Name: A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a medir a deformabilidade celular usando dispositivos microfluídicos de PDMS com fluxo por pressão. Esta técnica de alta vazão permite analisar o tempo de trânsito de células através de constrições em escala micrônica.

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Os autores gostariam de agradecer Lloyd Ung para entrada construtiva nas primeiras versões dessa técnica, o Dr. Jeremy Agresti para dicas de design da tampa de pressão, e Dr. Dongping Qi por sua ajuda na fabricação da tampa de pressão. Somos gratos aos laboratórios de M. Teitell e P. Gunaratne para fornecer uma variedade de amostras de células para testes. Somos gratos à Fundação Nacional de Ciências (Prémio Carreira DBI-1254185), o Comprehensive Cancer Center da UCLA Jonsson, ea UCLA Clinical and Translational Science Institute para apoiar este trabalho.

1. Microfluidic Dispositivo Projeto NOTA: O projeto do dispositivo tem quatro regiões funcionais básicos: porta de entrada, filtro celular, matriz constrição, e porta de saída (Figura 1). A concepção geral pode ser aplicada a uma grande variedade de tipos de células, com ajustamentos menores dimensões. Desde que aqui estão algumas recomendações de projeto básico, juntamente com os parâmetros do dispositivo que são eficazes para a seleção de ambas as células primárias e imortalizadas. <ol><li> Seleccione a largura dos canais de constrição da matriz (Figura 1B) ser de aproximadamente 30-50% do diâmetro médio de célula; esta constrição-célula de tamanho resultados em relação deformação celular significativa, mas o entupimento mínima. Dado um tipo de célula que não tenha sido previamente testado, é prudente para projetar uma variedade de larguras de constrição de ~ 30-50% do diâmetro celular para encontrar a largura ideal. Tal como acontece com muitos tipos de dispositivos microfluídicos, mais de 120 moldes de mestre do dispositivo pode ser modelado em um pecadogle bolacha de silício de 4 polegadas, permitindo uma variedade de diferentes modelos de dispositivos de ser fabricado num processo de fabricação. </li><li> Seleccione a altura do canal de ser, pelo menos, 50% do diâmetro da célula; isto assegura a célula está confinada em duas dimensões. Para evitar o colapso do canal durante a ligação, certifique-se que a relação de aspecto de canal nada menos que 1:10 é (altura: largura) em todo o dispositivo. Para os canais que devem ultrapassar esta relação de aspecto, adicionar mensagens de apoio para evitar o colapso. Mensagens de apoio Espaço, a uma distância que é pelo menos duas vezes o diâmetro da célula, para não impedir o fluxo de células. </li><li> Incluir um filtro para as portas de entrada para remover detritos e desagregar grupos de células (Figura 1B). Ajustar o tamanho e espaçamento das mensagens de filtro de modo a que a distância que separa os dois postes é aproximadamente igual a um diâmetro da célula. NOTA: O limite inferior de tamanho recurso é definido pela resolução com que a máscara de litografia é impresso. Certifique-se que todos os recursos estão dentro dos resolução limite especificado pelo fornecedor máscara. </li></ol> 2. Suprimentos e Preparação NOTA: Antes de iniciar qualquer experimento, os seguintes itens devem estar preparados. Um esquemática de toda a configuração é dado na Figura 1. <ol><li> Fabricar o mestre dispositivo utilizando técnicas padrão para micromachining litográfica 14,15. Verificar a altura das características padronizadas utilizando um perfilómetro. NOTA: Enquanto mestres podem ser facilmente fabricado em uma instalação de sala limpa, alguns laboratórios desenvolveram métodos de litografia de baixo custo para uso em um ambiente semi-limpo 16,17. </li><li> Prepare a fonte de ar de fluxo accionado por pressão, utilizando um tanque de ar comprimido e a sequência de reguladores de ar e acessórios (Figura 1A). <ol><li> Configurar um tanque de alimentação de ar e regulador manual. Observação: Uma composição de 5% de CO 2 em