismo biofísico dos condensados EWS-FLI1 que se reúnem no DNA.

Imagem de molécula única de condensados EWS-FLI1 montados no DNA

A cortina de DNA, uma técnica de imagem de molécula única de alto rendimento, fornece uma plataforma para visualização em tempo real de diversas interações proteína-DNA. O presente protocolo utiliza a técnica de cortina de DNA para investigar o papel biológico e o mecanismo molecular de Abo1, uma Schizosaccharomyces pombe contendo bromodomínio AAA+ ATPase.

Decifrando o Mecanismo Molecular da Montagem de Histonas pela Técnica de Cortina de DNA

A bioquímica visual de molécula única estudada através de câmaras microfluídicas é muito facilitada usando barril de vidro, seringas à prova de gás, conexões estáveis de tubos para células de fluxo e eliminação de bolhas colocando válvulas de comutação entre as seringas e a tubulação. O protocolo descreve armadilhas ópticas duplas que permitem a visualização de transações de DNA e interações intermoleculares.

Uso de pinças ópticas duplas e microfluídicas para estudos de molécula única

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Relatamos um ensaio de conjunto híbrido e molécula única para obter imagens diretas e quantificar o movimento de helicase Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) totalmente reconstituída e marcada com fluorescência em moléculas de DNA lineares mantidas no lugar em uma armadilha óptica.

Conjunto híbrido e ensaio de molécula única para imagem do movimento de CMG totalmente reconstituído

Este protocolo descreve o procedimento para realizar microscopia de localização profunda de molécula única (SMLM) em célula inteira usando um microscópio confocal de disco giratório com reatribuição óptica de fótons, permitindo assim a imagem DNA-PAINT sem a necessidade de óptica personalizada ou iluminação complexa.

Imagem de Superresolução de Célula Inteira via DNA-PAINT em um disco confocal giratório com reatribuição óptica de fótons

Aprenda a observar interações proteína-DNA em nível de molécula única usando pinças ópticas duplas e microscopia de fluorescência. Este método permite controlar a tensão do DNA e rastrear proteínas com precisão nanométrica.

Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

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