Determinação da atividade locomotora espontânea em
10 de abril de 2014
Drosophila melanogaster são úteis no estudo de manipulações genéticas ou ambientais que afetam comportamentos, como a atividade locomotora espontânea. Aqui nós descrevemos um protocolo que utiliza monitores com raios infravermelhos e software de análise de dados para quantificar a atividade locomotora espontânea.
O objetivo geral deste procedimento é quantificar a atividade locomotora espontânea de moscas-das-frutas. Isso é realizado primeiramente coletando e envelhecendo as moscas experimentais. O segundo passo é configurar monitores de população em um incubador com temperatura controlada e baixar o software apropriado.
Em seguida, as moscas são transferidas para tubos de vidro e então colocadas dentro de monitores de população, onde os monitores de atividade são operados. O passo final é analisar os dados. Em última instância, os monitores de população são utilizados para mostrar diferenças na atividade física espontânea das moscas.
A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o eixo geográfico negativo, é que ela permite o registro contínuo, simples, confiável e objetivo da atividade física espontânea de múltiplas populações de moscas. Este método pode nos ajudar a determinar como diferentes manipulações afetam as moscas. A atividade física espontânea demonstrando o procedimento será Suzanne Kowski, uma assistente de laboratório de um laboratório. Para começar, prepare a dieta seguindo as etapas listadas no protocolo textual complementar e deixe esfriar com mistura constante em uma placa aquecedora.
Aliquote cinco mililitros de alimento em cada frasco de vidro estreito, certificando-se de que a quantidade de alimento esteja abaixo do anel mais baixo da população. Monitore após o alimento esfriar até a temperatura ambiente. Tampe os frascos com tampas de esponja e mantenha-os a quatro graus Celsius por até duas semanas.
Aqueça os frascos à temperatura ambiente antes do uso. Em seguida, cultive moscas Canton S em frascos de plástico com alimento padrão de laboratório. Mantenha os frascos em uma câmara controlada por temperatura e umidade a 25 graus Celsius, em ciclo de 12 horas claro-escuro.
Retire as moscas adultas dos frascos pela manhã. Em seguida, separe as moscas recém-emergidas por sexo em um suporte de dióxido de carbono dentro de oito horas após a eclosão, para garantir que as fêmeas permaneçam virgens. Prepare 10 frascos de moscas parentais colocando machos e fêmeas virgens com idade entre cinco e dez dias.
Insetos em um frasco padrão com alimento e vários grãos de levedura. Mantenha os insetos em um incubador a 25 graus Celsius com um ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro durante dois dias. Transfira os insetos para um novo frasco de plástico a cada dois dias e mantenha os frascos com os ovos resultantes em um incubador a 25 graus Celsius.
Em seguida, retire e descarte as moscas que emergiram durante o primeiro dia e devolva os frascos ao incubador para coletar uma população mais sincronizada de moscas no segundo dia. Depois, sobre uma placa de dióxido de carbono, colete rapidamente 25 moscas macho e 25 fêmeas por frasco com uma colher metálica no período de 24 horas. Anote o dia da ELO no frasco.
Monte pelo menos cinco frascos replicados para cada grupo experimental e controle. Mantenha os frascos em câmaras ambientais com temperatura controlada a 25 graus Celsius e ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro.
Passe as moscas para um novo tubo plástico a cada dois dias durante 10 dias. Usando um funil, coloque os monitores de população em um incubador com temperatura controlada. Em seguida, conecte cada monitor a uma unidade de interface de fonte de alimentação, ou PSIU, por meio de um divisor de cinco vias, utilizando um cabo telefônico de quatro fios.
Em seguida, conecte o cabo telefônico ao PSIU. Conecte o PSIU a uma tomada de energia de 100 a 240 volts e insira o conector de saída da fonte de alimentação em uma das entradas correspondentes do PSIU. Em seguida, faça o download do software USB utilizado pelo PSIU para criar um link de dados entre o programa do computador e o PSIU e os monitores de atividade.
Inicie o programa. Em seguida, nas preferências, escolha a porta serial PSIU para Macintosh.