ar mantém um ambiente semelhante como uma cultura de células incubato típicor, mas outras misturas de gases que pode também ser utilizado. </li><li> Configure um regulador de pressão controlada eletronicamente em linha com o regulador manual. Use um conversor eletro-pneumático para regular e manter uma queda de pressão estável ao longo dos canais, com flutuações de pressão de menos de 2 kPa. Use o código simples escrito em LabVIEW (Informações Complementares) para introduzir a pressão desejada. NOTA: O conversor electro-pneumático usa um ciclo de feedback interno para regular a pressão de saída da válvula, para corresponder à pressão indicada através do dispositivo de microfluidos. </li><li> Configurar uma câmara pressurizada para dirigir o fluxo da suspensão de células. Montar uma câmara de suspensão de células de citómetro de fluxo padrão de um tubo e uma tampa maquinada que cria uma vedação estanque à pressão sobre o tubo. NOTA: A tampa da câmara de pressão contém dois orifícios: uma entrada que liga o reservatório de ar comprimido e uma saída através da qual as células de fluxo a partir da câmara sob pressão no interior do dispositivo (Figure 2). </li></ol></li><li> Configure um microscópio invertido equipado com uma câmara que tem uma taxa de aquisição de pelo menos 100 frames por segundo para capturar imagens das células que fluem através da matriz constrição. Interface com a câmera com uma placa de captura de vídeo e um computador. </li><li> Prepara-se uma solução do tensioactivo de 10% w / w de Pluronic F-127 em tampão fosfato salino (PBS) como a adição de uma pequena quantidade de solução de F127 para o meio celular vai ajudar a minimizar a adesão das células às paredes PDMS. Para preparar a solução de F127, vortex e aquece-se suavemente a 37 ° C para dissolver o F127. Antes do uso, passar a solução através de um filtro de seringa de 0,2 um e armazenar à temperatura ambiente. Preparar a solução de tensoactivo antes de vórtice e filtragem irá gerar bolhas que persistem durante mais de 24 horas. </li></ol> 3. fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> Fabricar bloco de PDMS com canais microfluídicos. <ol><li> Mix PDMS completamente umta proporção de 1:10 (w / w) do agente de cura à base. </li><li> Despeje a mistura sobre o mestre dispositivo (Passo 2.1). Degas em uma redoma de vidro com vácuo aplicado até que as bolhas aprisionadas desaparecer, ou por cerca de 10-20 min. Nota: Após este tempo, podem ainda existir bolhas na interface ar-PDMS, o que é normal; estes normalmente dissipar durante o cozimento. É mais importante para garantir que não existem remanescentes bolhas adjacentes aos canais. </li><li> Coza no dispositivo desgaseificada a 65 ° C durante 4 h. Para evitar que os canais entre em colapso, o dispositivo de cozer durante a noite para reticular mais os PDMS para um dispositivo com um maior módulo de elasticidade que é mais resistente ao colapso do canal. No entanto, nota que se estendeu de cozimento também embrittles os PDMS e pode levar a fissuras quando perfurando (Passo 3.3). </li></ol></li><li> Remover dispositivos microfluídicos do molde mestre. Corte dispositivos microfluídicos individuais fora do bloco de PDMS com uma lâmina de barbear e remover o dispositivo do mastroer. Comece tirando delicadamente um canto do dispositivo; descamação lento e suave, ao contrário de levantamento do bloco de PDMS para cima, reduz a tensão em ambos os PDMS e o mestre. </li><li> Faça furos no dispositivo de PDMS para criar portas de conexão para acesso entre a tubulação e microcanais. Criar buracos usando um punção de biópsia e perfurar a partir do lado do canal através do lado exterior do dispositivo. NOTA: A biópsia por punção com diâmetro 0,75 milímetros cria buracos que a interface perfeitamente com polieteretercetona (PEEK) tubulação (diâmetro externo = 1/32 &quot;ou 0,79 milímetros) ou tubos de polietileno (PE-20, diâmetro externo = 0,043&quot; ou 1,09 milímetros ). Use um anel de luz para ajudar a visualizar