Name: Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Aprenda o procedimento de enxerto de mucosa heterotópica para entrega direta de fármacos ao cérebro em ratos. Este método utiliza enxertos de septo nasal para superar a barreira hematoencefálica em aplicações terapêuticas.

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Este estudo foi financiado pela Fundação Mcihael J. Fox para Pesquisa 2011 Innovations Resposta Rápida de Parkinson Awards Program. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Antes da cirurgia certificar-se de todos os procedimentos a serem feitas são aprovados pelo IACUC e quaisquer autoridades éticas ou legais adicionais e utilizar práticas de tratamento de animais sem crueldade. Isso inclui o uso de cirurgia condições estéreis, anestesiar o mouse usando o método IACUC aprovado, lubrificando ratos olhos com pomada veterinário durante a cirurgia, e prestação de cuidados pós-cirúrgico. Não prossiga com a cirurgia se houver qualquer questão de saber se os aspectos do processo são aprovados. Todos os procedimentos aqui realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional Universidade Animal Care e Use o Boston. 1. Preparação de Animais e suprimentos cirúrgicos <ol><li> Autoclave todo instrumento cirúrgico que será usado durante a cirurgia. </li><li> Certifique-se de todas as técnicas que estão a ser realizadas são aprovados pelas agências reguladoras de animais. </li></ol> 2. Colheita da mucosa Graft <ol><li> Escolheu um rato geneticamente idênticos da mesma idade comoo mouse experimental e sacrificá-lo em um método IACUC aprovado (aqui: asfixia isoflurano seguido por deslocamento cervical). </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica, retire a pele ao redor da região nasal de cabeça de rato expondo o crânio. </li><li> Com um martelo pneumático, marca com três linhas de dois dos quais lateralmente ladeiam a região nasal e um terceiro em linha com os olhos que conecta as duas linhas perpendiculares. </li><li> Broca para baixo ventralmente, a fim de separar o septo nasal a partir do tecido circundante. Um caminho mais largo, evitará danos à membrana mucosa no entanto, também vai tornar mais difícil para isolar a membrana. Um corte estreito mais perto da linha média é recomendado. </li><li> Use a tesoura para cortar o septo livre de qualquer tecido aderido a ele e armazená-lo em uma solução salina estéril. Neste momento, o enxerto pode ser limpa para remover qualquer tecido ligado. O ideal é ter membranas mucosas intactas exposta em ambos os lados da cartilagem do septo. Um grré pode fornecer membrana para dois ratinhos desde que a área da superfície da membrana é suficiente para cobrir os locais craniotomia. Recomenda-se que o enxerto é utilizada tão depressa quanto possível e o investigador prossegue para o passo 3, logo que o enxerto é isolado. </li></ol> 3. Implantação cirúrgica de mucosa Graft <ol><li> Usando procedimentos padrão, assépticas murino cirúrgicos, anestesiar e montar um mouse no quadro estereológica. Use cerca de 2% de isoflurano em oxigênio puro através de um aparelho de anestesia de roedores. </li><li> Imobilizar o mouse em um aparelho estereotáxico com barras de ouvido e um suporte de nariz. Aplicar pomada oftálmica para os olhos e esfregue o couro cabeludo com betadine e álcool 75% por três rodadas. Usando qualquer uma tesoura ou um aparador de cabelo, retire a pele na cabeça. Exponha o crânio com uma lâmina de barbear e nível da cabeça. Realizar uma craniotomia sobre o local do cérebro que vai ser administrado. Por exemplo, quando visando o striatum cortar 1,25 milímetrosdiâmetro do furo circular no crânio (centrado no AP: 1.00 mm; ML: 0,88 mm) usando um martelo pneumático. Molhar a área perfurada com solução salina estéril e utilizar uma lâmina de barbear para remover o crânio. </li><li> Remova cuidadosamente a dura usando a ponta de uma agulha. Além disso, isto pode ser conseguido pela aplicação