Name: Imagem confocal de Confinado repouso e fluindo Misturas colóide-polímero (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprenda a usar microscopia confocal para investigar o comportamento de fase e propriedades de transporte de suspensões coloidais atrativas confinadas. Este método combina análise de imagem automatizada e algoritmos de rastreamento de partículas.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada por uma Universidade de Houston Nova Faculdade Grant, uma doação de sementes a partir do Centro de Supercondutividade Texas, e ao Fundo de Investigação do Petróleo American Chemical Society (52537-DNI).

1. Preparação de misturas de polímero de colóide Nota: Este protocolo utiliza o poli (metacrilato de metilo) (PMMA) de partículas, estericamente estabilizados usando poli (ácido 12-hidroxiesteárico) e marcada com um corante fluorescente (por exemplo, Vermelho do Nilo, rodamina B, ou fluoresceína), que foram sintetizados seguindo um padrão receita 52. <ol><li> Prepara-se uma w / w mistura de brometo de ciclo-hexilo (CXB) e deca-hidronaftaleno (DHN) como um solvente de estoque de 3:1. Esta mistura quase corresponde a densidade eo índice de refracção das partículas. Adicionar um sal orgânico, cloreto de tetrabutilamónio (TBAC) 46, com o solvente, a uma concentração de 1,5 mM para a tela parcialmente as cargas sobre as partículas. </li><li> Para determinar com precisão a densidade das partículas, preparar uma suspensão a fração de volume de partícula aproximado Φ = 0,10 no CXB: solvente DHN. Centrifugar a suspensão a 800 xg durante 75 minutos e adicionar gota a gota DHN CXB ou para melhorar a flutuabilidadecorrespondente. Nestas experiências, a densidade das partículas de PMMA foi medido para ser ρ = 1,223 g / ml. </li><li> Prepare uma suspensão concentrada estoque de partículas de PMMA (aqui, Φ = 0,40) no CXB: DHN mistura de solventes. </li><li> Prepara-se uma solução concentrada de poliestireno linear (PS) no CXB: DHN mistura solvente. Aqui, uma solução de PS de peso molecular M w ≈ 3.000.000 (raio de rotação r g = 15 nm) é preparada a uma concentração de c p ≈ 50 mg / ml. </li><li> Misturar os pesos apropriados de partículas do polímero, e misturas de solventes imagens para formular suspensões com as concentrações desejadas de partículas e os polímeros. Nota: Aqui, as suspensões de partículas monodispersas são preparados a fração de volume de colóide constante Φ = 0,15 e de concentração de polímero variável no volume livre 53 c p = 0-25 mg / ml, e as suspensões que contêm dois tamanhos de partículas coloidais bidispersed, wom cada tamanho com uma etiqueta fluorescente diferente, são preparados a fracção do volume total de colóide fixo Φ = 0,15, o volume relação da fracção de partículas pequenas de r = 0,50, concentração de polímero e do volume livre de 5 ou 25 mg / ml. </li><li> Depois de cada suspensão é preparada, adicionar CXB ou DHN gota a gota e de centrifugação das amostras a 800 g durante pelo menos 75 minutos para confirmar que as partículas e aglomerados na suspensão permanecem flutuabilidade combinados. </li><li> Equilibrar todas as amostras de, pelo menos, 24 horas antes das experiências de imagiologia. </li></ol> . 2 Experimentos Amostra quiescentes: comportamento de fase <ol><li> Para determinar o comportamento de fase em massa, fabricar câmaras retangulares de lamínulas de vidro (Figura 1A). Para as misturas de polímero de colóide neste estudo, as câmaras de espessura h = 1 mm (definida pela espessura de uma lâmina de microscópio) dar comportamento granel. </li><li> Para acessar vários confinamentos em um único experimento de microscopia, fabricar fina cunhacâmaras forma, utilizando uma única lamela como um espaçador em uma cunha (Figura 1b). O ângulo de abertura da câmara é &lt;0,5 °, de modo que num campo de visão das paredes são quase paralelas entre si. Uma câmara representativa permite o acesso a espessuras de confinamento de h = 6 a&gt; 100 mM. </li><li> Construir câmaras em uma base de lamela para imagens em um microscópio invertido e selar com epoxi curável por UV, que não se dissolve na mistura solvente CXB-DHN. </li><li> Amostras de imagem usando um microscópio confocal. Este protocolo demonstra imagem com uma linha de varredura confocal ligado a um microscópio invertido equipado com uma lente de imersão em óleo 100X de abertura numérica NA = 1,40. </li><li> Excitar os corantes utilizando uma fonte de laser. Aqui os comprimentos de onda λ = 491 ou 561 nm são utilizadas para excitar a fluoresceína e os corantes de rodamina / Vermelho do Nilo, respectivamente. </li><li> No sistema de ponto-de varredura, gerar uma imagem por varredura rapidamente o ponto focal em toda a amostra (no x-y plano) utilizando o software confocal. A imagem bidimensional de 512 pixels x 512 pixels, cobrindo aproximadamente 50 mm x 50 mm, podem ser adquiridos em 1/32 seg. Melhorar a qualidade da imagem pela média de várias imagens ou aumentando o tempo de aquisição. </li><li> Localizado