buracos em dispositivos com canais rasos 18. Certifique-se o punção biópsia é nítida; após o uso repetido de ponta embota eo soco biópsia deve ser descartado e substituído. </li><li> Lavar o dispositivo PDMS com isopropanol (grau HPLC) para remover a poeira e nela pedaços de PDMS. Verifique se ofuros são livre de detritos, direcionando um fluxo constante de isopropanol puro a partir de um frasco de pressão através dos orifícios. Seque com ar filtrado. Após a limpeza, coloque os blocos de PDMS com canais enfrentam-se em uma placa de Petri limpa para manter a limpeza do dispositivo. Se necessário, dispositivos de armazenamento de desta forma até que a ligação. </li><li> Limpe o substrato de vidro por lavagem com metanol (grau HPLC), seque com ar filtrado, e coloque em um 200 ° C fogão para 5-10 min para garantir o copo está completamente limpo e seco antes do tratamento de plasma. NOTA: O substrato de vidro forma o fundo de cada canal. Tipicamente, uma lâmina de vidro é suficiente, uma vez que uma objectiva 10X ou 20X é ideal para imagiologia de múltiplos canais em paralelo. Para uma maior resolução de imagem, ligar o dispositivo a uma lamela (# 1.5 espessura). </li><li> Ligar o dispositivo de PDMS ao substrato de vidro. <ol><li> Plasma de oxigénio tratar lado do canal do bloco de PDMS e um lado de uma lâmina de vidro. NOTA: Wom uma unidade de descarga de mão, utilizar um tempo de tratamento de 1 minuto, mas optimizar o tempo de tratamento para cada aparelho de plasma de oxigénio. </li><li> Coloque o lado do canal do PDMS no topo do lado tratado do vidro imediatamente após o tratamento. </li><li> Segure com uma leve pressão para ~ 10 segundos para promover a ligação. Asse todo o dispositivo a uma temperatura elevada (60-80 ° C) durante pelo menos 15 minutos para melhorar a força de ligação. </li></ol></li></ol> 4. Deformação células através de canais constrição <ol><li> Inspeccionar o dispositivo de microfluidos sob um microscópio. Certifique-se de que os canais não são recolhidos ou quebrado e que ambos os orifícios de entrada e de saída, ligar diretamente para os canais de dispositivo usando uma objectiva de baixa potência (10x). Designar dispositivos defeituosos, marcando a superfície do PDMS com uma lâmina de barbear e não usá-los para experiências. </li><li> Preparar as amostras de cultura de células a ser ensaiadas. Células de cultura, usando condições padrão. <ol><li> Fou exemplo, cultura de células HL-60 em meio RPMI-1640 suplementado com solução de penicilina-estreptomicina a 1% e 10% de soro fetal bovino em 5% de CO2 numa estufa a 37 ° C. </li><li> Para as células aderentes, colhê-los por tripsinização e ressuspender em meio de crescimento fresco. Use um protocolo de tripsinização padrão; por exemplo, adicionar ~ 0,5 ml de tripsina a um frasco de 25 cm 2, a área de cultura, e ressuspender em ~ 30 mL de meio fresco. Diferenciar células HL-60 em células do tipo de neutrófilos pelo ácido all-trans retinóico (ATRA), a uma concentração final de 5 mM por 1 x 10 5 células / ml como previamente descrito 19,20. </li><li> Centrifugar as células a 300 xg durante 3 minutos, cuidadosamente aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com a densidade final adequada em meio de cultura fresco com 0,1% v / v de F-127. </li></ol></li><li> Contar as células usando um contador Coulter, hemocitômetro, ou citometria de fluxo. Ajustar a suspensão de células para uma densidade de 1 × 10 6 a 5 X 10 <sup&gt; 6 células / ml. Uma vez que a densidade da suspensão é ajustado, aproximadamente, com suplemento de 0,1% v / v de F-127. NOTA: A densidade celular e a concentração de surfactante podem precisar de ser modificado em função dos sistemas de células específicas; Tabela 1 fornece um registo de concentrações usadas anteriormente e de células F-127 para os diferentes tipos de células. </li><li> Coloque suspensão de células em um citômetro de fluxo tubo e conectar-se à tampa de pressão. Antes de ligar a tubagem para o dispositivo de microfluidos, ajustar