Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial

A inibição pré-sináptica é um dos mecanismos inibitórios mais potentes na medula espinhal. Alterações patológicas na inibição pré-sináptica estão envolvidas em vários mecanismos de doenças. Por exemplo, dor neuropática e inflamatória, bem como processamento anormal da dor central.

É importante em lesões da medula espinhal e em distúrbios do sistema nervoso central com hiperexcitabilidade motora. Assim, ao investigar modelos animais desses distúrbios, conhecer a intensidade da inibição pré-sináptica forneceria informações significativas. Apresentamos aqui um método para avaliar a inibição pré-sináptica em um modelo de camundongo.

A inibição pré-sináptica in vivo é mediada pela despolarização das fibras aferentes primárias, que é induzida por sinapses axo-axonais GABAérgicas sobre as fibras pré-sinápticas sensoriais. A atividade do receptor GABA_A leva a um aumento na condutância de cloreto, o que então provoca a despolarização aferente primária devido à distribuição iônica local. Essa despolarização bloqueia a propagação dos potenciais de ação até os terminais axonais e reduz sua intensidade, resultando em uma diminuição da entrada de cálcio e na redução da liberação do neurotransmissor.

Assim, os potenciais pós-sinápticos excitatórios em neurônios monossinápticos podem ser inibidos sem alterar o potencial da membrana pós-sináptica e a excitabilidade dos potenciais conduzidos pelo volume dos neurônios modernos; a despolarização primária desses potenciais fornece uma medida direta da inibição pré-sináptica na medula espinhal, e esses potenciais podem ser medidos nas raízes dorsais da medula espinhal após estimulação, sendo denominados potenciais das raízes dorsais. A medição dos potenciais das raízes dorsais é bem estabelecida e tem sido amplamente utilizada em gatos, ratos e sapos, mas em camundongos, os registros foram realizados quase exclusivamente em preparações ex vivo de medula espinhal isolada. Aqui descrevemos um método para registrar esses potenciais das raízes em camundongos anestesiados in vivo, permitindo uma medida direta da inibição pré-sináptica no organismo intacto.

Para a gravação de DRP em camundongos in vivo, o seguinte equipamento é necessário. Instrumentos cirúrgicos padrão, um microscópio estereoscópico e três micromanipuladores para posicionar respectivamente o eletrodo de estimulação, o eletrodo de gravação e o eletrodo de referência. Além disso, um estereotáxico para camundongo e um sistema de aquecimento para controlar a temperatura corporal do camundongo durante a estimulação e a gravação, isoladamente ou com estimulador.

Um amplificador padrão e uma coleta de dados são necessários para melhorar a relação sinal-ruído. Durante a gravação do DRP, eletrodos de seção feitos sob medida são necessários para a fabricação dos mesmos. Puxe tubos de vidro convencionais com um puxador de micropipetas padrão.

Quebre a ponta do eletrodo usando uma lima de diamante para alargar a abertura da ponta. Polir a ponta com uma chama padrão de laboratório para suavizar a extremidade. Antes de iniciar o preparo, anestesie o animal com uma injeção intraperitoneal de quetamina e fixe a cabeça do camundongo dentro do estereotáxico.

Em seguida, teste a profundidade da anestesia pinçando o membro posterior (PO) do camundongo. Inicie o preparo somente quando não for observada nenhuma retirada do PO; a profundidade da anestesia deve ser verificada repetidamente durante o procedimento. Injeções repetidas de cetonamina no músculo quadríceps posterior.

Prologar a anestesia, monitorar a temperatura corporal do animal com o sensor retal. Para a preparação da coluna dorsal. Abrir a pele ao longo da linha média dorsal.

Solte a pele do tecido subjacente para separar a vértebra do tecido conjuntivo ao redor. Faça dois cortes em ambos os lados da coluna vertebral e alargue os cortes empurrando o tecido para os lados com o bisturi. Em seguida, remova os processos espinhosos S usando uma pequena pinça óssea.

Iniciando nos níveis lombares. Prosseguir para os níveis torácicos médios para evitar o ressecamento dessa ferida operacional. Colocar pequenos pedaços de gaze ao redor da ferida e umedecê-los com cloreto de sódio 0,9%.

Em seguida, inicie o preparo da medula espinhal começando pela região lombar. Empurre cuidadosamente a ponta do estilete ósseo no espaço entre duas vértebras adjacentes. Tenha especial cuidado para reduzir ao máximo a pressão aplicada sobre a medula espinhal.

Prossiga para os níveis torácicos úmidos na medula espinhal com fluido cerebroespinhal artificial. Faça isso repetidamente durante todas as etapas subsequentes. Abra o durometro cuidadosamente usando uma agulha de 30 furos.

Em seguida, solte e separe duas raízes adjacentes ipsilaterais da coluna vertebral. Depois, corte as raízes o mais distal possível. Durante o procedimento.

Evite puxar excessivamente as raízes, pois isso acabará prejudicando um registro bem-sucedido do PDR. Após posicionar o eletrodo de referência próximo à medula espinhal, mova a ponta de um dos eletrodos de seção para uma proximidade próxima da extremidade proximal de uma raiz dorsal. Em seguida, posicione a raiz dorsal sobre a abertura da ponta do eletrodo de sucção.

Em seguida, aspire a raiz dorsal para dentro do eletrodo aplicando uma pressão negativa breve por meio de uma seringa conectada ao eletrodo. Então, preencha o eletrodo com LCR enquanto aplica uma pressão negativa contínua e baixa até que a solução envolva tanto a raiz dorsal quanto o fio de cloreto de prata dentro do eletrodo. Posteriormente, levante a ponta do eletrodo da medula espinhal para que nenhuma ponte líquida cause curto-circuito no eletrodo.

Repita os passos para a segunda raiz ipsilateral adjacente. Uma vez que ambos os eletrodos estejam posicionados, inicie a gravação dos potenciais da raiz dorsal estimulando uma via enquanto grava da outra, aumentando a voltagem do estímulo até níveis supramáximos. Os registros típicos dos potenciais da raiz dorsal são semelhantes ao mostrado no painel esquerdo.

Um breve artefato de estimulação é seguido por uma pequena deflexão positiva e uma deflexão negativa prolongada. A última deflexão é o potencial real da raiz dorsal. Sua amplitude pode ser calculada em relação à linha de base registrada imediatamente antes do registro do estímulo.

Várias trilhas de um par de raízes podem conter artefatos provocados por movimentos respiratórios e/ou artefatos de EKG que podem interferir no PRD registrado. Após um registro bem-sucedido, é possível trocar o local de estimulação e registro e realizar um segundo registro. O método apresentado de registro.

Medir os potenciais da raiz no meu modelo in vivo permite a avaliação da entrada primária, da despolarização e do animal intacto, especialmente em combinação com camundongos geneticamente modificados. Pode ser uma ferramenta poderosa para investigar os mecanismos subjacentes à inibição espinhal. A integração espinhal é fundamental para a função motora e a percepção sensorial multimodal.

Este método é útil em pesquisas que abordam dor, lesão da medula espinhal, lesão do nervo periférico e inflamação. O registro do DRP in vivo permite analisar as interações entre a atividade supramedular e o pad. Isso não é possível em preparações isoladas da medula espinhal, geralmente utilizadas para medir o DRP em camundongos.

Em princípio, é possível aplicar medicamentos na medula espinhal durante a gravação. A aplicação local por meio de pipetas adicionais poderia aumentar e acelerar o controle da concentração local do medicamento.