na parte inferior da câmara (z = 0), por exemplo, concentrando-se em partículas aderidas à sua parte inferior. Nesta configuração, a altura (z) aumenta com o aumento foco na câmara. </li><li> Como exemplo, caracterizar o efeito de confinamento sobre a dinâmica das partículas através da aquisição de uma série de tempo de 2-D de imagens (no plano xy) no plano médio da câmara. Em um experimento, 500 imagens de dimensão 512 pixels x 512 pixels são adquiridos a uma taxa de quadros de 1 frame / seg (tempo de espaçamento Dt = 1 seg.) </li><li> Como um segundo exemplo, caracterizar a estrutura 3-D de partículas através da aquisição de uma série tridimensional de imagens (x, y, z). Em uma experiência típica, imagens bidimensionais (512 pixels x 512 pixels) sãoadquirido em várias posições z dentro da câmara, com um espaçamento constante de Δz = 0,2 m entre imagens consecutivas definidas por um piezo. Uma pilha de volume que abrange uma espessura h = 30 mm, assim, contém 151 imagens. </li><li> Localize e partículas de pista ao longo do tempo em 2-D ou 3-D usando-tracking partícula software escrito em IDL 23,54-56, MATLAB 57,58, LabView 59, ou Python 60. Estes algoritmos geralmente permitir que os centros das partículas a ser resolvido dentro de 40-50 nm. Rastreamento de partículas bem sucedida requer que as partículas se movem menos do que o espaçamento interpartículas entre quadros consecutivos. </li><li> A partir das posições das partículas, calcular as métricas estruturais e dinâmicas. Três métricas convenientes mostradas aqui são a função de correlação par 3-D g (r) 61, o deslocamento médio-quadrado 2-D (MSD) 58,62, eo auto parte 2-D da função de correlação van Hove G s ( x, t) 58. Os dois últimos indicadores pode também ser calculado em 3-D. </li></ol> . 3 experimentos de fluxo: propriedades de fluxo <ol><li> Fabricar uma célula de fluxo simples, usando um microcapilar vidro com corte transversal quadrado (100 mm x 100 mm), que é afixada a tubulação de Teflon. Use lamelas de vidro para suportar o capilar e proporcionar rigidez mecânica, como mostrado no diagrama esquemático na Figura 7. </li><li> Carregar a mistura de polímero de colóide dentro de uma seringa de vidro. Fixe a seringa a uma bomba de seringa ou um sistema de distribuição de fluido pneumático. </li><li> Monte a configuração de célula de fluxo para o microscópio invertido. Manter a seringa, célula de fluxo, e saída na mesma altura para minimizar o efeito da gravidade sobre o perfil do escoamento. </li><li> Controlar a velocidade de fluxo da suspensão através da célula de fluxo por a taxa de fluxo volumétrico (para a bomba de seringa) ou a pressão aplicada (para a caixa de pressão). A velocidade média da suspensão nos microcanais também depende da suformulação spension. Os valores típicos da velocidade máxima nos microcanais quadrados medidos são aqui 200-2.000 mM / seg. </li><li> Durante o fluxo, adquirir um 2-D de séries temporais confocal com taxas de quadro rápidas. Aqui, 500 imagens de dimensão de 512 pixels x 512 pixels são adquiridos a 32 quadros / seg (tempo de espaçamento Δ t = 1/32 seg) a diferentes alturas acima do fundo do microcanal (z = 0 mm) que variam de z = 5 - 50 um. Cada imagem cobre cerca de metade da dimensão lateral (y) do microcanal, como mostrado na inserção à Fig. 7. Se as partículas parecem elíptica, aumentar a taxa de fotogramas de aquisição. </li><li> Como em experimentos quiescentes, localize as partículas em 2-D usando algoritmos padrão para localização e rastreamento de partículas em IDL ou MATLAB. Para os fluxos lentas, em que as partículas se movem menos do que a distância média entre os quadros de interpartículas, utilizam algoritmos de rastreamento para obter as trajectórias. </li><li> Use correlação imagem para calcUlate os perfis de velocidade para os fluxos rápidos. <ol><li> Subdividir a imagem em imagens horizontais de altura constante (y) ao longo da direcção do fluxo de (x). Para duas imagens sequenciais I 1 (x, y) e I 2 (x, y) deslocar o último imagem por um factor de Ax e, em seguida, calcular a covariância cruzada entre I 1 (x, y) e I 2 (x + Ax, y). </li><li> Identificar a posição do pico do histograma de valores AX que maximizam a covariância cruzada entre cada par de imagens para obter a velocidade adveccao significativo em cada posição lateral y. Se essa distribuição não é fortemente pico, adquirir imagens com uma taxa de quadros mais rápido. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As suspensões coloidais são amplamente estudada como modelo para o comportamento de fase confinada, porque as partículas coloidais de tamanho micro exibem dinâmica significativamente mais lento do que os átomos e as moléculas e, assim, pode ser facilmente trabalhada e rastreado ao longo do tempo 10. Para estes estudos fundamentais, a compreensão do efeito de atrações interpartículas no comportamento de fase confinado oferece a oportunidade de explorar fenômenos como condensação capilar e evaporação 21,22...