Em seguida, selecione o intervalo de leitura. Depois, selecione os monitores pelo número exclusivo do fabricante. Selecione a faixa do monitor que corresponde aos números atribuídos aos monitores.
Certifique-se de que todos os monitores estão corretamente conectados verificando a luz verde. Uma luz vermelha indica que a conexão foi perdida. Uma caixa preta indica que o sistema está desligado ou que a conexão USB não foi adequadamente realizada.
Sequencie moscas macho e fêmea da mesma idade. Em uma placa de dióxido de carbono, coloque 10 moscas macho e 10 fêmeas em recipientes separados à temperatura ambiente. Tubos de vidro.
Utilize pelo menos três frascos para cada linhagem experimental e controle, e para cada sexo de moscas, mantenha os frascos deitados até que as moscas se recuperem do dióxido de carbono para garantir que não fiquem presas no alimento. Deixe-as por duas horas em temperatura ambiente para se recuperarem do óxido de carbono. Em seguida, coloque os frascos dentro da população.
Monitores acomodados nas incubadoras. Transfira as moscas após três ou quatro dias para novos frascos para evitar o ressecamento do alimento. Ao final do experimento, escaneie os dados para eliminar leituras duplicadas e garantir que os registros estejam completos.
Usando a varredura de arquivo 110 x, selecione o intervalo para coleta de dados e descarte os dados coletados nas primeiras 24 horas no período de tempo selecionado. O programa enviará a contagem total atual para cada monitor ao computador e reiniciará a contagem a partir de zero. Em seguida, escolha um nome para o experimento e copie os arquivos da pasta de dados do computador para salvar os dados.
Inicie a análise dos dados copiando cuidadosamente os dados coletados nos arquivos de texto para colunas de planilhas do Excel. Em seguida, calcule a atividade total dentro de um período desejado para cada monitor, representando a soma da atividade coletada em três alturas diferentes dos feixes de infravermelho. Por fim, determine a atividade locomotora média e o desvio padrão entre os três monitores, que representam três repetições biológicas, utilizando o teste t de Student bicaudal.
A atividade locomotora espontânea em drosófila depende do sexo da mosca e do ciclo claro-escuro. Como demonstrado neste gráfico da atividade média de moscas macho e fêmea, a seta marca a transição de claro para escuro. Onde é observada uma diminuição na atividade, a atividade total de moscas macho com 20 dias de idade aumenta quando as moscas recebem metade da quantidade de alimento padrão em uma dieta com baixa caloria, em comparação com a diminuição da atividade de moscas em uma dieta com alta caloria.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a atividade física espontânea de drosófilas. Este método é útil para determinar como diferentes genéticas ou manipulações ambientais afetam a atividade das moscas.
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Visão Geral
Este protocolo descreve um método para quantificar a atividade locomotora espontânea em Drosophila melanogaster. Ao utilizar monitores de feixe de infravermelho e software de análise de dados, os pesquisadores podem medir efetivamente a atividade física de moscas-das-frutas em condições controladas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Comportamental
- Genética
Antecedentes
- Drosophila melanogaster atua como organismo modelo para o estudo do comportamento.
- A compreensão da atividade locomotora pode fornecer informações sobre influências genéticas e ambientais.
- A tecnologia de monitoramento por infravermelho permite o rastreamento preciso da atividade.
- A análise de dados é fundamental para interpretar os padrões locomotores.
Objetivo do Estudo
- Quantificar a atividade locomotora espontânea em moscas-das-frutas.
- Avaliar o impacto de fatores genéticos e ambientais sobre o comportamento.
- Fornecer um protocolo padronizado para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Coleta e envelhecimento de Drosophila melanogaster experimental.
- Montagem de monitores de população em um incubador com controle de temperatura.
- Transferência das moscas para frascos de vidro para monitoramento.
- Execução dos monitores de atividade e análise dos dados coletados.
Resultados Principais
- Os monitores populacionais quantificam efetivamente as diferenças na atividade locomotora.
- A análise de dados revela informações sobre os níveis de atividade física espontânea.
