Combinando uma única molécula de Manipulação e imagem para o estudo das interações proteína-DNA

O objetivo geral deste procedimento é observar a interação dinâmica entre uma única proteína ligadora de DNA e uma molécula de DNA. Isso é alcançado combinando, em um microscópio personalizado, duas técnicas de molécula única: pinças ópticas duplas e microscopia de fluorescência. Esta configuração também é equipada com iluminação de campo claro para visualização e estabilização do amostra em escala nanométrica.

Como segundo passo, uma célula de fluxo multicanal integrada a um sistema de fluxo microscópico é construída para permitir até quatro fluxos laminares que recrutem e montem eficientemente todos os componentes necessários para o experimento. Em seguida, o arranjo de molécula única é montado para realização dos experimentos. Primeiramente, duas microesferas revestidas com titina em faixa são capturadas com pinças ópticas duplas no primeiro canal.

As duas esferas aprisionadas são então movidas para o segundo canal para permitir a ligação do molde de DNA marcado com biotina em ambas as extremidades. A presença de uma única molécula de DNA é verificada no terceiro canal por meio de uma análise de força e extensão do DNA. Por fim, o conjunto em forma de bastão constituído por esfera-DNA-esfera, denominado bastão de DNA, é movido para o canal de proteína, onde está presente a proteína represora da lactose marcada com fluoróforo.

Obtêm-se resultados que demonstram a difusão e a ligação específica de moléculas individuais de LAC eye em uma única molécula de DNA esticada e a quantificação dos parâmetros cinéticos do movimento de LAC eye. As principais vantagens desta técnica em relação aos métodos existentes de molécula única são a possibilidade de controlar a tensão aplicada à molécula de DNA, a possibilidade de rastrear com precisão os movimentos das proteínas ligantes em um ponto estável de nanômetros, bem como a capacidade de operar longe da superfície da lamínula. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre as interações entre proteínas e DNA, especialmente sobre a mecânica da regulação da expressão gênica, bem como sobre a dinâmica da difusão proteica ao longo do DNA nos mecanismos de busca de alvo.

Esta demonstração deste método é muito útil para mostrar os aspectos práticos da construção da célula de fluxo, do manuseio da amostra e da montagem do construto de DNA ligado a microesferas. Este vídeo demonstrará primeiro como verificar a estabilidade do alinhamento dos dois lasers de aprisionamento usando microesferas fixadas na superfície de uma lamínula como referência. Detalhes sobre o projeto e a construção da configuração de pinças ópticas podem ser encontrados no texto do protocolo correspondente.

Use um lamínula de 24 por 60 milímetros para espalhar dois microlitros de microesferas de sílica sobre a superfície de um lamínula de 24 por 32 milímetros. Usando dois pedaços de fita adesiva dupla face, fixe o lamínula de 24 por 32 milímetros em uma lâmina de microscópio para criar uma câmara de fluxo.

Encha a célula de fluxo com 50 milimolares de tampão fosfato e sela-a com graxa de silicone. Um microesfera de sílica na microscopia de campo claro com aproximadamente 2000 vezes de aumento. O campo de visão deve ser de aproximadamente sete por cinco micrômetros, adquirido em 768 por 576 pixels, de modo que a imagem da microesfera tenha um diâmetro de aproximadamente 190 pixels. Compense as derivas térmicas com um software de realimentação que calcula a posição XY a partir do centro da imagem e a posição Z a partir dos anéis de difração, corrigindo assim as derivações.

Movendo um estágio piezo com precisão de nanômetro ou melhor, sobreponha o centro do armadilhamento esquerdo ao centro da esfera e meça o ruído de posição e seu desvio padrão a partir do fotodiodo de quadrante ou QDP. Repita a medição para o armadilhamento direito. O desvio padrão do ruído de posição deve estar dentro de alguns nanômetros para permitir a localização precisa de proteínas de ligação ao DNA ao montar a câmara de fluxo.

