Name: A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-13T23:35:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a obter osteócitos maduros ramificados a partir de osteoblastos primários de camundongos usando ácido retinóico (ATRA). Este método permite diferenciação rápida e eficiente para estudos de biologia óssea.

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O financiamento foi fornecido por &quot;Progetto um concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010&quot; para MD, e Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a regulamentação em vigor da Europa em matéria de protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram analisados ​​e aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Milão e Nacional. 1. Isolamento de osteoblastos primários O método, com modificações menores, segue o procedimento descrito por Dodig et al 14. <ol><li> Prepare digerindo médio, por adição de 0,1% de colagenase P e 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10x, sem vermelho de fenol) com meio HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks, sem cálcio, magnésio, ou vermelho de fenol). </li><li> Use 3-4 dias os ratos velhos (o processo pode ser aplicado para tão poucos como um ratinho). </li><li> Sacrifício por decapitação. Pulveriza-se a cabeça com etanol a 70% e manter em gelo. Remover as camadas da pele e dos músculos por pinças e dissecação / tesoura cirúrgica. </li><li> Remova cuidadosamente os ossos parietais esepará-las após a sutura sagital, em duas metades. Certifique-se que os ossos são livres de suturas e qualquer tecido aderente e coloque pedaços de ossos individuais em bem-placas contendo meio HBSS até que o processo seja concluído. </li><li> Descartar HBSS e adicionar a cada poço meio de digerir durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Desprezar o sobrenadante. </li><li> Adicionar mais uma vez o meio para digerir durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Este tempo de guardar o sobrenadante e colocá-lo em alfa-MEM (Meio Essencial Mínimo) suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1% de estreptomicina / penicilina. </li><li> Repita os passos 1.7 e 1.8 2x. </li><li> Reúnem-se os três fracções recolhidas, as células de rotação por centrifugação a 425 g durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante, adicionar 3 ml de alfa-MEM suplementado para ressuspender o sedimento de células, e transferir para um frasco de 25 cm 2. </li><li> Mude o meio após 24 horas para remover detritos e células mortas. </li><li> Adicionar 50 ug / ml de ácido ascórbico (AA) e 3 mM de gliCerol 2-fosfato de hidrato de sal de dissódio (GP) para o meio alfa-MEM. </li><li> Depois disso, mudar o meio (alfa-MEM mais AA / PG) a cada dois dias. </li></ol> 2. Protocolo ATRA <ol><li> Realizar todos os experimentos com ATRA (ácido trans-retinóico), em uma sala escura para evitar a inativação. </li><li> Prepara-se uma solução de tripsina 1X em meio HBSS e manter a 37 ° C até à sua utilização. </li><li> Remova o meio de células confluentes e cuidadosamente lave-os com HBSS. </li><li> Adicionar 1 ml de tripsina, rodar suavemente o frasco para permitir que todas as células a serem cobertas pela tripsina e incubar durante 3 min a 37 ° C. </li><li> Verifique se o desprendimento real de células sob um microscópio invertido. </li><li> Adicionar 3 ml de meio alfa-MEM para inactivar a tripsina. </li><li> Recuperar