A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a capacidade de deformação de diferentes tipos de células usando um ensaio simples baseado em microfluídica. Isso é obtido fabricando um dispositivo microfluídico polidimetil suboxano ou PDMS para sondar a escala de tempo do trânsito celular através de uma sequência de escala de mícrons O fluxo acionado por pressão de constrição é então usado para conduzir as células através de seus canais microfluídicos, o que permite que a deformação e o relaxamento dependente do tempo de células individuais sejam testados. Em seguida, o programa automatizado de análise de imagem é executado para processar os vídeos e obter um histograma dos dados do tempo de trânsito.

Os resultados mostram que diferentes tipos de células exibem diferenças na capacidade de deformação celular com base em seu tempo de trânsito através de uma série de constrições. A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como microscopia de força atômica ou aspiração de micropipeta, é que os dispositivos microfluídicos podem operar com sucesso com altas capacidades de rendimento. Enquanto outros dispositivos microfluídicos também podem ser usados para testar a deformabilidade da célula.

Projetamos nosso dispositivo para que as células passem por constrições sequenciais, uma geometria comum em contextos fisiológicos como o leito capilar pulmonar. Para começar, projete o dispositivo microfluídico selecionando a largura dos canais da matriz de constrição para ser de aproximadamente 30 a 50% do diâmetro médio da célula e a altura do canal para ser de pelo menos 50% do diâmetro da célula. Inclua um filtro nas portas de entrada para remover detritos e desagregar aglomerados de células.

Antes de iniciar o experimento, fabrique o mestre do dispositivo usando técnicas padrão para microusinagem litográfica. Verifique a altura das feições de padrão usando um perfilômetro. Em seguida, repare a fonte de ar para fluxo acionado por pressão usando um tanque de ar comprimido e uma sequência de reguladores e conexões de ar.

Primeiro configure um tanque de suprimento de ar e um regulador manual. Em seguida, configure um regulador de pressão controlado eletronicamente de acordo com o regulador manual. Use o código simples escrito no LabVIEW para inserir a pressão desejada.

O conversor eletropneumático usa um loop de feedback interno para ajustar a pressão de saída da válvula para corresponder à pressão especificada no dispositivo microfluídico. Configure uma câmara pressurizada para conduzir o fluxo da suspensão da célula, montando uma câmara de suspensão da célula a partir de um tubo de citômetro de fluxo padrão e uma tampa usinada que cria uma vedação à prova de pressão no tubo. A tampa da câmara de pressão contém dois orifícios, uma entrada que se conecta ao tanque de ar comprimido e uma saída através da qual as células fluem da câmara pressurizada para o dispositivo.

Em seguida, configure um microscópio invertido equipado com uma câmera que tenha uma taxa de aquisição de pelo menos 100 quadros por segundo. Para capturar imagens das células que fluem através da matriz de constrição, prepare uma solução de surfactante em solução salina tamponada com fosfato ou PBS, pois a adição de uma pequena quantidade de surfactante à solução de mídia celular ajudará a minimizar a adesão celular às paredes do PDMS. Para fabricar o bloco PDMS com canais microfluídicos, adicione um grama de agente de cura a 10 gramas de base PDMS e misture bem.

Despeje a mistura sobre o dispositivo. Domine Degas em uma redoma com vácuo aplicado até que as bolhas presas desapareçam, ou por cerca de 10 a 20 minutos. Após esse tempo, ainda pode haver bolhas na interface do AIR PDMS, o que é normal.

Estes normalmente se dissipam durante o cozimento. Em seguida, asse o dispositivo Degas a 65 graus Celsius por quatro horas após o resfriamento do dispositivo. Remova os dispositivos microfluídicos do molde mestre.

Comece levantando suavemente um canto do dispositivo. Descascamento lento e suave em vez de levantar O bloco PD DMS para cima reduz o estresse tanto no PDMS quanto no mestre Corte dispositivos microfluídicos individuais do bloco PDMS com uma lâmina de barbear e remova o dispositivo do mestre Faça furos no dispositivo PDMS para criar portas de conexão para acesso entre a tubulação e os microcanais. Faça furos do lado do canal até o lado externo do dispositivo usando um punção de biópsia.