de uma quantidade mínima de adesivo para o tecido da superfície da dura-máter húmido. Uma vez que esta camada tenha endurecido, com um movimento lateral da ponta da lâmina de barbear pode ser usado para remover a membrana. </li><li> Colocar a membrana mucosa acima da superfície do cérebro, tendo cuidado para manter o lado epitelial virada para fora da ferida. Isto é melhor realizado por transferência de todo o septo sobre a superfície do crânio adjacente ao local da craniotomia com pinças. Com a ponta de um par de tesouras cirúrgicas, puxar a membrana fora da cartilagem e para a superfície do crânio e no cérebro. Não deixe que a membrana secar ou tocá-lo com qualquer material absorvente. O enxerto deve sobrepor-se generosamente todas as extremidades ósseas da craniotomia site. </li><li> Cubra o enxerto com um pedaço estéril de borracha nitrílica. Isto actua de modo a evitar a aderência da pele no enxerto durante a cicatrização. O nitrilo precisa de ser grande o suficiente para cobrir toda a membrana mucosa. Apare membrana excessiva, se necessário. Evite qualquer movimento do nitrilo, uma vez que tenha entrado em contato com o enxerto. </li><li> Feche a pele com um 5-0 sutura estéril correndo e deixar o mouse recuperar para 3-7 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. Tome cuidado para não perturbar a barreira nitrílica ou o enxerto gengival durante o fechamento da pele. </li></ol> 4. Administração da Solução de Dosagem <ol><li> Depois de garantir o rato anestesiado no quadro estereotáxico, corte a sutura com uma tesoura e retire o excesso de pele ao redor do crânio. </li><li> Retirar a barreira nitrilo e limpar a superfície do crânio. Use soro fisiológico e cotonetes estéreis para limpar a área até que o enxerto é visível. Pode ser necessário cortar o enxerto com uma lâmina de barbear se tem crescido muito mais do que a desired área de superfície. </li><li> Se a experiência será mais longo do que alguns dias, é sábio para implantar pelo menos dois parafusos crânio para reforçar o implante cabeça. </li><li> Colocar o bem acima do enxerto, de modo que as extremidades estão em contacto com o crânio. Aplique cola de cianoacrilato na junção entre o bem eo crânio. Encha o bem com solução salina estéril e verifique se não há vazamentos. Wells são feitos de agulhas de corte de seringa. </li><li> Aplicar cimento ósseo no crânio para garantir o bem no lugar. </li><li> Remover a solução salina a partir do poço com uma pipeta. Lavar as bem várias vezes para verificar que o adesivo não vazou dentro Adicionar a solução desejada; neste caso, 50 ul de dextrano fluorescente é usado. Espera-se que os compostos solúveis em água de uma polaridade semelhante que se comportam da mesma como dextrano. Entrega de compostos hidrofóbicos ou suspensões não foi explorada com este método. </li><li> Tapar o topo do poço, usando um pedaço circular de nitrilo fixada aotopo usando adesivo de cianoacrilato. Certifique-se de que o adesivo não entra em contacto com o conteúdo também. </li></ol> 5. Análise de entrega transmucosa <ol><li> Depois da quantidade desejada de tempo tiver passado, anestesiar o rato e trocar o conteúdo do poço com uma solução de corante azul de Evan. Este corante é usado para verificar que o enxerto estava intacta. </li><li> Após 30 min, anestesiar o rato fortemente, remover a solução de corante, e a eutanásia através de decapitação. </li><li> Manualmente remover o implante e retire o cérebro usando uma tesoura cirúrgica. Tenha cuidado para manter o enxerto no lugar. </li><li> Uma vez removido, flash congelar o cérebro em solução de isobutano arrefecido em um banho de gelo seco. </li><li> Incorporar o cérebro em solução (OCT) e fatia de 50 mm Temperatura ideal de corte. </li><li> Coloque as fatias desejadas diretamente em uma lâmina de microscópio. </li><li> Imagem da fatia utilizando um microscópio de fluorescência, logo que a solução tenha secado outubro. </li></ol>