Este trabalho demonstra (a) imagem confocal de misturas quiescentes e fluindo confinados colóide-polímero em duas e três dimensões e (b) partícula de rastreamento e de correlação das imagens resultantes para obter informações quantitativas sobre o comportamento de fases e propriedades de fluxo. Suspensões coloidais com interações interpartículas atrativas aparecer onipresente em aplicações tecnológicas como materiais para a montagem dirigida 1-3, a entrega da droga 4, a melhoria 5-7 recuperação de hidrocarbonetos, e de armazenamento de energia 8. Uma característica comum destes aplicativos é que as partículas devem ser fluiu através geometrias finas, como bicos, cabeças de impressão, microcanais, ou meios porosos, e / ou ser moldado em filmes finos ou varas. Técnicas utilizadas para sondar a estrutura de colóides micro-empresas em geometrias confinadas, incluindo microscopia eletrônica de 17,18, microscopia de raios-x 19, e laser de difração microscopy 20, pode ser usado para medir a estrutura e a dinâmica das partículas em microescala. Estas técnicas, no entanto, não permitem acesso às trajetórias de partículas individuais, das quais métricas estruturais e dinâmicas podem ser computados para comparação direta com simulações numéricas 21,22. A microscopia confocal é uma variante de microscopia de fluorescência que permite imagens de cortes finos de uma amostra de fluorescência. Para a ciência coloidal 10, esta técnica é particularmente útil para a imagem no fundo de suspensões densas ou em três dimensões. Algoritmos de partícula de localização 23 aplicado a duas ou séries temporais tridimensional de micrografias confocal produzir as trajectórias de todas as partículas visíveis. Como resultado, a combinação de microscopia confocal e partículas de controlo foi aplicado para estudar o comportamento de fase, a estrutura, e dinâmicas de suspensões coloidais, incluindo cristais ordenados 24-27 e desordemed óculos 28-31 e 32-35 géis. Outros algoritmos de análise de imagem pode ser aplicado para medir a dinâmica das partículas a partir de séries cronológicas de micrografias confocal. Por exemplo, a dinâmica das partículas difusoras pode ser estudado através da análise das variações na intensidade ao longo do tempo usando microscopia confocal dinâmica diferencial 36. Quando os deslocamentos das partículas são maiores do que o espaçamento interpartículas, correlação entre a imagem 37 com base na imagem da partícula velocimetria 38-40 pode ser aplicado para medir os perfis de velocidade das partículas. A combinação de monitoramento e correlação algoritmos permitiu dinâmica coloidais a ser medida em sistemas submetidos lento e rápido fluxo de 11-16,41-45. Usamos misturas colóide de polímero como modelos para atraentes suspensões coloidais 9. Nestas misturas, a gama e a força do potencial atractivo interpartículas são controladas através do ráciodo raio de giração de polímero para o raio da partícula e a concentração do polímero e da repulsão electrostática é controlado através da adição de um sal monovalente orgânico 46. Porque as interacções interpartículas pode ser cuidadosamente ajustados, a solidificação destas misturas tem sido extensivamente estudada por microscopia confocal 34,47-51. Aqui demonstramos imagem confocal e análise de imagem 37 de misturas de polímeros com colóide de quiescentes e fluidas, em que a fracção do volume de colóide é mantido fixo em Φ = 0,15, que o efeito da sonda de confinamento no comportamento de fase e as propriedades de escoamento destas misturas. Estas técnicas são amplamente aplicáveis ​​a sistemas de partículas que são de refracção e no qual as partículas e / ou solvente pode ser marcada com um corante fluorescente de correspondência de índice.