a pressão para cerca de 14-21 kPa e lavar a suspensão de células até que emerge a partir da ponta do tubo. Isso vai ajudar a minimizar bolhas de ar na tubulação e dispositivo. </li><li> Inserir a extremidade do tubo contendo a suspensão de células para dentro da entrada do dispositivo. Se o dispositivo estiver ligado a uma lamela, colocar o dispositivo sobre uma superfície plana, sólida, tal como a platina do microscópio antes de ligar a tubagem; a lamela é frágil e pode quebrar o contrário. </li><li> Coloque um pedaço de tubo into orifício de saída e encaminhá-lo para um tubo vazio para a recolha de resíduos, tal como um tubo Falcon de vazio para o lado gravado de platina do microscópio. Para consistência na resistência fluídica global do dispositivo entre experiências, assegurar que o tubo de entrada e saída são do mesmo diâmetro e, aproximadamente, o mesmo comprimento para cada experimento. </li><li> Suavemente rampa até a pressão a cerca de 28 kPa ou até que as células fluem através dos canais. Posicionar o dispositivo de modo que os múltiplos canais está no campo de visão e são perpendiculares à parte inferior do ecrã. Se a câmera é limitada pelo tamanho dos dados, adquirir vários vídeos para gerar um número suficiente de pontos de dados independentes. Ajuste a taxa necessária para a saída de dados desejado quadro. Para capturar mudanças na forma celular, use alta velocidade de imagens em 300 frames por segundo (fps); para medir o tempo de passagem de células, use as taxas de frame de aproximadamente 100 fps. </li></ol> Análise de Dados 5. <ol><li> Abra o arquivo de mastroer_script.m (Downloadable Arquivo Suplementar) e execute o programa. </li><li> Selecione o primeiro vídeo a ser analisado a partir da janela do Windows Explorer que aparece. Especifique a taxa de quadros para o vídeo selecionado e pressione enter. NOTA: A figura aparecerá solicitando que o usuário selecione uma janela de recorte retangular para o primeiro vídeo. </li><li> Escolher a uma janela que engloba todos os canais da esquerda para a direita e intersecta os canais imediatamente acima da primeira lâmpada da matriz de canais, na parte superior e na parte inferior (figura 3). </li><li> Selecione as regiões de constrição da imagem recortada. Preste atenção especial para manter uma distância de pixel fixo entre a parte superior e inferior fronteira janela para cada vídeo selecionado. NOTA: A borda superior da janela especifica a constrição de nível superior ea borda inferior da janela especifica a constrição na extremidade inferior (Figura 4); constrições intermédias são aproximadas a partir desta entrada do usuário. Em seguida, o algoritmo mostra as segmentation das células para os primeiros 50 quadros de vídeo cada (Figura 5). </li><li> Monitorar a imagem da parte superior esquerda (Figura 5A) perto para determinar se o algoritmo for exacta localização de células; uma imagem binarizada é sobreposto sobre o video fonte para demonstrar a localização das células identificadas. NOTA: As diferentes janelas, (Figuras 5B-5D) são para o diagnóstico de código e demonstrar os quadros de vídeo após as operações de processamento de imagem específicos. </li><li> Selecione o próximo vídeo a ser processado a partir da janela do Windows Explorer. NOTA: O algoritmo irá repetir os passos de 5,2-5,5 para cada vídeo selecionado. </li><li> Selecione cancelar uma vez todos os vídeos desejados foram adicionadas através da janela do Windows Explorer para instruir a função que a lista de vídeo está completa. NOTA: O algoritmo irá executar as operações restantes, sem intervenção do usuário. Isso levará cerca de 1-2 horas, dependendo do número de vídeos processados ​​e pe computadorrformance. Após a conclusão, o algoritmo irá produzir um histograma dos dados de tempo de trânsito e salvar os dados no diretório como um arquivo .mat MATLAB e um arquivo xls Microsoft Excel. </li></ol>

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Os autores não têm conflitos de interesse de divulgar.