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</ol>

Benjamin S. Bleier MD é inventor liderança de métodos provisórias de administração de medicamentos para o sistema nervoso central de cobertura de patentes.

A etapa mais difícil do processo aqui descrito é o sucesso da transferência de uma membrana mucosa de tamanho adequado para a superfície do cérebro. Este passo é feita significativamente mais fácil se o septo nasal colhido é suficientemente grande e bem limpos. Se a porção ventral do septo é truncado, um novo enxerto deve ser obtida. O ângulo de perfuração deve ser perpendicular à cabeça de rato para assegurar que a membrana da mucosa não é danificado pela broca. Se um caminho mais largo do que a perfuração é feita reco...

O tratamento da doença neurológica e psiquiátrica é severamente impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), que impede que mais de 95% de todos os potenciais agentes farmacêuticos de atingir o sistema nervoso central 1-3. Por exemplo, factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) foi demonstrado ser eficaz no tratamento da doença de Parkinson, quando injectado directamente no cérebro, no entanto, não é eficaz quando entregues sistemicamente porque não pode penetrar a BBB 4-6. Numerosos abordado foram desenvolvidas para tentar ultrapassar este problema. Melhoria na administração sistémica de neurotheraputics foi demonstrada usando conjugados de medicamentos contendo anticorpos selectivos para as proteínas de transporte localizados no endotélio capilar cerebral; no entanto, este método não tem sido mostrado para ser aplicável a uma ampla gama de produtos farmacêuticos 7,8. Além disso, a abertura osmótica da BHE foi usado clínicaaliado, no entanto, este método sofre de dosagem sistémica de fármacos, em oposição a uma distribuição mais directa para a região do cérebro de interesse 9. Esforço considerável tem sido posta em otimização de entrega transnasal na esperança de atacar directamente o cérebro 10-12. Embora tenha sido alcançado algum sucesso, resultados conclusivos só foram obtidos para as drogas que possuem receptores endógenos, como a insulina 13,14. Além disso, o mecanismo de entrega transnasal tem sido controversa com indícios de entrada indireta para o cérebro por meio de captação de neurônio olfativo ou através da corrente sanguínea 11. A entrega directa, transcraniana utilizando cateteres implantados tem sido conseguida, no entanto este processo é altamente invasivo e associada a numerosas complicações 15,16. Até à data, não existe um método geral, minimamente invasiva para entregar os compostos de elevado peso molecular para o cérebro. Aqui apresentada é um procedimento cirúrgico murinoque cria uma interface semipermeável com o cérebro. Isto é conseguido por um enxertando explante membrana mucosa 17 ao longo de um defeito craniotomia cirúrgica em um rato. Usando este procedimento, tem sido demonstrado que os compostos solúveis de até 500 kDa pode ser entregue no sistema nervoso central (directamente no parênquima cerebral, assim como em fluido cerebrospinal), em ambos tempo e um peso molecular dependente da forma 18. Este método de contornar o BBB é um modelo para reparos de defeitos da base do crânio em seres humanos, que utiliza enxertos vascularizados da mucosa para reparar buracos no crânio após a cirurgia endoscópica transnasal 19,20.

<table><tbody><tr><td>Ratos</td><td>Taconic</td><td>C57BL / 6</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Estudante de Saúde</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tesoura fina</td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Broca pneumática</td><td>MTI Dental</td><td>333-CB</td><td></td></tr><tr><td>Broca Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ferramentas de Ciências Finas</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Injeção de cloreto de sódio a 0,9% USP</td><td>Abbott Laboratories</td><td>4925</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno</td><td>Fisher</td><td>08-757-12</td><td>para armazenamento temporário de enxerto</td></tr><tr><td>Esterilizador de esferas</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Oxigênio / Isoflurano</td><td>SurgiVet</td><td>V720100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Controle de Temperatura</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para animais pequenos</td><td>KOPF</td><td>Modelo 940</td><td></td></tr><tr><td>Pomada</td><td></td><td></td><td></td>para os olhos</tr><tr><td>Barbeador</td><td></td><td></td><td></td>elétrico</tr><tr><td>Aplicadores com ponta de algodão</td><td>Fisher</td><td>23-400-106</td><td></td></tr><tr><td>7,5% Iodovidona</td><td></td><td></td><td>Esfoliante cirúrgico Betadine</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica Cabo de bisturi de</td><td>pena</td> inoxidável <td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>- #3</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>3% de peróxido de hidrogênio</td><td>para limpar o crânio</td>Adesivo de <td></td><td></td></tr><tr><td>tecido Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305176</td><td>ponta da agulha cortada e usada também</td></tr><tr><td>Seringas</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Denville Scientific Inc</td><td>G4162</td><td>para fechamento de poço e proteção do enxerto</td></tr><tr><td>5-0 Fio</td><td></td><td></td><td></td>de sutura de nylon</tr><tr><td>Estudante Halsey porta-agulhas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo</td><td></td><td></td> de cianoacrilato <td>disponível comercialmente super cola</td></tr><tr><td>Kit de cimento dental, 1 lb, rosa opaco</td><td>Stoelting</td><td>51458</td><td></td></tr><tr><td>Isobutano (2-metilbutano)</td> <td>Aldrich</td><td>M32631</td><td>para banho de gelo seco</td></tr><tr><td>Gelo</td><td></td><td></td><td></td> seco</tr></tbody></table>

heterotópico mucosa enxertando procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