<table><tbody><tr><td>Brometo de ciclohexil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>Número CAS&nbsp; 108-85-0, Peso molecular = 163.06, Usado em estoque</td></tr><tr><td>solvente Decahidronaftano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>Número CAS 91-17-8, Peso molecular = 138.25, Usado em estoque solvente</td></tr><tr><td>Vermelho do Nilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Corante fluorescente</td></tr><tr><td>Fluoresceína 5(6)-isotiocianato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Corante fluorescente</td></tr><tr><td>Rodamina B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Corante fluorescente</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering&nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>DLS equipamento usado para medição de tamanho de partícula</td></tr><tr><td>Poliestireno&nbsp;</td>Poliestireno (polímero) Varian <td>/ Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>para induzir a atração de depleção</td></tr><tr><td>Tetrabutil(cloreto de amônio) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>sal monovalente Adesivo</td></tr><tr><td>UV</td><td>Adesivo Norland</td><td>NOA 68T</td><td>Número da peça 68T01 (adesivo curado por UV)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Scanner</td><td>confocal</td>VT</tr><tr><td>Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Microscópio</td><td>de scanner confocal Infinity</td></tr><tr><td></td><td>Centrífuga</td> de <td>microscópio invertido</td>Leica <td>DMI3000B</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5,000 rpm</td></tr><tr><td>Tubo de teflon</td><td>smallparts</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Tubo de parede 26 AWG 0.016" ID x 0.003"</td></tr><tr><td>Parede Epóxi</td><td>Devcon</td><td>DA051</td> Seringa <td>de epóxi de 5 min</td></tr><tr><td></td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>seringa de vidro com luer de metal ponta de trava</td></tr><tr><td>Pontas de seringa&nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 pontas de precisão GA&nbsp;</td></tr><tr><td>Bomba de seringa&nbsp;</td><td>Sistema de bomba New Era Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Bomba microfluídica programável (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Balança</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0,0001-220 g</td></tr><tr><td>Partículas de PMMA</td><td>sintetizadas</td><td></td><td>partículas coloidais de poli(metilmetacrilato)</td></tr></tbody></table>