- Os resultados podem orientar estudos futuros sobre comportamento e genética.
- O protocolo é reprodutível e aplicável a diversas configurações experimentais.
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem confiável para o estudo da atividade locomotora em moscas-das-frutas.
- Compreender esses comportamentos pode aprimorar o conhecimento sobre interações genéticas e ambientais.
- O protocolo pode ser adaptado para diferentes necessidades de pesquisa em neurociência e biologia.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação da atividade locomotora espontânea em Drosophila melanogaster fornece uma leitura escalonável e objetiva para avaliar influências genéticas e ambientais sobre o comportamento, apoiando a validação inicial de alvos na pesquisa de neurociência e doenças metabólicas. Este método permite a redução de riscos mecanicistas ao associar resultados fenotípicos à modulação de vias, oferecendo confiança preditiva nos fluxos de trabalho de identificação de compostos promissores. Sua reprodutibilidade e capacidade de monitoramento contínuo o posicionam como uma plataforma de biomarcadores translacionais para validação de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a medição da atividade física espontânea como indicador funcional da integridade das vias neurais e metabólicas.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos por meio da quantificação objetiva e contínua do comportamento locomotor em diferentes condições genéticas e ambientais.
- Valor Preditivo: Facilita a triagem de portfólios ao identificar compostos ou manipulações genéticas que alteram significativamente os padrões de atividade, indicando o engajamento do alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente, estabelecendo perfis de atividade locomotora de referência sob condições controladas.
- Reprodutibilidade: Fornece saídas padronizadas e quantitativas por meio de monitoramento com feixes de infravermelho, permitindo avaliação confiável de compostos entre réplicas.
- Escalabilidade: Permite monitoramento paralelo em múltiplos frascos para avaliação de alto rendimento de intervenções farmacológicas ou genéticas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela estados de doenças humanas por meio da avaliação de alterações locomotoras em manipulações genéticas que imitam distúrbios neurológicos ou metabólicos.
- Continuidade Translacional: Conecta fenótipos comportamentais da fase de descoberta à validação pré-clínica por meio de métricas de atividade consistentes e quantificáveis.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Orienta critérios de avanço ao correlacionar alterações na atividade com a modulação do alvo, reduzindo falsos positivos na otimização de compostos líderes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, fornecendo um desfecho comportamental que conecta a compreensão mecanicista ao resultado fenotípico.
- Biologia da Descoberta: Apoia a clarificação de vias e a validação de alvos ao quantificar como alterações genéticas ou induzidas por fármacos afetam a atividade locomotora espontânea.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio do rastreamento contínuo e multiparamétrico da atividade em populações de moscas.
- Análises: Gera medidas quantitativas de variáveis dependentes (atividade total, desvio padrão) que permitem a comparação estatística de condições experimentais utilizando análise por teste t.
- Pesquisa Translacional: Alinha-se ao desenvolvimento de biomarcadores ao associar alterações na atividade locomotora a perturbações genéticas ou metabólicas subjacentes relevantes para modelos de doenças humanas.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma de triagem comportamental reutilizável, aplicável em múltiplos projetos nas áreas de neurociência, metabolismo e pesquisa do envelhecimento.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da medição direta da atividade física espontânea como um ancoradouro fenotípico.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio de monitoramento infravermelho calibrado e fluxos de trabalho definidos para análise de dados.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer dados comportamentais precoces e quantificáveis que reduzem a perda biológica em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao identificar intervenções com efeitos significativos e reprodutíveis na atividade locomotora.
Considerações de Implementação
- Requer experiência no manejo de Drosophila, configuração de ensaios comportamentais e sistemas de monitoramento por infravermelho.
- Depende de monitores de população, interface PSIU, incubadoras com controle de temperatura e software de aquisição de dados.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de envelhecimento de moscas, separação por sexo e preparo de frascos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes origens genéticas, condições dietéticas e tratamentos farmacológicos.
- Inclui limitações práticas, como o ressecamento da dieta ao longo do tempo e a necessidade de transferências periódicas dos frascos para manter a integridade dos dados.