Heterotopic Mucosal Engrafting Procedure for Direct Drug Delivery to the Brain in Mice

A entrega de agentes terapêuticos para o cérebro é impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), o que restringe a passagem de compostos polares e de elevado peso molecular a partir da corrente sanguínea e no tecido cerebral. Algum sucesso entrega direta em seres humanos tem sido alcançado através de implantação de cateteres transcraniana; no entanto, este método é altamente invasivo e associado a várias complicações. Uma alternativa menos invasiva seria a dose do cérebro através de um implantado cirurgicamente, membrana semi-permeável, tal como a mucosa nasal, que é usado para reparar defeitos da base do crânio seguinte cirurgia endoscópica tumor remoção em humanos. Transferência da droga que esta membrana seria efectivamente desviar o BBB e difundem directamente no cérebro e no fluido cerebrospinal. Inspirado por essa abordagem, uma abordagem cirúrgica em ratos foi desenvolvido que utiliza uma membrana mucosa septal doador enxertada sobre um defeito extracraniana BBB cirúrgico. Este modelo tem sido demonstrado eficazpermitir a passagem de compostos de alto peso molecular para o cérebro. Desde inúmeros candidatos a fármacos são incapazes de atravessar a certificação, este modelo é valiosa para a realização de testes pré-clínicos de novas terapias para doenças neurológicas e psiquiátricas.

A obtenção de um grande o suficiente explante septo nasal é fundamental para as etapas subseqüentes. Isto pode ser conseguido através da perfuração no local no crânio do rato doador mostrada na Figura 1a. Corte ao longo deste caminho irá produzir um explante de tamanho suficiente, como mostrado na Figura 1b. Se a profundidade da perfuração não é profundo o suficiente, o enxerto será truncado e será difícil obter uma grande membrana suficiente para cobrir a superfície do cérebro. Perfura...

Um modelo do rato de reconstrução endoscópica da base do crânio humano foi desenvolvido que cria uma interface semipermeável entre o cérebro eo nariz com enxertos mucosas nasais. Este método permite que os investigadores a estudar a libertação no sistema nervoso central de terapêutica de elevado peso molecular, que são de outro modo excluídos pela barreira sangue-cérebro, quando administrado sistemicamente.

Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

Delivery of therapeutics into the brain is impeded by the presence of the blood-brain barrier (BBB) which restricts the passage of polar and high ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar com sucesso uma cirurgia de enxerto heterotrópico da mucosa para a entrega de compostos no cérebro. Isso é alcançado primeiramente isolando um enxerto do septo nasal de um camundongo doador. O segundo passo é transplantar a membrana mucosa do septo para uma lesão craniana em um camundongo receptor.Em seguida, o cérebro é administrado com o fármaco através do enxerto por um período desejado. O passo final consiste em analisar a consequência do procedimento de administração no cérebro utilizando fluorescência, microscopia ou imunohistoquímica para demonstrar a difusão dos compostos administrados no parênquima cerebral. A utilização de fármacos neurológicos é altamente limitada devido à presença da barreira hematoencefálica.Desenvolvemos uma técnica baseada na cirurgia endoscópica transnasal humana em que podemos enxertar mucosa em um orifício na barreira hematoencefálica e utilizar isso como um conduto para a administração direta de medicamentos ao cérebro. Aqui, Richie Komen, um pesquisador pós-doutorando no Laboratório de Han na Universidade de Boston, vai demonstrar esta técnica em um modelo de camundongo. Inicie este procedimento rem

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Fonte: Zamboni, M., et al., Indução de modificação de células leptomeníngeas via injeção intracisternal. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demonstra o procedimento de administração de um medicamento indutor na cisterna magna de um camundongo anestesiado. A injeção induz seletivamente a expressão de marcadores fluorescentes em células da superfície cerebral acessíveis via líquido cefalorraquidiano, confirmado por imagens de fluorescência.

Entrega de medicamentos direcionados em um modelo de camundongo via injeção de cisterna magna

Neste vídeo, descrevemos o procedimento para entregar células tumorais derivadas de humanos na cisterna magna do cérebro de um camundongo. O modelo de camundongo ortotópico pode ser usado para estudar a disseminação metastática do câncer para as meninges cranianas.