Uma ponta de diamante é usada inicialmente para perfurar orifícios de um milímetro de diâmetro em uma lâmina de microscópio de 76 por 76 por um milímetro. Isso cria quatro entradas e uma saída, permitindo até quatro fluxos paralelos de tampão.

Cada um contendo um dos diferentes componentes necessários para o experimento: esferas, DNA, proteína marcada com fluoróforo e tampão de imagem. Limpe a lâmina de microscópio com etanol e posicione no centro o orifício com o anel O inserido e o anel adesivo na lâmina ao redor dos orifícios de acesso. É essencial usar luvas durante este passo para evitar impressões digitais, que poderiam interferir no processo de colagem.

Com a ajuda de uma segunda lâmina, prenda os nanoconectores à lâmina e coloque-a em uma estufa pré-aquecida a 180 graus Celsius por uma hora para permitir a fixação completa. Enquanto isso, desenhe o padrão do contorno da célula de fluxo em uma folha de papel. O canal deve ter aproximadamente três milímetros de largura e corresponder às posições totais na lâmina do microscópio.

Coloque o desenho sobre duas peças de perfil e, com um bisturi, faça cortes precisos e contínuos ao longo do contorno desenhado. Remova quaisquer protuberâncias formadas, descarte a camada inferior de parfum, que é utilizada apenas para garantir um suporte limpo. Em seguida, posicione a lâmina de microscópio contendo os nanoportos fixados virada para baixo no suporte metálico.

Alinhe cuidadosamente o contorno da câmara de paraform com os orifícios, certificando-se de que o para não extrude pelas entradas e saída da tampa da câmara; cubra com uma lamínula de microscópio limpa e remova cuidadosamente o excesso de para ao redor da câmara. Coloque dois blocos de aquecimento previamente aquecidos a 120 graus Celsius sobre a célula de fluxo para aplicar pressão homogênea sobre ela. Deixe a película de para derreter por aproximadamente 25 minutos.

O próximo passo é preparar o reservatório de pressão e os recipientes de tampão. O reservatório de pressão é feito de plexiglass e permite acomodar até seis recipientes de tampão. Primeiro, conecte as válvulas de fechamento na saída dos recipientes de tampão para ligar o fluxo de tampão com a alavanca da válvula na posição vertical ou desligar na posição girada no sentido horário.

Durante os experimentos, fixe a câmara de fluxo na platina do microscópio. Em seguida, conecte as válvulas de fechamento através da tubulação de poli éter, éter cetona ou tubulação peak, e as conexões sem flange às entradas da câmara de fluxo. A tubulação peak possui um diâmetro interno de aproximadamente 150 micrômetros; cerca de três centímetros de tubulação de politetrafluoroetileno com diâmetro interno de aproximadamente 500 micrômetros são utilizados como ligação entre a tubulação peak e os conjuntos de nanoportas da câmara de fluxo.

Isso é essencial para reduzir o fluxo do tampão na entrada da câmara, evitando a quebra da célula de fluxo ou o desprendimento do nanoporto do vidro. O uso de tubos com diâmetro interno grande, por outro lado, exigiria grandes volumes de amostras biológicas. Conecte a saída da câmara de fluxo a um tubo Falcon aberto, à pressão atmosférica.

Este tubo serve como descarte para o tampão que escoa da câmara de fluxo. Para iniciar este procedimento, adicione um mililitro do tampão A a cada um dos recipientes de tampão e aplique 200 milibares de pressão para lavar os tubos de conexão e a célula de fluxo. Um sistema de controle de pressão é capaz disso.

Por fim, ajuste a pressão do ar no interior do reservatório de pressão. Verifique a presença de bolhas de ar, que podem interromper a fluidez do fluxo. Uma leve batida no tubo de saída ajudará a remover quaisquer bolhas remanescentes, reduza a pressão para 20 milibares e verifique se todos os canais e tubos estão livres de bolhas de ar e se o tampão flui com velocidades semelhantes em todos os canais.

