Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

O objetivo geral deste procedimento é observar a interação dinâmica entre uma única proteína de ligação ao DNA e uma molécula de DNA. Isso é conseguido combinando em um microscópio personalizado, duas técnicas de molécula única, pinças ópticas duplas e microscopia de fluorescência. Esta configuração também é equipada com iluminação de campo brilhante para visualização e estabilização nanométrica da amostra.

Como segunda etapa, uma célula de fluxo multicanal integrada em um sistema de microfluxo é construída para permitir que até quatro fluxos laminares recrutem e montem com eficiência todos os componentes necessários para o experimento. Em seguida, a construção de uma única molécula é montada para realizar os experimentos. As duas primeiras microesferas revestidas com titina são capturadas com as pinças ópticas duplas no primeiro canal.

As duas esferas presas são então movidas para o segundo canal para permitir a fixação do molde de DNA marcado com biotina em ambas as extremidades. A presença de uma única molécula de DNA é verificada no terceiro canal por uma análise de extensão de força de DNA. Por fim, a construção do grânulo de DNA do grânulo chamada haltere de DNA é movida para o canal de proteína onde a proteína repressora de lactose marcada com fluorescência está presente.

São obtidos resultados que mostram a difusão e a ligação específica de moléculas oculares únicas do LAC em uma única molécula de DNA esticada e a quantificação dos parâmetros cinéticos do movimento ocular do LAC. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos de molécula única existentes são a possibilidade de controlar a tensão aplicada à nova molécula, a possibilidade de rastrear com precisão os movimentos das proteínas de ligação em um ponto estável nanométrico, bem como a capacidade de operar longe da superfície de repouso da cobertura. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre as interações do DNA de proteínas, especialmente sobre a mecânica da regulação da expressão gênica, bem como a dinâmica da difusão de proteínas ao longo do DNA nos mecanismos de busca de alvos.

Esta demonstração deste método é muito útil para mostrar os aspectos práticos da construção da célula de fluxo, manuseio de amostras e montagem da construção do grânulo de DNA de batida. Este vídeo demonstrará primeiro como verificar a estabilidade de apontamento dos dois lasers de aprisionamento usando microesferas presas em uma superfície de lamínula como referência. Detalhes sobre o projeto e a construção da configuração da pinça óptica podem ser encontrados no texto do protocolo que acompanha.

Use uma lamínula de 24 por 60 milímetros para espalhar dois microlitros de esferas de sílica na superfície de uma lamínula de 24 por 32 milímetros. Usando dois pedaços de fita dupla face. Prenda a lamínula de 24 por 32 milímetros em uma lâmina de microscópio para criar uma célula de fluxo.

Encha a célula de fluxo com 50 milimolares de tampão fosfato e sele-a com uma imagem de graxa de silicone. Um grânulo de sílica em microscopia de campo claro com ampliação de aproximadamente 2000 vezes. O campo de visão deve ser de aproximadamente sete por cinco micrômetros, adquirido a 7, 68 por 5, 76 pixels, de modo que a imagem do cordão tenha um diâmetro de aproximadamente 190 pixels, compense os desvios térmicos com um software de feedback que calcule a posição XY do centro da imagem e Z dos anéis de difração e corrija os desvios.

Movendo um estágio pizo com precisão nanométrica ou melhor, sobreponha o centro da armadilha esquerda com o centro do cordão e meça o ruído de posição e seu desvio padrão do detector de quadrante, fotodiodo ou QDP. Repita a medição para o purgador certo. O desvio padrão do ruído de posição deve estar dentro de alguns nanômetros para permitir a localização precisa das proteínas de ligação ao DNA para formar a célula de fluxo.

Uma ponta de diamante é usada pela primeira vez para fazer furos de um milímetro de diâmetro em um microscópio de 76 por 76 por um milímetro. Deslize para criar quatro entradas e uma saída. Isso permitirá até quatro fluxos de buffer paralelos.

Cada um contendo um dos diferentes componentes necessários para os grânulos do experimento, proteína marcada com DNA com fluorescência e tampão de imagem. Limpe a lâmina do microscópio com etanol e centralize a porta com o O-ring inserido e o anel adesivo na lâmina ao redor dos orifícios de acesso. É essencial usar luvas durante esta etapa para evitar impressões digitais, o que atrapalharia o processo de colagem.

Com a ajuda de uma segunda lâmina, prenda as nano portas à lâmina e coloque-a em um forno pré-aquecido a 180 graus Celsius por uma hora para permitir a fixação completa. Enquanto isso, desenhe o padrão de contorno da célula de fluxo em um pedaço de papel. O canal deve ter aproximadamente três milímetros de largura e corresponder a todas as posições na lâmina do microscópio.

Coloque o desenho em cima de duas peças de perfil e com um bisturi, faça cortes nítidos e contínuos ao longo do contorno desenhado. Remova quaisquer protuberâncias formadas, descarte a camada inferior de perfume, que é usada apenas para garantir um suporte limpo. Em seguida, coloque a lâmina do microscópio contendo as nano portas anexadas de cabeça para baixo no suporte metálico.

Alinhe cuidadosamente o contorno da câmara paraforme com os orifícios, certificando-se de que o paraman não expulse as entradas e saídas da tampa da câmara com uma lamínula de microscópio limpa e remova cuidadosamente o excesso de params ao redor da câmara. Coloque dois blocos de calor previamente aquecidos a 120 graus Celsius no topo da célula de fluxo para aplicar pressão homogênea sobre ela. Deixe o filme para derreter por aproximadamente 25 minutos.