Aqui nós fornecemos um procedimento experimental abrangente para analisar a deformação das células que transitam através dos canais microfluídicos constricted usando fluxo orientado a pressão. Um script MATLAB permite o processamento automático de dados (Material complementar); uma versão atualizada do código é mantida ( <a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ). Mais amplamente, as técnicas aqui apresentadas podem ser adaptadas em muitos ensaios microfluídicos basea...

Alterações na forma de células são críticas em muitos contextos biológicos. Por exemplo, hemácias e leucócitos deformar através dos capilares, que são menores do que seu próprio diâmetro 1. Em metástase, as células cancerosas deve deformar-se através de aberturas estreitas intersticiais, bem como vasos tortuosos e redes linfáticos para semear em sites secundários 2. Para investigar o comportamento físico das células individuais, dispositivos microfluídicos apresentar uma plataforma ideal que pode ser personalizado para estudar uma série de comportamentos de células, incluindo a sua capacidade de migrar através de aberturas estreitas 3 e deformar passivamente através constrições em escala mícron 3- 9. PDMS (polidimetilsiloxano) dispositivos microfluídicos são opticamente transparentes, permitindo deformações celulares para ser visualizado através de microscopia de luz e analisados ​​utilizando ferramentas básicas de processamento de imagem. Além disso, as matrizes de constrições pode ser definido com precisão, permitindo a análise de várias células simultaneamente com umrendimento que excede muitas técnicas existentes 10,11. Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para deformabilidade celular usando o dispositivo micro &#39;celular Deformer&#39; PDMS sondagem. O dispositivo é projetado de modo que as células passagem por constrições seqüenciais; esta geometria é comum em contextos fisiológicos, tais como o leito capilar pulmonar 12. Para medir a capacidade de deformação das células, tempo de trânsito fornece uma métrica conveniente que seja facilmente medido, como o tempo necessário para uma célula individual de trânsito através de uma única 4,6 constrição. Para manter uma queda de pressão constante através dos canais de constrição durante o trânsito celular, usamos o fluxo orientado a pressão. Nosso protocolo inclui instruções detalhadas sobre o desenho e fabricação do dispositivo, a operação do dispositivo accionado por pressão de fluxo, e a preparação de células de imagiologia, assim como o processamento de imagens para medir o tempo para as células para se deformar através de uma série de constrições. Nós incluímosambos os projetos de dispositivos e código de processamento de dados como arquivos de visão suplementar. Como um exemplo representativo de dados, que mostra o tempo de trânsito das células através de uma série de constrições como uma função do número de constrições subculturas. Análise da escala de tempo para que as células de trânsito que constrições estreitas de um dispositivo de microfluidos pode revelar as diferenças na capacidade de deformação de uma variedade de tipos de células 4,5,13. O dispositivo demonstrado aqui examina exclusivamente trânsito célula através de uma série de constrições escala mícron; este projeto emula o caminho tortuoso que as células experiência em circulação e também permite sondar características físicas adicionais de células, tais como tempo de relaxamento.

