Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

O objetivo geral deste procedimento é observar as mudanças dinâmicas na proteína FTSZ durante a divisão celular em bactérias. Isso é feito aplicando células sutis de bacilo que expressam a fusão FTS disse GFP na superfície de uma pequena almofada de aros. A almofada é então invertida e transferida para uma placa de Petri com um fundo de lamínula de vidro.

O segundo passo é adquirir imagens de lapso de tempo da bactéria durante a divisão celular usando uma microscopia de iluminação estruturada 3D ou um sistema de imagem 3D SIM. Em seguida, a qualidade dos dados brutos é avaliada e as imagens com diminuição superior a 30% na intensidade devido ao fotobranqueamento são descartadas. A etapa final é analisar quantitativamente as mudanças na localização da proteína durante a divisão celular, medindo a distribuição da intensidade de fluorescência da proteína F-T-S-Z-G-F-P ao longo do tempo.

Em última análise, o SIM 3D rápido é usado para mostrar o quão dinâmicas são as proteínas diona durante a divisão celular em bactérias. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como a microscopia confocal, é que obtemos informações tridimensionais sobre as mudanças que ocorrem na divisão celular nas células vivas. Embora esse método forneça informações sobre a citocinese bacteriana, ele também pode ser aplicado a outros sistemas em que queremos observar as mudanças dinâmicas de proteínas, como as células de mamíferos M.

Tivemos a ideia para isso pela primeira vez quando vimos imagens tradicionais de simulação 3D de células bacterianas fixas mostrando que a proteína FDZ não estava homogeneamente distribuída ao redor do anel zed. Queríamos examinar melhor se essa distribuição estava ligada a mudanças que ocorreram durante a constrição do anel Zed. Geralmente, os indivíduos que são novos nessa técnica terão dificuldades devido à falha em combinar o índice de refração de seu óleo com sua amostra, e isso levará a imagens de baixa qualidade.

Para preparar as células mais sutis do bacilo para imagens, cultive as células até a fase exponencial intermediária, conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, prenda uma armação adesiva em uma lâmina de microscópio de vidro padrão, removendo primeiro a fina folha de poliéster. Em seguida, aplique a superfície adesiva exposta da moldura na superfície da lâmina do microscópio para criar efetivamente um poço quadrado na parte superior da lâmina, deixe a folha de poliéster grossa presa à estrutura para evitar a aderência da lamínula nas etapas subsequentes.

Em seguida, derreta uma solução de aro no microondas até ferver pipeta 67 microlitros do aros derretido na moldura adesiva. Coloque imediatamente uma lamínula em cima do aros para criar uma superfície plana e deixe em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Remova a lamínula por um a dois minutos enquanto a amostra é colhida.

Colher uma alíquota de um mililitro da amostra após centrifugação a 8 000 RPM para os segundos de decantar o sobrenadante ressuspender o pellet em 200 microlitros de meio fresco. Pegue 2,5 microlitros da amostra concentrada e pipete para a almofada aros pré-preparada. Espalhe a amostra uniformemente ao longo da superfície plana da almofada aros.

Em seguida, remova a moldura adesiva da lâmina do microscópio usando uma pinça sem tocar na almofada aros. Transfira a almofada aros do microscópio. Deslize para uma placa de Petri de 35 milímetros de diâmetro com um fundo de lamínula de vidro.

Para imagens de alta resolução. Inverter a almofada aros de modo a que a suspensão da célula fique em contacto com a lamínula da placa de Petri. No dia do experimento, ligue o sistema de imagem OMX 3D SIM pelo menos uma hora antes da imagem para permitir que o sistema e os lasers se estabilizem totalmente.

Em seguida, ligue os diferentes componentes conforme listado no protocolo de texto na estação de trabalho do controlador mestre. Abra o software OMX clicando no ícone. Defina o caminho do arquivo para salvar dados em uma pasta de dados apropriada.

Em seguida, inicie o software de trabalho suave. Ligue os lasers necessários para os experimentos na tela principal na seção de parâmetros de luz. Ative a câmera FITC na seleção de canal e prossiga para verificar os parâmetros listados no protocolo de texto.

Aplique uma gota de óleo no topo da objetiva. Coloque a amostra de placa de Petri contendo as células preparadas no stage inserção e cubra com a tampa de aquecimento circular. Abaixe o stage até que o óleo toque o fundo da placa de Petri de amostra.

Deixe o prato aquecer por 15 minutos No stage usando uma configuração de baixa exposição, concentre-se na amostra usando os controles do estágio de posicionamento nano. Foque para cima e para baixo através da amostra para determinar se a luz está espalhada uniformemente acima e abaixo do plano focal da amostra. Em seguida, use tamanhos de passo de 0,5 mícron e marque a parte superior e inferior da pilha de imagens antes de retornar ao meio da amostra na guia do experimento, clique no botão obter espessura para definir a espessura de aquisição da amostra.

Determine o valor máximo de intensidade da imagem de amostra com a exposição atual e a porcentagem de configurações de luz transmitida. Esse valor é encontrado abaixo da janela de imagem. Para imagens com lapso de tempo, ajuste a exposição e a porcentagem de luz transmitida para obter uma intensidade máxima de 1100 a 1400.