Injeção Cirúrgica de Cisterna Magna: Um Método para Administração de Células Tumorais Diretamente no Sistema Nervoso Central do Modelo Murino

Este vídeo demonstra a injeção intracerebroventricular mediada por ommaya em um modelo de camundongo. O método permite a entrega localizada de potenciais candidatos a medicamentos e evita a barreira hematoencefálica.

Injeção intracerebroventricular em camundongo: um método de administração direta de medicamentos mediado por Ommaya para administrar medicamentos aos ventrículos cerebrais do cérebro de camundongos

Este vídeo apresenta um procedimento para implante de cânula intracraniana em um modelo de camundongo com tumor cerebral, para facilitar a administração de um agente imunoterapêutico. A entrega de células T receptoras de antígeno quimérico específicas do glipicano-2 no microambiente tumoral desencadeia a ativação das células T, resultando em lise tumoral e regressão tumoral.

Implante de cânula intracraniana em camundongo para administrar agentes terapêuticos a tumores cerebrais

Fonte: Leda, A. R., et al. Técnica de infusão de microcirurgia de camundongo para entrega de substância direcionada no SNC através da artéria carótida interna. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra um procedimento microcirúrgico projetado para facilitar a infusão direcionada de uma substância de teste no cérebro através da artéria carótida interna (ACI). O procedimento envolve sutura precisa e manipulação vascular para restringir temporariamente o fluxo sanguíneo, garantindo uma entrega...

Entrega de substâncias direcionadas ao cérebro do camundongo por meio de infusão na artéria carótida interna

O presente protocolo descreve uma técnica de infusão de microcirurgia de camundongo, que efetivamente fornece substâncias diretamente no cérebro através da artéria carótida interna.

Técnica do mouse Microcirurgia de infusão para distribuição de substâncias alvejado no SNC via Artéria carótida interna

As células estaminais são portadores terapêuticos promissores para tratar tumores cerebrais devido ao seu tropismo intrínseco de tumor. A entrega de células estaminais intranasais não invasivas ultrapassa a barreira hematoencefálica e demonstra um forte potencial de tradução clínica. Este artigo resume os princípios básicos da administração de células estaminais intranasais em um modelo de glioma de mouse.

Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas para Glioblastoma em um modelo de mouse

Aqui, nós apresentamos um protocolo usando um dispositivo de posicionamento do rato que permita a colocação apropriada dos ratos para a administração intranasal de uma formulação do peptide-siRNA do cérebro-alvejando permitindo o silenciamento de gene eficaz no sistema nervoso central.

Um dispositivo de posicionamento para a colocação de camundongos durante a entrega de siRNA intranasal ao sistema nervoso central

Aqui, descrevemos um modelo de xenoenxerto de murina que se assemelha funcionalmente a um reservatório de Ommaya em pacientes. Desenvolvemos a Murine Ommaya para estudar novas terapêuticas para a doença leptomeningeal universalmente fatal.

Um modelo de xenoenxerto Murine Ommaya para estudar terapia direta da doença leptomeningeal

O protocolo aqui apresentado permite o transplante de microglia humana derivada de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSMG) no cérebro através de uma rota transnasal em camundongos imunocompetentes. O método de preparação e transplante transnasal das células e a administração da mistura de citocinas para a manutenção do iPSMG é mostrado.

Transplante de Microglia Pluripotente Pluripotente Induzido Humano em Microglia De camundongos imunocompetentes através da Rota Transnasal Não Invasiva

O desenvolvimento de modelos ortotópicos de tumores cerebrais pediátricos requer precisão meticulosa, usando um dispositivo estereotáxico para implantar células cancerígenas com precisão. A metodologia apresentada aqui descreve as etapas envolvidas na preparação de células tumorais cerebrais, na realização de injeções intracranianas e na implementação de um sistema de monitoramento pós-operatório para avaliar o enxerto de tumor cerebral.

Estabelecimento de modelos ortotópicos de xenoenxerto derivados de pacientes para tumores cerebrais usando um dispositivo estereotáxico

Aprenda o procedimento de enxerto de mucosa heterotópica para entrega direta de fármacos ao cérebro em ratos. Este método utiliza enxertos de septo nasal para superar a barreira hematoencefálica em aplicações terapêuticas.

Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

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