<table><tbody><tr><td>Surfactante de Copolímero em Bloco Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>8409400</td><td>Produzido pela BASF, também disponível através da base Sigma</td></tr><tr><td>PDMS e reticulador</td><td>Essex Brownell</td><td>DC-184-1.1</td><td>Produto comumente chamado de Sylgard 184 Elastômero</td></tr><tr><td>Unidade de descarga de plasma de oxigênio</td><td>Enercon</td><td>Dyne-A-Mite 3D Treater</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Virola Fingertight, 1/32"</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-113</td><td></td></tr><tr><td>Conexão Fingertight III, 10-32</td><td>Upchurch Scientific</td><td>UP-F-300X</td><td></td></tr><tr><td>Tubulação de polieteretercetona (PEEK), diâmetro externo = 1/32"ou 0.79 mm</td><td>Tubulação de</td> polietileno (PE-20) Valco <td>TPK.515-25M</td><td></td></tr><tr><td>, 0.043" ou 1.09 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Regulador de pressão</td><td>Tubo de poliuretano Airgas ou Praxair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 5/32" OD</td><td>McMaster Carr</td><td>5648K284</td><td></td></tr><tr><td>Conexões Push-to-connect</td><td>McMaster Carr</td><td>5111K91</td><td></td></tr><tr><td>Conversor Eletropneumático de Tensão para Pressão (E/P)</td><td>Omega</td><td>IP413-020</td><td></td></tr><tr><td>16 bits, 250 kS/S, 80 Entradas Analógicas DAQ Multifuncional</td><td>National Instruments</td><td>NI PCI 6225-779295-01</td><td></td></tr><tr><td>Terminal de Parafuso de Bloco de Conector Analógico</td><td>National Instruments</td><td>SCB-68-776844-01</td><td></td></tr><tr><td>Software de Projeto de Sistema LabView</td> Software <td>MATLAB da National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>The MathWorks, Inc.</td><td>O código MATLAB R2012a</td><td>requer o cabo blindado da caixa de ferramentas de processamento de imagem</td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>SHC68-68</td><td></td></tr></tbody></table>

a técnica de microfluídica para sondar deformabilidade celular

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Aqui nós detalhe do desenho, fabrico e utilização de um dispositivo de microfluidos para avaliar a capacidade de deformação de um grande número de células individuais de uma maneira eficiente. Tipicamente, os dados de 10 ~ 2 células pode ser adquirida num experimento 1 hr. Um programa automatizado de análise de imagem permite que a análise pós-experimento eficiente de dados de imagem, permitindo o processamento a ser completa dentro de algumas horas. Nossa geometria do dispositivo é único na medida em que as células têm de se deformar através de uma série de constrições escala mícron, permitindo assim a deformação inicial e dependente do tempo de relaxamento de células individuais a serem ensaiadas. A aplicabilidade deste método para leucemia promielocítica humana (HL-60) células é demonstrada. Células Conduzindo a deformar através constrições micro-escala, utilizando fluxo orientado a pressão, observamos que promielocítica humana (HL-60) células ocluir momentaneamente a primeira constrição por um período médio de 9,3 ms antes passaging mais rapidamente através da constrição posterioríons com um tempo de trânsito médio de 4,0 ms por constrição. Por outro lado, todo-trans-retinóico tratadas com ácido (tipo neutrófilos) células HL-60 ocluir a primeira constrição para apenas 4,3 ms antes passaging através das constrições subsequentes com um tempo de trânsito mediana de 3,3 ms. Este método pode fornecer insights sobre a natureza viscoelástica de células e, finalmente, revelar as origens moleculares desse comportamento.

Para investigar a capacidade de deformação dos diferentes tipos de células, as células de leucemia mielóide humana (HL-60), as células diferenciadas de neutrófilos, linfócitos, células de rato e de linhas de células de cancro humano do ovário (OVCAR8, HEYA8) são avaliadas utilizando a técnica de microfluidos &#39;celular Deformer&#39;. Os resultados representativos para o tempo de trânsito das células HL-60 e do tipo de neutrófilos células HL-60 mostra a escala de tempo para uma única célula de trânsito através de uma s...

Nós demonstramos um ensaio baseado em microfluídica para medir a escala de tempo para que as células de trânsito através de uma seqüência de constrições em escala mícron.