as células e centrifugar durante 15 min a 425 g. </li><li> Ressuspender o sedimento de células em meio fresco. </li><li> Coloque uma gota de uma câmara de contagem do hemocitômetro, deixar repousar por alguns minutos e contar o cenúmero ll. </li><li> Colocar as células em frascos de 25 centímetros 2 a uma densidade de 10.000 células / cm 2 com alfa-MEM mais AA / GP. Esteja ciente de que a densidade celular é relevante para o melhor desenvolvimento de processos celulares e contatos intercelulares. Uma densidade de partida maior do que 10.000 células / cm 2 prejudica o bom desenvolvimento de processos celulares, mas os números de células mais baixos resultam em morte celular prematura, devido à ausência de contactos intercelulares. </li><li> Adicionar 5 mM ATRA ao meio cada 24 horas. </li><li> Monitorar as células diariamente para avaliar a morfologia: alterações morfológicas são geralmente observadas após 48 horas. Se, após a primeira 24-48 horas, as células estão ainda em proliferação, replate na densidade acima. Uma população homogénea de osteócitos madura está presente após 4-5 dias. Dependendo das necessidades, utilizar as células, em qualquer ponto de tempo, até 12-15 dias. </li><li> Quando as células são colocadas em outros suportes (como lamelas ou bem-placas), certifique-se que a densidade acima é mantido econtinuar a adicionar ATRA cada 24 horas até à sua utilização. Deixar as células a aderir ao novo suporte para, pelo menos, 24 horas antes da experiência. </li></ol> 3. Imunocoloração <ol><li> Para imunocoloração, placa das células sobre lamínulas e seguir metodologias estabelecidas (ver, por exemplo Burry 15). </li><li> Por exemplo, por imunofluorescência indirecta, fixar em 4% de paraformaldeído ou acetona fria, sequencialmente incubar com o anticorpo primário, à TA, durante 1 hora numa câmara húmida, em seguida, com o anticorpo secundário marcado com fluorescência, no escuro, à TA, durante 30 min, numa câmara húmida. </li><li> Use DAPI ou análogos para contracoloração nuclear, e montar em meio anti-desbotamento. </li></ol> 4. Alizarin coloração vermelha e Extração <ol><li> Placa as células em lamelas. </li><li> Fixar as células imergindo as lamelas com etanol a 70% durante 10 min. </li><li> Cobrir as células com algumas gotas de solução de coloração de vermelho de alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)durante 30 min. </li><li> Lave as lamelas com água da torneira. Monte com uma gota de glicerol em lâminas de vidro e tirar fotos usando um microscópio vertical em 10x e 20x de ampliação. </li><li> Após o procedimento acima, recuperar as lamelas por imersão das lâminas em água da torneira. </li><li> Coloque cada lamela em um prato bem. </li><li> Adicionar 60% de ácido perclórico (a quantidade deve ser suficiente para cobrir completamente as células) e deixar de O / N a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Leia a densidade óptica do sobrenadante por espectrofotometria a 450 nm de comprimento de onda. </li><li> Para normalizar os valores para o número de células, adicionar Janus verde (solução a 0,2% em PBS) para cobrir a preparação de células durante 10 min. </li><li> Lave cuidadosamente com água ultrapura. </li><li> Adicionar 0,5 N HCl (a quantidade deve ser suficiente para cobrir todas as células) e agitar suavemente com a mão por alguns segundos. </li><li> Leia a absorvância a 615 nm por espectrofotometria. </li></ol>

