Fabricação de concentrado, oxigênio à base de microbolhas Lipid Emulsões pelo Alto cisalhamento homogeneização e Concentração de série

O objetivo geral deste procedimento é produzir um grande volume de microbolhas autossustentáveis, baseadas em lipídios e carregadas com oxigênio, ou OMS, para administração intravenosa de oxigênio. Isso é realizado utilizando um homogeneizador de alta cisalhamento e um tanque hermético ao gás para fabricar e concentrar em série as OMS. O segundo passo consiste em usar seringas modificadas para extrudir uma emulsão LOM contendo 70 por cento em volume de oxigênio.

Em seguida, a emulsão é concentrada por centrifugação para produzir uma espuma de oxigênio com 90 por cento do volume. O passo final consiste em realizar o controle de qualidade calculando a porcentagem volumétrica de oxigênio e avaliando a distribuição do tamanho das partículas utilizando tecnologia de espalhamento de luz. Em última análise, a homogeneização por alta cisalhamento produz dois litros de OMS contendo 90% de oxigênio em volume.

A principal vantagem desta técnica em comparação com métodos de fabricação existentes, como sonicação e amalgamação, é que a homogeneização produz microbolhas autoagregáveis na ordem de litros, um volume necessário para testes em animais de grande porte de entrega terapêutica de oxigênio. Um dos usos desta técnica é tratar pacientes com hipoxemia grave, pois microbolhas preenchidas com gás oxigênio transferem oxigênio para desoxiemoglobina em segundos e transportam três vezes o conteúdo de oxigênio do sangue. A demonstração deste método é importante pela profundidade da cabeça do homogeneizador.

A manutenção de um ambiente puramente oxidado e a distinção entre a fase de LMS concentrada e a fase aquosa podem ser difíceis de perceber. O sistema para fabricação de microbolhas de oxigênio baseadas em lipídios, ou SMO, consiste em um tanque de retenção e concentração, ou TRC, equipado com um misturador de um único estágio, um homogeneizador de alta cisalhamento em linha, uma bomba de rolos para movimentar o fluido entre o TRC e o homogeneizador, e um trocador de calor.

Para iniciar a configuração do sistema, posicione um frasco coletor de vidro esterilizado com boca larga e capacidade de quatro litros, equipado com duas portas na base e três portas laterais, abaixo do misturador de estágio único. Conecte uma das portas da base, porta número um do HCT, a uma tubulação estéril transparente com diâmetro interno de três oitavos de polegada, com aproximadamente 25 cm de comprimento, adaptada com uma torneira de três vias na ponta, para coleta da emulsão concentrada. Em seguida, conecte a segunda porta da base, porta número dois, a uma tubulação estéril com diâmetro interno de três oitavos de polegada, com cerca de 91 cm de comprimento. Passe essa tubulação pela bomba de roletes.

A entrada do homogeneizador de alta cisalhamento é equipada com uma peça em formato de T que inclui duas portas. Conecte um tubo da porta número dois, passando pela bomba de roletes, e conecte à porta lateral da peça em T. Fixe a outra porta a um tanque de oxigênio utilizando um medidor de fluxo de gás oxigênio de baixo fluxo.

Conecte a porta de saída do homogeneizador de alta cisalhamento à porta de entrada de um trocador de calor em linha mantido a quatro graus Celsius. Conecte a porta de saída do trocador de calor à porta de retorno do HCT, criando um sistema de circuito fechado. Conecte o tanque de oxigênio, por meio de um medidor de fluxo, ao HCT através da porta número quatro.

Por fim, conecte um monitor de composição de gás aberto à atmosfera à porta superior do HCT. Para iniciar este procedimento, coloque 20 gramas de GMP um dois DYS óleo de estearina, SN glicerol três FOSFATIDILCOLINA ou DSPC e 10 gramas de colesterol na base do HCT. Adicione um litro de plasma light A ao HCT e agite manualmente por um minuto, incorporando o máximo possível de lipídio à fase aquosa.

Abixe o misturador de um estágio na fase aquosa, garantindo que toda a cabeça do misturador fique coberta pela fase aquosa. Para evitar que o ar ambiente contamine o espaço livre, utilize selos de borracha ou fita para garantir que o topo do HCT fique hermeticamente fechado e que não haja portas laterais abertas. Ligue a fonte de gás conectada à porta número quatro e aguarde até que a fração de oxigênio no espaço livre do HCT atinja mais de 95%. Usando o misturador de um estágio, misture a emulsão precursora por cinco minutos. A 5.000 RPM, a mistura resultante deve apresentar coloração branca pálida e não conter grumos visíveis de lipídio.

Uma vez misturada, a mistura não utilizada de lipídio e água pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até 30 dias antes do uso. Use a emulsão precursora para escorvar todo o sistema de circuito fechado, ligando a bomba de roletes a 1,3 litros por minuto ou LPM. Uma vez que o sistema esteja escorvado, mantenha a bomba ligada a 1,3 LPM para iniciar a fabricação das LO's.