O próximo passo é preparar o reservatório de pressão e os recipientes tampão. O reservatório de pressão é feito de plexiglass e permite a acomodação de até seis recipientes tampão. Primeiro, conecte as válvulas de corte na saída dos recipientes de buffer para ligar o fluxo de buffer com a alavanca da válvula na posição vertical ou desligada na posição girada no sentido horário.

Durante os experimentos, monte a célula de fluxo no microscópio stage. Em seguida, conecte as válvulas de corte através do poliéter, éter cetona ou tubulação de pico e as fiações sem flange às entradas da câmara de fluxo. A tubulação de pico tem um diâmetro interno de aproximadamente 150 micrômetros quilômetros, aproximadamente três centímetros de tubulação de etileno propileno fluorado com um diâmetro interno de aproximadamente 500 micrômetros são usados como uma ligação entre a tubulação de pico e os conjuntos de nano portas da célula de fluxo.

Isso é essencial para reduzir o fluxo do tampão na entrada da câmara para evitar a quebra da célula de fluxo ou o desprendimento da nano porta do vidro. O uso de tubos de grande diâmetro interno, por outro lado, exigiria grandes volumes de amostras biológicas. Conecte a saída da câmara de fluxo a um tubo Falcon aberto à pressão atmosférica.

Este tubo serve como descarte para o tampão que sai da câmara de fluxo. Para iniciar este procedimento, adicione um mililitro de tampão A a cada um dos recipientes tampão e aplique 200 milibares de pressão para lavar os tubos de conexão e a célula de fluxo. Um sistema de controle de pressão é capaz.

Finalmente, ajustando a pressão do ar dentro do reservatório de pressão. Verifique a presença de bolhas de ar, que podem atrapalhar a suavidade do fluxo. Um movimento suave no tubo de saída ajudará a remover quaisquer bolhas restantes, diminuir a pressão para 20 milibares e verificar se todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar e se o buffer flui com velocidades semelhantes em todos os canais.

Preparar as amostras para um volume final de 300 microlitros. Este experimento utiliza esferas de poliestireno revestidas com strept, DNA linear biotinilado em ambas as extremidades que contêm sequências-alvo específicas para ligação ao repressor de lactose e proteína repressora de lactose marcada com fluorescência. Adicione cada amostra a um dos recipientes de seringa na seguinte ordem: esferas no primeiro canal, DNA no segundo, tampão de imagem no terceiro e proteína marcada no quarto canal.

Ligue o fluxo a 20 milibares e abra as válvulas de corte para permitir que as amostras cheguem ao canal de fluxo. Isso é facilmente detectável no canal do cordão. Ao obter imagens do primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligue as duas pinças ópticas e pegue um cordão de poliestireno em cada armadilha.

Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que as outras contas caiam nas armadilhas. Observe que a chegada ao canal de DNA é facilmente perceptível no final do fluxo de contas. Usando um defletor óptico AO ou um movimento OD, um cordão de armadilha para frente e para trás na proximidade do outro cordão para permitir a fixação do DNA estendido do fluxo entre os dois grânulos opticamente presos.

Quando um haltere de DNA é formado, o cordão estático começa a seguir o movimento do cordão que é ativamente movido para frente e para trás pela armadilha. Mova-se rapidamente para o canal de buffer e desligue o fluxo de buffer. Realize uma análise da curva de extensão de força para verificar a presença de uma única molécula de DNA.

Isso é feito separando as duas esferas enquanto mede a tensão do DNA. Depois que um único haltere de DNA for obtido, ligue o fluxo novamente e mova o haltere para o canal de proteína. Mude para microscopia de fluorescência de campo amplo para monitorar a interação da proteína repressora de lactose marcada com o DNA, desligue o fluxo e inicie a aquisição.

Este método permite a detecção de um único repressor de lactose ou moléculas de olho lac interagindo com uma molécula de DNA esticada. Neste agrama CH representativo, uma única molécula de olho lac se difunde ao longo de sequências de DNA não específicas, enquanto outra molécula lac eye está especificamente ligada a um operador localizado no centro da molécula de DNA. Este gráfico mostra a posição das duas moléculas de olho lac ao longo da direção que conecta os centros das duas armadilhas.

Em função do tempo, as posições das moléculas foram determinadas pelo algoritmo do centro de simetria radial mostrado aqui é um gráfico do deslocamento quadrático médio ou MSD versus tempo para uma única molécula de olho lac difundindo-se ao longo de uma molécula de DNA esticada. O coeficiente de difusão da proteína pode ser facilmente obtido a partir da regressão linear dos dados. A combinação de técnicas de manipulação e imagem é um método poderoso, permitindo o controle mecânico de um único polímero biológico, como D-N-A-R-N-A ou um filamento do citoesqueleto, e a localização simultânea de moléculas de proteína únicas interagindo com o próprio polímero.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a combinação de técnicas de manipulação e imagem de molécula única requer um projeto cuidadoso da configuração experimental para garantir a estabilidade em nível nanométrico do polímero suspenso. Por outro lado, é necessário um design adequado da sonda biológica para garantir uma separação especial entre o laser G de captura e a sonda fluorescente. Consulte o texto do protocolo que acompanha para obter detalhes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar a molécula de DNA entre as duas batidas rápidas ópticas na montagem dessa construção. É melhor obtido com a célula de fluxo multicanal para a qual fornecemos a descrição detalhada. Também indicamos como otimizar o fluxo de buffer e remover as bolhas de ar, que de outra forma poderiam comprometer seus experimentos.

No protocolo de combinação de texto, você pode encontrar os protocolos para marcar o DNA com bioTE, que é necessário para a montagem com os batimentos revestidos de estreptavidina, bem como os protocolos para marcar a proteína. Finalmente, ilustramos as operações passo a passo para quantificar a ligação e a difusão de uma única proteína repressora da lactose em uma molécula de DNA esticado.