<ol><li>Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+3D+imaging+of+the+osteocyte+lacuno-canalicular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative 3D imaging of the osteocyte lacuno-canalicular network.</a> Bone. 47 (5), 848-858 (2010).</li>
<li>Cheng, F., Hulley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte--a+novel+endocrine+regulator+of+body+phosphate+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The osteocyte--a novel endocrine regulator of body phosphate homeostasis.</a> Maturitas. 67 (4), 327-338 (2010).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> 45 (4), 682-692 (2009).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Nos últimos anos, o osteócito emergiu como a célula mais central do osso. Avanços da pesquisa são progressivamente revelando um número de propriedades osteócitos anteriormente insuspeitas ou não comprovadas, que são de enorme valor para a concepção de novos e melhores tratamentos para uma variedade de doenças ósseas. No entanto, a investigação de biologia osteócito tem vindo a sofrer de disponibilidade limitada de modelos in vitro de tal forma que os osteoblastos têm sido utilizados como substitutos de células ...

Osteócitos, o tipo de célula mais abundante do osso, são terminalmente diferenciados, células altamente ramificados profundamente situadas dentro do esqueleto. O corpo celular de osteócitos maduros estão contidas em lacunas de osso e têm diversas formas; osteócitos com corpos celulares alongados são encontrados no osso cortical, enquanto osteocytes arredondadas são mais freqüentes no osso trabecular 1. Dendritos ramificados estender a partir do corpo celular e residem em pequenos canais chamados canalículos, formando uma intrincada rede que faz com que vários contatos não só com outros osteócitos, mas também com outros tipos de células do osso, medula óssea, vasos sanguíneos e pericitos associados. Através do fluido intersticial contido nas lacunas e canalículos, osteócitos estão também em última análise, ligado ao sistema de circulação, pelo que pode influenciar não só local, mas também efeitos sistémicos, e vice-versa, o seu comportamento pode ser regulada por ambas as alterações locais e sistémicas 2. Oestudo de osteócitos recentemente ganhou impulso, graças a uma série de avanços técnicos, tais como a geração de-tecidos e animais transgénicos específicos de células, a utilização de técnicas de microscopia potentes e de rastreio molecular de alto rendimento 3,4. No entanto, o conhecimento destas células ainda é incompleta, principalmente devido à escassez relativa de adequada em modelos in vitro. Na verdade, osteócitos sempre foram difíceis de obter e manter na cultura devido à localização profunda, e ao baixo nível de proliferação que caracteriza esse tipo de célula diferenciada. Ao longo dos anos, um número de métodos tem sido desenvolvida para isolar osteócitos primário 5-7, embora eles geralmente produzem rendimentos celulares baixas e comporta o risco de que mesmo poucos fibroblastos contaminantes irá cobrir rapidamente osteócitos 8. Por esta razão, a maior parte do trabalho experimental in vitro tem sido realizada até agora para a célula osteócito bem estabelecida line MLO-Y4 9. Metodologias in vitro adicionais podem aumentar a possibilidade de estudar essas células e pode melhorar a análise da biologia osteócito e fisiopatologia. Para ser amplamente adotada, tais métodos devem ser fáceis de reproduzir, e não exigiria instrumentos especiais ou tempos muito longos para alcançar a maturação celular. Mais importante, se for o caso de células primárias, elas tornam possível tirar proveito de animais transgénicos. Descrevemos recentemente que o tratamento de células da linha osteoblástica MC3T3-E1 e em osteoblastos primários com ácido retinóico induz uma mudança de fenótipo rápida que leva ao desenvolvimento de uma população de células homogéneas ramificadas rolamento características morfológicas e moleculares de osteócitos 10. All-trans ácido retinóico (ATRA) é um produto metabólico ativa da vitamina A, que regula a transcrição de genes pelos receptores de ácido retinóico nucleares (RAR) vinculativo. RARse ligam ao DNA, como heterodímeros com os receptores de retinóide X (RXRs), em última análise conduzindo à modulação de ácido retinóico (RA)-responsivo genes alvo 11. ATRA foi mostrado para modular a diferenciação e maturação de vários tipos de células, entre as quais as outras células ramificadas, tais como as células neuronais e podócitos 12 13. O método aqui descrito baseia-se na adição de ATRA para osteoblastos primários. Para ser eficaz, a ATRA tem de ser adicionado a uma fase de maturação precisas sobre células plaqueadas a uma densidade definida; em nossa experiência essas condições são fundamentais para obter a chave de fenótipo de osteoblastos para osteócitos.