Enxágue o dispositivo PDMS com isopropanol para remover a poeira e alojar pedaços de PDMS. Certifique-se de que os orifícios perfurados estejam livres de detritos, direcionando um fluxo constante de isopropanol puro de um frasco de aperto através dos orifícios. Seque com ar filtrado.

Limpe o substrato de vidro enxaguando com metanol. Em seguida, seque com ar filtrado e coloque em uma placa quente de 200 graus Celsius por cinco a 10 minutos para garantir que o vidro esteja completamente limpo e seco antes do tratamento com plasma. Conforme detalhado no protocolo de texto, inspecione o dispositivo microfluídico sob um microscópio.

Certifique-se de que os canais não estejam recolhidos ou quebrados e que os orifícios de entrada e saída se conectem diretamente aos canais do dispositivo usando uma objetiva de baixa potência. Coloque a suspensão celular em um tubo citômetro de fluxo e conecte à tampa de pressão antes de conectar a tubulação ao dispositivo microfluídico, ajuste a pressão para cerca de 14 a 21 quilopascais e lave até que a suspensão celular saia da ponta da tubulação. Em seguida, coloque o dispositivo em uma superfície plana para inserir a tubulação na entrada do dispositivo.

Como a lamínula de vidro colada na parte inferior do dispositivo PDMS é frágil. Insira a ponta do tubo que contém a suspensão da célula na entrada do dispositivo. Em seguida, insira um pedaço de tubo na porta de saída e encaminhe-o para um tubo vazio para coleta de resíduos, como um tubo Falcon vazio colado na lateral da platina do microscópio.

Aumente suavemente a pressão para cerca de 28 quilopascais ou até que as células fluam pelos canais. Posicione o dispositivo de forma que vários canais estejam no campo de view e perpendiculares à parte inferior da tela. Para iniciar a análise de dados, abra o arquivo m do script mestre e execute o programa.

Selecione o primeiro vídeo a ser analisado na janela do Windows Explorer que aparece. Especifique a taxa de quadros para o vídeo selecionado e pressione Enter. Aparecerá uma figura solicitando que o usuário selecione uma janela de corte retangular.

Para o primeiro vídeo, selecione uma janela que englobe todos os canais da esquerda para a direita e cruze os canais logo acima da primeira lâmpada da matriz de canais. Na parte superior e inferior, selecione as regiões de constrição da imagem cortada. O algoritmo exibe a segmentação de células para os primeiros 50 quadros de cada vídeo.

Monitore a imagem superior esquerda de perto para determinar se o algoritmo está localizando células com precisão. Uma imagem izada é sobreposta ao vídeo de origem. Para demonstrar a localização das células identificadas, selecione o próximo vídeo a ser processado na janela do Windows Explorer.

O algoritmo se repetirá. Para cada vídeo selecionado, selecione cancelar. Uma vez que todos os vídeos desejados tenham sido adicionados através da janela do Windows Explorer para instruir a função de que a lista de vídeos está completa, os resultados representativos para o tempo de trânsito das células HL 60 e neutrófilos tipo HL 60 mostram a escala de tempo para uma única célula transitar por uma série de trânsitos de constrições.

O tempo é medido para uma população de células individuais a cada constrição de sete micrômetros em uma série de sete constrições. A uma pressão motriz de 28 quilopascais HL, 60 células ocluem temporariamente a primeira constrição por um tempo médio de 9,3 milissegundos antes de se empacotarem através das constrições subsequentes. Por outro lado, as células neutrófilas tipo HL 60 ocluem a primeira constrição por apenas 4,3 milissegundos antes da embalagem.

Uma vez através da primeira constrição, as células transitam mais rapidamente através das constrições restantes de dois a sete, com um tempo médio de trânsito de 4,0 milissegundos para as células HL 60 e 3,3 milissegundos para as células do tipo neutrófilo. Ao comparar o tempo de trânsito entre as populações de células, as diferenças na informabilidade celular podem ser reveladas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a capacidade de deformação de diferentes tipos de células usando o ensaio microfluídico simples.

Aqui, o fluxo acionado por pressão é usado para conduzir as células através de canais microfluídicos, o que permite a deformação e o relaxamento de células individuais para serem testadas.