A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a deformabilidade de diferentes tipos celulares utilizando um ensaio simples baseado em microfluídica. Isso é conseguido pela fabricação de um dispositivo microfluídico de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS para analisar a escala de tempo do trânsito celular através de uma sequência de constrições em escala micrométrica. Um fluxo impulsionado por pressão é então utilizado para conduzir as células através dos canais microfluídicos, o que permite avaliar a deformação e a relaxação dependente do tempo de células individuais. Em seguida, executa-se um programa automatizado de análise de imagens para processar os vídeos e obter um histograma dos dados de tempo de trânsito.Os resultados mostram que diferentes tipos celulares exibem diferenças na deformabilidade celular com base em seu tempo de trânsito através de uma série de constrições. A principal vantagem desta técnica em relação a técnicas existentes, como microscopia de força atômica ou aspiração por micropipeta, é que dispositivos microfluídicos podem operar com sucesso com alta capacidade de throughput. Embora outros dispositivos microfluídicos também possam ser usados para ensaiar a deformabilidade celular.Projetamos nosso dispositivo para que as células passem por constrições sequenciais, uma geometria comum em contextos fisiológicos, como o leito dos capilares pulmonares. Para começar, projete o dispositivo microfluídico selecionando a largura dos canais da matriz de constrição com cerca de 30 a 50% do diâmetro médio da célula e a altura do canal com pelo menos 50% do diâmetro celular. Inclua um filtro nas portas de entrada para remover detritos e desagregar aglomerados celulares.Antes de iniciar o experimento, fabrique o molde do dispositivo utilizando técnicas padrão de micromecanização litográfica. Verifique a altura das características do padrão utilizando um perfilômetro. Em seguida, conecte a fonte de ar para fluxo impulsionado por pressão usando um tanque de ar comprimido e uma sequência de reguladores e conexões pneumáticas.Primeiro, configure um tanque de suprimento de ar e um regulador manual. Em seguida, monte um regulador de pressão controlado eletronicamente em linha com o regulador manual. Utilize o código simples escrito em LabVIEW para inserir a pressão desejada.O conversor eletropneumático utiliza um circuito interno de realimentação para ajustar a pressão na saída da válvula, de modo a igualar a pressão especificada ao longo do dispositivo microfluídico. Monte uma câmara pressurizada para promover o fluxo da suspensão celular, montando uma câmara de suspensão celular a partir de um tubo padrão de citometria de fluxo e uma tampa usinada que cria um selo hermético no tubo. A tampa da câmara de pressão contém duas aberturas: uma entrada conectada ao tanque de ar comprimido e uma saída pela qual as células fluem da câmara pressurizada para o dispositivo.Em seguida, monte um microscópio invertido equipado com uma câmera que tenha uma taxa de aquisição de pelo menos 100 quadros por segundo. Para capturar imagens das células fluindo através da matriz de constrição, prepare então uma solução estoque de surfactante em solução salina tamponada com fosfato ou PBS, já que a adição de uma pequena quantidade de surfactante à solução de meio celular ajudará a minimizar a adesão celular às paredes de PDMS. Para fabricar o bloco de PDMS com canais microfluídicos, adicione um grama de agente de cura a 10 gramas de base de PDMS e misture bem.Despeje a mistura sobre o dispositivo. Desgaseifique o molde em uma câmara de vácuo com vácuo aplicado até que as bolhas aprisionadas desapareçam, ou por cerca de 10 a 20 minutos. Após esse tempo, ainda podem existir bolhas na interface AR PDMS, o que é normal.Esses geralmente desaparecerão durante a calcinação. Em seguida, calcine o dispositivo Degas a 65 graus Celsius por quatro horas após o dispositivo ter esfriado. Remova os dispositivos microfluídicos do molde mestre.Comece levantando suavemente um canto do dispositivo. Descascar lentamente e com cuidado, em vez de levantar o bloco de PDMS diretamente para cima, reduz o estresse tanto no PDMS quanto no molde. Corte dispositivos microfluídicos individuais do bloco de PDMS com uma lâmina de barbear e remova o dispositivo do molde. Fure orifícios no dispositivo de PDMS para criar portas de conexão para acesso entre tubos e microcanais. Faça orifícios do lado dos canais até o lado externo do dispositivo utilizando um punch de biópsia.Lave o dispositivo de PDMS com isopropanol para remover poeira e