<table><tbody><tr><td>Colagenase P</td><td>Roche Applied Science</td><td>11213857001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14175129</td><td>Pré-aquecer a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar Alpha-MEM</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>22571038</td><td>Pré-aquecer a 37 &deg; C antes</td></tr><tr><td>de usar FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina/Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 2-fosfato dissódico sal hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>ATRA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>Proteja o ATRA da luz</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Dissolva em PBS e filtre antes de usar. Sempre trabalhe sob uma capa química.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td>Pode ser adicionado ao anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Vermelho de alizarina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Janus Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201677</td><td></td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176745</td><td>Use com cautela (recomenda-se proteção para a pele e os olhos)</td></tr> <tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>Use com cautela (recomenda-se proteção para a pele e os olhos)</td></tr> <tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Fluorsave</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Econômicas #7, pontas de 0,40 x 0,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501981</td><td></td></tr><tr><td>Pinças Econômicas #4, pontas de 0,40 x 0,45 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>501978</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação, reta, curvada de 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica, 14 cm, reta, S/S</td><td>World Precision Instruments</td><td>501218</td><td></td></tr><tr><td>frascos de cultura</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>placas de poço</td><td>Corning</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>Thermanox lamínulas</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>12-565-27</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Zeiss Apotome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro</td><td>Safas Xenius</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

<html> A necessidade de culturas osteócitos é bem conhecido para a comunidade de pesquisadores de osso; isolamento de osteócitos primário é difícil e produz números de celular de baixa. Portanto, o sistema celular mais extensamente utilizado é a linha de células MLO-Y4-osteócito semelhantes. O método aqui descrito refere-se à utilização de ácido retinóico para gerar uma população de células homogéneas ramificadas com características morfológicas e osteócitos moleculares. Após o isolamento de osteoblastos de calvárias de ratinho, o ácido all-trans retinóico (ATRA) é adicionado ao meio celular, e monitorização celular é conduzida por dia, sob um microscópio invertido. Primeiros alterações morfológicas são detectáveis ​​após 2 dias de tratamento e diferenciação está geralmente completa em 5 dias, com o desenvolvimento progressivo de dendrites, a perda da capacidade para produzir matriz extracelular, a infra-regulação de marcadores de osteoblastos e a sobre-regulação de moléculas específicas de osteócitos. conteúdo &quot;&gt; monitoramento de células diária é necessária devido à variabilidade inerente de pilhas, eo protocolo pode ser adaptado com variação mínima de células obtidas a partir de diferentes linhagens de camundongos e aplicadas a modelos transgênicos. O método é fácil de realizar e não requerem instrumentação especial, que é altamente reprodutível, e rapidamente gera uma população osteócito madura em completa ausência de matriz extracelular, que permite a utilização destas células para aplicações biológicas ilimitadas.

Os resultados foram obtidos 5-10 experiências independentes. Morfologia celular AA / GP tratado pilhas têm características principalmente de paralelepípedos-like, característica dos osteoblastos maduros. Células ramificadas intercaladas (conforme indicado pelas setas vermelhas na Figura 1A) pode ser encontrado, o que provavelmente representa cerca de osteócitos. Com o tratamento com ATRA, as células começam rapidamente visu...

Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.

A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

O objetivo geral deste procedimento é obter osteócitos maduros ramificados a partir de osteoblastos primários. Isso é alcançado primeiramente isolando-se osteoblastos primários de ossos de camundongos recém-nascidos e cultivando-os para permitir a maturação dos osteoblastos. Em seguida, osteoblastos confluentes são tryps.Em seguida, as células são contadas e replantadas em uma densidade definida para garantir o sucesso. Então, todo o ácido trans-retinóico ou ATRA é adicionado ao meio celular para reduzir a proliferação celular e induzir a diferenciação completa para uma morfologia de osteócito. Os resultados obtidos mostram que, na presença de ATRA, as células adquirem rapidamente uma morfologia ramificada, deixam de produzir matriz extracelular e se diferenciam para um fenótipo de osteócito maduro, conforme demonstrado pela expressão de marcadores de osteócitos. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o isolamento de osteócitos primários ou a diferenciação de osteoblastos em uma matriz tridimensional, é que ela produz um número suficiente de osteócitos em poucos dias.A ausência de métricas circundantes facilita o uso dessas células em ensaios de

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Biologia

Este vídeo demonstra uma técnica de coloração para detectar a extensão da mineralização ou deposição de cálcio em osteoblastos primários cultivados usando corante vermelho de alizarina.