imagem confocal de confinado repouso e fluindo misturas colóide-polímero

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

O comportamento de suspensões coloidais confinados com interacções atractivas interpartículas é crítica para a concepção racional de materiais para a montagem dirigida 1-3, a entrega da droga 4, melhorou a recuperação de hidrocarboneto de 5-7, e eléctrodos de fluidos para o armazenamento de energia 8. Suspensões contendo colóides fluorescentes e polímeros não-adsorventes são atraentes sistemas modelo, como a relação do raio de giração de polímero para o raio da partícula e a concentração de polímero de controlo da gama e da força da atracção de interpartículas, respectivamente. Ao ajustar as propriedades do polímero e a fracção de volume de colóides, fluidos coloidais, fluidos de aglomerados, geles, cristais e vidros pode ser obtido 9. Microscopia confocal, uma variante de microscopia de fluorescência, permite que uma amostra de opticamente transparentes e fluorescente a ser trabalhada com alta resolução espacial e resolução temporal em três dimensões. Nesta técnica, um pequeno furo ou fenda bloqueia a luz fluorescente emitida a partir de regiões da amostra que estão do lado de fora do volume focal do sistema óptico do microscópio. Como resultado, apenas uma seção fina da amostra no plano focal é imaginada. Esta técnica é particularmente adequado para investigar a estrutura e dinâmica em suspensões coloidais densas na escala de partícula única: as partículas são grandes o suficiente para ser resolvido usando a luz visível e difundir lentamente o suficiente para ser capturado em velocidades de varredura típicos de sistemas confocal comerciais 10 . Melhorias na velocidade de varredura e algoritmos de análise também permitiram imagem confocal quantitativa das suspensões fluindo 11-16,37. Neste artigo, demonstramos experimentos de microscopia confocal para sondar o comportamento de fase confinado e propriedades de fluxo das misturas colóide-polímero. Primeiro preparar collmisturas oid-polímero que são densidade e refração índice combinado. Em seguida, apresentamos um protocolo padrão para imagens misturas colóide-polímero densas quiescentes sob variando confinamento em células em forma de cunha finas. Finalmente, foi demonstrado um protocolo para imagiologia misturas colóide-polímero durante o fluxo de microcanais.

Para demonstrar imagem confocal e partícula-rastreamento, investigou o efeito de confinamento no comportamento da fase das misturas de polímero colóide de 63-65. Para estas experiências, o diâmetro colóide foi 2 a = 0,865 mM. A fracção do volume de colóide foi fixada em Φ = 0,15 e a concentração de polímero de c p foi variou de 0 a 23,6 mg / ml. Imagens confocais representativos são mostrados na Figura 2 63, coluna da esquerda. A partir das posições das...

A microscopia confocal é utilizado para as misturas de polímero-colóide quiescentes e fluidas de imagem, que são estudados como sistemas modelo para suspensões atraentes. Algoritmos de análise de imagem são utilizadas para calcular as métricas estruturais e dinâmicas para as partículas coloidais que medem alterações devido ao confinamento geométrico.

Imagem confocal de Confinado repouso e fluindo Misturas colóide-polímero

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

O objetivo geral do seguinte experimento é quantificar as alterações no comportamento de fase confinada e nas propriedades de transporte de suspensões coloidais atrativas utilizando microscopia confocal. Isso é alcançado por meio da formulação de misturas coloide-polímero para modelar suspensões coloidais atrativas. As misturas são observadas e confinadas em células finas em cunha para demonstrar como o confinamento modifica a estrutura, a dinâmica e o comportamento de fase dessas misturas.A seguir, as misturas são analisadas por imagem enquanto fluem através de microcanais, a fim de determinar o efeito da intensidade de atração entre os coloides nas propriedades de transporte confinado das misturas. Algoritmos automatizados de análise de imagem e rastreamento de partículas podem demonstrar como o confinamento em repouso leva à solidificação e à correlação de imagens. Os algoritmos podem mostrar como o aumento da intensidade de atração resulta em um comportamento de fluxo cada vez mais não newtoniano.A principal vantagem desta técnica ou de outros métodos, como microscopia eletrônica e espalhamento dinâmico de luz, é que ela permite rastrear diretamente as trajetórias individuais d

confocal-imaging-confined-quiescent-flowing-colloid-polymer

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