fragmentos de PDMS. Certifique-se de que os orifícios perfurados estejam livres de detritos direcionando um fluxo contínuo de isopropanol puro de uma garrafa de pressão através dos orifícios. Seque com ar filtrado.Limpe o substrato de vidro lavando-o com metanol. Em seguida, seque com ar filtrado e coloque em uma placa aquecida a 200 graus Celsius por cinco a 10 minutos para garantir que o vidro esteja completamente limpo e seco antes do tratamento com plasma. Conforme detalhado no protocolo textual, inspecione o dispositivo microfluídico sob um microscópio.Certifique-se de que os canais não estejam colapsados ou quebrados e de que os orifícios de entrada e saída estejam conectados diretamente aos canais do dispositivo, utilizando uma objetiva de baixa potência. Coloque a suspensão celular em um tubo de citometria de fluxo e conecte-o à tampa pressurizada antes de ligar a tubulação ao dispositivo microfluídico; ajuste a pressão para cerca de 14 a 21 quilopascals e realize uma lavagem até que a suspensão celular emerja da extremidade da tubulação. Em seguida, posicione o dispositivo sobre uma superfície plana para inserir a tubulação na entrada do dispositivo.Como a lamínula de vidro ligada à parte inferior do dispositivo de PDMS é frágil, insira a ponta da tubulação contendo a suspensão celular na entrada do dispositivo. Em seguida, insira um pedaço de tubulação no orifício de saída e direcione-o para um tubo vazio para coleta de resíduos, como um tubo Falcon vazio fixado com fita ao lado da platina do microscópio.Aumente suavemente a pressão até cerca de 28 quilopascals ou até que as células fluam pelos canais. Posicione o dispositivo de modo que múltiplos canais estejam no campo de visão e sejam perpendiculares à parte inferior da tela. Para iniciar a análise de dados, abra o arquivo de script mestre m e execute o programa.Selecione o primeiro vídeo a ser analisado na janela do Windows Explorer que aparecer. Especifique a taxa de quadros para o vídeo selecionado e pressione enter. Uma figura aparecerá solicitando que o usuário selecione uma janela retangular de recorte.Para o primeiro vídeo, selecione uma janela que compreenda todos os canais da esquerda para a direita e que intersecte os canais logo acima da primeira lâmpada da matriz de canais. Nas partes superior e inferior, selecione as regiões de constrição a partir da imagem recortada. O algoritmo exibe a segmentação das células para os primeiros 50 quadros de cada vídeo.Monitore atentamente a imagem no canto superior esquerdo para determinar se o algoritmo está localizando as células com precisão. Uma imagem sobreposta é sobreposta ao vídeo original. Para demonstrar a localização das células identificadas, selecione o próximo vídeo a ser processado na janela do Windows Explorer.O algoritmo será repetido. Para cada vídeo selecionado, selecione cancelar. Uma vez que todos os vídeos desejados tenham sido adicionados por meio da janela do Windows Explorer para indicar que a lista de vídeos está completa, os resultados representativos para o tempo de trânsito de células HL 60 e do tipo neutrófilo HL 60 mostram a escala de tempo necessária para uma única célula atravessar uma série de constrições.O tempo é medido para uma população de células individuais em cada constrição de sete micrômetros em uma série de sete constrições. Com uma pressão motriz de 28 quilopascals, células HL 60 obstruem temporariamente a primeira constrição por um tempo mediano de 9,3 milissegundos antes de se compactarem nas constrições subsequentes. Em contraste, células HL 60 do tipo neutrófilo obstruem a primeira constrição por apenas 4,3 milissegundos antes do empacotamento.Uma vez que atravessam a primeira constrição, as células transitam mais rapidamente pelas constrições restantes, da segunda à sétima, com um tempo mediano de trânsito de 4,0 milissegundos para as células HL 60 e de 3,3 milissegundos para as células do tipo neutrófilo. Ao comparar o tempo de trânsito entre populações celulares, podem ser reveladas diferenças na deformabilidade celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como medir a deformabilidade de diferentes tipos celulares utilizando o ensaio microfluídico simples.Aqui, o fluxo impulsionado por pressão é utilizado para conduzir células através de canais microfluídicos, o que permite avaliar a deformação e a relaxação de células individuais.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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A técnica de microfluídica para sondar Deformabilidade celular

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