Ligue o homogeneizador de cisalhamento elevado em linha a 7.500 RPM. Imediatamente após, ligue o fluxo de oxigênio para a parte de entrada do homogeneizador a 0,5 LPM. Mantenha o misturador de estágio único no HCT a 3.500 RPM.

As oms são formadas na interface entre as lâminas do rotor e as telas de emulsão dentro do homogeneizador em linha. Nos primeiros minutos, o fluido deve tornar-se visivelmente mais viscoso. Execute o sistema por 15 minutos e depois desligue o homogeneizador de alta cisalhamento e a entrada de oxigênio para ele.

Isso reduz a separação de fases e mantém o produto relativamente uniforme dentro do HCT. Observe que o volume da emulsão contendo gás deve aumentar aproximadamente de duas a três vezes durante a fase de concentração serial. As seringas de engate com trava de 140 mililitros, utilizadas para coletar o OMS produzido, foram previamente modificadas mediante a retirada de 100 mililitros de ar da seringa e, em seguida, o corte do êmbolo e do material excedente da seringa acima da marca de 140 mililitros.

Acople uma seringa estéril modificada à torneira de fechamento conectada à porta basal número um do recipiente de coleta, utilize pinça dentada para soltar o êmbolo e aspirar 100 mililitros de fluido, tampe firmemente a seringa e repita até que todo o fluido tenha sido removido. Centrifugue as seringas com a extremidade tampada orientada para baixo em uma centrífuga com cuba refrigerada a 225 ×g por 10 minutos. Após a centrifugação, três camadas de material estarão aparentes; ejetar e descartar a camada inferior de excesso da fase aquosa turva.

A segunda camada é branca brilhante e contém oms concentrados. Transfira a espuma concentrada para uma seringa de vidro impermeável a gases utilizando uma torneira de três vias para evitar contaminação por gases do ambiente. Descarte a camada final, que contém gás oxigênio livre proveniente de oms rompidos.

A qualidade da espuma pode ser avaliada calculando-se a concentração de gás da seguinte forma. Uma espuma de alta qualidade atingirá uma concentração de gás maior ou igual a 90 por cento em volume, como um segundo controle de qualidade, utilizando microbolhas por dispersão de luz óptica para determinar se o tamanho das partículas está dentro da faixa esperada. Deve-se observar que uma alteração no tempo de homogeneização ou na formulação pode modificar o tamanho das bolhas; tampe bem as seringas de vidro contendo oms concentrado.

Com um encaixe de trava de seringa, as seringas podem ser armazenadas a 22 graus Celsius, quatro graus Celsius ou menos 20 graus Celsius. Temperaturas mais baixas podem proporcionar maior estabilidade de vida útil. Utilizando este protocolo, até dois litros de OMS concentrado podem ser produzidos em 90 minutos.

A visualização de uma amostra de 10 microlitros de OMS por microscopia óptica revelou OMS esféricas, bem como uma quantidade relativa de detritos lipídicos. Quando a mesma amostra de OMS foi avaliada por dispersão óptica, o diâmetro médio das partículas foi de 2,624 ± 0,332 micrômetros. Mais de 90% das OMS tinham diâmetro inferior a 10 micrômetros e a população era politrópica.

A viscosidade da emulsão dependia fortemente da fração de gás e, portanto, da concentração de microbolhas. Aliquotas de dois mililitros de emulsão de LOM a 60, 70 e 90 por cento em volume de gás foram estudadas utilizando um varredura de fluxo em regime permanente com uma placa paralela de 40 milímetros.

A geometria conforme a tensão variou de 0,1 a 1000 past gass OMS contendo 60 por cento em volume de gás exibiu um perfil radiológico semelhante ao do sangue humano. O teor de oxigênio da OMS foi testado adicionando-se volumes variáveis de oxigênio contidos em OMS com 60 por cento em volume a alíquotas de sangue humano dessaturado com um déficit de oxigênio conhecido. A relação entre o volume de oxigênio adicionado dentro da OMS e o aumento volumétrico no teor de oxigênio do sangue foi de 1,053 mais ou menos 0,03025.

Sugerindo que os OMS testados contenham quase 100% de oxigênio apresentaram poucos bolsões de gás aprisionado e transferem efetivamente toda a sua carga de oxigênio para o sangue humano in vitro. Uma vez dominada, esta técnica pode ser usada para fabricar dois litros de LMS em 90 minutos, se for realizada correta e eficientemente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter a inspeção visual dos OMS acumulados e realizar controle de qualidade na concentração da espuma de LOM. Após este procedimento de fabricação, os OMS podem ser usados para injeção intravenosa em larga escala e entrega de gases terapêuticos.