Prepare as amostras para um volume final de 300 microlitros. Este experimento utiliza microesferas de poliestireno revestidas com strept, DNA linear biotinilado em ambas as extremidades que contém sequências-alvo específicas para ligação do repressor de lactose e proteína fluorescentemente marcada do repressor de lactose. Adicione cada amostra a um dos compartimentos da seringa na seguinte ordem: microesferas no primeiro canal, DNA no segundo, tampão de imagem no terceiro e proteína marcada no quarto canal.

Ative o fluxo em 20 milibares e abra as válvulas de bloqueio para permitir que as amostras entrem no canal de fluxo. Isso é facilmente detectável no canal de microesferas. Enquanto imagina o primeiro canal sob iluminação de campo claro, ligue as duas pinças ópticas e capture uma microesfera de poliestireno em cada armadilha.

Mova-se rapidamente para o segundo canal para evitar que as outras microesferas caiam nas armadilhas. Observe que a chegada no canal de DNA é facilmente perceptível pelo fim do fluxo de microesferas. Usando um desviador óptico AO ou um movimento OD, mova uma microesfera presa de volta e para frente na proximidade da outra microesfera, permitindo a ligação do DNA estendido pelo fluxo entre as duas microesferas aprisionadas opticalmente.

Quando um dumbbell de DNA é formado, a esfera estática começa a seguir o movimento da esfera que é movida ativamente para frente e para trás pela armadilha. Mova-se rapidamente para o canal de tampão e desligue o fluxo de tampão. Realize uma análise de curva de força-extensão para verificar a presença de uma única molécula de DNA.

Isso é realizado separando as duas esferas enquanto se mede a tensão do DNA. Uma vez obtido um único dumbbell de DNA, ligue novamente o fluxo e mova o dumbbell para o canal de proteína. Alterne para microscopia de fluorescência de campo amplo para monitorar a interação da proteína repessora da lactose marcada com o DNA, desligue o fluxo e inicie a aquisição.

Este método permite a detecção de moléculas individuais de repressor de lactose ou lac eye interagindo com uma molécula de DNA esticada. Neste gráfico CH representativo, uma molécula única de lac eye difunde-se ao longo de sequências de DNA não específicas, enquanto outra molécula de lac eye está ligada especificamente a um operador localizado no centro da molécula de DNA. Este gráfico mostra a posição das duas moléculas de lac eye ao longo da direção que conecta os centros das duas armadilhas.

Em função do tempo, as posições das moléculas foram determinadas pelo algoritmo de centro de simetria radial mostrado aqui, que apresenta um gráfico do deslocamento médio quadrático, ou MSD, versus o tempo para uma única molécula de lac eye difundindo ao longo de uma molécula de DNA esticada. O coeficiente de difusão da proteína pode ser facilmente obtido por meio de regressão linear dos dados. A combinação de técnicas de manipulação e de imagem constitui um método poderoso, permitindo controle mecânico sobre um único polímero biológico, como DNA-RNA ou um filamento do citoesqueleto, e a localização simultânea de moléculas individuais de proteína interagindo com o próprio polímero.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que a combinação de técnicas de manipulação e imagem em nível de molécula única exige um planejamento cuidadoso da montagem experimental para garantir a estabilidade em nível de nanômetro do polímero suspenso. Por outro lado, é necessário um adequado planejamento da sonda biológica para assegurar separação espacial entre o laser de aprisionamento G e a sonda fluorescente. Consulte o texto do protocolo suplementar para obter detalhes.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar a molécula de DNA entre os dois batimentos ópticos rápidos, referentes à montagem deste construto. Os melhores resultados são obtidos com a câmara de fluxo multicanal, para a qual fornecemos uma descrição detalhada. Também indicamos como otimizar o fluxo do tampão e remover as bolhas de ar, as quais, caso contrário, poderiam comprometer seus experimentos.

No protocolo combinado de texto, você pode encontrar os protocolos para marcar o DNA com bioTE, o que é necessário para a montagem com as microesferas revestidas de estreptavidina, bem como os protocolos para marcar a proteína. Finalmente, ilustramos as operações passo a passo para quantificar a ligação e a difusão de uma única proteína repressora de lactose em uma molécula de DNA esticada.