Acima do fundo. Para a imagem, ative a seção de lapso de tempo na guia do experimento. Defina a taxa de quadros necessária e o tempo total no arquivo de dados.

Insira um nome de arquivo apropriado. Clique no botão Executar para iniciar a aquisição da imagem no início da aquisição da imagem. Observe o valor máximo de intensidade da imagem no início da aquisição da imagem para o primeiro quadro da série temporal.

Ao final da aquisição do primeiro quadro, verifique se não houve mais do que uma diminuição de 10% na intensidade do sinal através do Zack para este primeiro quadro. No final da aquisição da série temporal, abra o arquivo de imagem bruta resultante com um sufixo DV e verifique a diminuição da intensidade máxima do sinal desde o início da série temporal até a imagem final. Descarte todos os pontos de tempo em que houve mais de 30% de branqueamento de fotos do menu de processo, ative a janela de reconstrução SI.

Use as configurações preexistentes para todos os parâmetros. Ative o botão OTF específico do canal usado e defina para o conjunto de filtros padrão. Ative o botão de ângulos KO específicos do canal usado e defina para o conjunto de filtros padrão.

Arraste e solte o arquivo bruto no espaço do arquivo de entrada. Clique em fazer. Examine a distribuição de FTSZ ao redor do anel Z para criar gráficos de intensidade 3D.

Em seguida, abra um arquivo de imagem 3D. Para exibir as fatias z individuais. Use a ferramenta de visualização de volume localizada na guia do menu de visualização.

Para cortar uma região de interesse, insira o número da janela para esta imagem 3D na janela de entrada e insira um número de janela novo e não utilizado na janela de saída. O botão selecionar região ficará disponível para cortar um anel Z individual de interesse do campo de visão original de 40 por 40 mícrons. Ajuste o eixo desejado e o grau de rotação na guia de rotação.

Clique no botão fazer. Percorra o volume para obter a perspectiva desejada, o anel Z. Use a ferramenta de inspetor de dados para ajustar as dimensões da linha de coluna para criar uma nova região de interesse em torno de um anel Z individual.

Clique no centro da imagem para posicionar essa nova região de interesse. Os dados da imagem de texto são uma tabela gerada automaticamente que exibe a intensidade de fluorescência de cada pixel dentro da região de interesse. Clique no botão Gráfico 3D para visualizar inicialmente o gráfico de intensidade.

Como alternativa, os dados da imagem de texto podem ser exportados clicando no botão salvar dados da tabela. No menu de arquivo, copie os dados da imagem do arquivo de texto salvo em uma nova planilha. Selecione todas as células dentro da planilha e crie um novo gráfico de superfície 3D.

Formate o gráfico de plotagem de intensidade 3D para publicação de dados de lapso de tempo. Repita essas etapas em cada um dos diferentes pontos de tempo do arquivo de imagem 3D. Quando visualizado por microscopia de fluorescência de campo amplo convencional, o anel Z aparece como uma única banda transversal de fluorescência em bacilos sutis.

A intensidade de fluorescência em toda esta banda é uniforme. O padrão de localização oferece pouca visão sobre a organização estrutural e distribuição dos polímeros FTS dentro do anel aqui, as mesmas células são examinadas. Usando o método FAST 3D sim.

A rotação da imagem 3D do simulador em torno do eixo Z permite a visualização do anel Z como uma estrutura de anel genuína no espaço tridimensional. A melhoria na resolução permite a visualização da distribuição heterogênea de FTSZ dentro do anel. Exemplos adicionais de anéis Z de Bacillus visualizados por esta técnica ilustram como a intensidade de fluorescência ao redor do anel Z nunca é a mesma.

Além disso, observam-se regiões de intensidade ou lacunas de fluorescência muito baixas. Para quantificar essas observações, foram criados gráficos de intensidade 3D do anel Z. Os gráficos de intensidade mostram que a quantidade de fluorescência pode variar até quatro vezes em diferentes regiões do anel Z mais sutil do bacilo.

Os gráficos de intensidade 3D mostram que as lacunas quase leem os níveis de linha de base da fluorescência de fundo para analisar as mudanças dinâmicas que ocorrem dentro do anel Z. Com o tempo, o lapso de tempo do simulador 3D é executado. Este filme mostra como o FTSZ dentro do anel Z sutil do bacilo está em constante mudança e é medido com um gráfico de intensidade que é gerado para cada imagem.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar e preparar células bacterianas, como imaginá-las usando o 3D Sim, como analisá-las para obter dados quantitativos e, finalmente, como fornecer imagens com qualidade de apresentação. É muito importante durante a aquisição de imagens monitorar a saúde de suas células e também monitorar o nível de expressão da proteína fluorescente durante a aquisição após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para que outras pessoas no campo da biologia celular bacteriana usassem outros métodos de microscopia de super-resolução e localizassem outras proteínas bacterianas em diferentes organismos.

Após este procedimento, outras formas de microscopia de super-resolução podem ser realizadas, como microscopia de localização fotoativada para observar as mudanças dinâmicas na referida proteína FDS ao longo do tempo.