Coloração com vermelho de alizarina: uma técnica para visualizar a mineralização por osteoblastos cultivados

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de reabsorção osteoclástica in vitro em placas de cultura de células revestidas com fosfato de cálcio cultivadas com osteoclastos derivados de células mononucleares de sangue periférico humano. Os osteoclastos formam um anel de actina característico na matriz revestida de fosfato de cálcio da placa de cultura de células e degradam a matriz dentro da região do anel de actina para liberar íons de cálcio e fosfato, resultando na formação de poços de reabsorção...

Ensaio de reabsorção: uma técnica in vitro para quantificar a atividade de reabsorção de cálcio de osteoclastos maduros usando placas de cultura revestidas com fosfato de cálcio

Os osteoclastos são as células de reabsorção óssea principais no corpo. Uma capacidade de isolar os osteoclastos em grandes números resultou em avanços significativos na compreensão da biologia dos osteoclastos. Neste protocolo, nós descrevemos um método para o isolamento, cultivo e quantificar a actividade dos osteoclastos in vitro.

Osteoclastos Derivação do mouse Medula Óssea

A sinalização Notch é uma forma de comunicação celular que depende do contato direto entre as células. Para induzir adequadamente a sinalização Notch in vitro, os ligantes Notch devem ser apresentados às células em estado imobilizado. Este protocolo descreve métodos para estimulação in vitro da sinalização Notch em precursores de osteoclastos de camundongos.

Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Neste artigo, apresentamos métodos para isolar e diferenciar as células do estroma da medula óssea e células-tronco hematopoiéticas de ossos longos de rato. Dois protocolos diferentes apresentam-se populações de células diferentes rendimento adequadas para a expansão e diferenciação em osteoblastos, osteoclastos e adipócitos.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

O número de novos biomateriais, projetado para a reparação de lesões ósseas grande está expandindo continuamente com o objectivo de reforçar a consolidação óssea e superar as complicações associadas com o transplante de osso. Aqui, apresentamos uma estratégia multidisciplinar para testes de pré-clínica biocompatibilidade de biomateriais para reparo ósseo.

Perfil de compatibilidade biológica em biomateriais para regeneração óssea

Os osteoclastos são polykaryons tecido-específicos do macrófago derivados da linhagem do monocyte-macrófago de pilhas de haste hematopoietic. Este protocolo descreve como isolar pilhas da medula de modo que as grandes quantidades de osteoclastos sejam obtidas ao reduzir o risco de acidentes encontrados em métodos tradicionais.

Isolamento, purificação e diferenciação de precursores de osteoclast da medula óssea de ratos

Este protocolo descreve a dissecção neonatal da calvária de camundongos dmp1-topázio e o isolamento de osteócitos expressando a proteína verde fluorescente através da digestão e fracionamento celular, além da preparação de osteócitos para triagem celular ativada por fluorescência (FACS).

Obtenção de osteócitos primários através do fracionamento em calvária murina de osteócitos que expressam GFP

Aqui, apresentamos um procedimento de ensaio simples e eficaz para ensaios de poço de resorção usando placas de cultura celular revestidas de fosfato de cálcio.

Um protocolo simples de ensaio de poços para visualizar e quantificar a resorção osteoclástica in vitro

Este estudo fornece um protocolo para o uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea sob força ortodôntica e descreve métodos para analisar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica, esclarecendo a biologia mecânica esquelética.

Uso de camundongos knockout Stat3 específicos para linhagem osteoblástica induzível para estudar a remodelação óssea alveolar durante a movimentação ortodôntica

Aprenda a obter osteócitos maduros ramificados a partir de osteoblastos primários de camundongos usando ácido retinóico (ATRA). Este método permite diferenciação rápida e eficiente para estudos de biologia óssea.

A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

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