Visualização de endosome Dynamics em Viver terminais nervosos com quatro-dimensional imagens de fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens precisas dos endossomos no espaço tridimensional ao longo do tempo ou em quatro dimensões. Isso é feito dissecando primeiro os músculos da cobra e organizando o tecido na placa de imagem. O segundo passo é corar o tecido com corantes vitais para estimular a formação de endossomos.

Em seguida, a preparação é visualizada em quatro dimensões para uma ou mais junções neuromusculares. A etapa final é a análise cuidadosa dos dados para caracterizar o comportamento dos macro endossomos. Em última análise, a presença e o movimento de endossomos ao longo do tempo dentro do espaço pré-sináptico podem ser demonstrados por imagens de fluorescência quadridimensionais.

A principal vantagem desta técnica é que o músculo abdominal da cobra tem apenas uma única fibra de espessura, o que permite que imagens de alta qualidade sejam geradas usando microscopia de epifluorescência padrão Preparações de tecido da cobra-liga serão usadas neste protocolo. O tecido reptiliano deve ser mantido em baixas temperaturas, para que permaneça fisiológico por mais tempo e com menos contaminação bacteriana. Para coloração de corante vital lisossômico, o corante é dissolvido de um a 5.000 em solução fria de ringers reptilianos.

Para obter uma concentração final de 0,2 micromolar, adicione o corante ao tecido e incube a quatro graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, lave o lenço várias vezes com toques frios para todas as colorações FM 1 43. Pré-monte a amostra em uma placa de imagem com pinos magnéticos antes da coloração.

Para os fins deste vídeo, apenas a coloração FM 1 43 usando estimulação de cloreto de potássio será demonstrada. O corante diluído de um a 500 em anéis de cloreto de potássio com alto teor de potássio para obter uma concentração final de sete micromolares é adicionado ao tecido e, em seguida, o tecido é incubado a quatro graus Celsius por no máximo 30 a 60 segundos. Posteriormente, lavou rapidamente três vezes com toques frios por cerca de um minuto por enxágue.

Todos os tecidos devem ser examinados o mais rápido possível após serem corados e lavados com solução de ringer fria. Se um microscópio invertido for usado, utilize uma câmara de imagem cujo fundo contenha uma lamínula redonda fina. Normalmente, a câmara de imagem deve ter um fundo fino de aço inoxidável com um diâmetro de 25 milímetros.

Lamínula de cobertura de vidro de espessura número um no centro para configurar a preparação para a imagem. Oriente-o usando pinos magnéticos para que o músculo fique centrado da melhor maneira possível dentro da placa de imagem e deitado o mais plano possível. Cubra a preparação com um pequeno volume de solução de ringer.

Monte o prato, colocando-o o mais próximo possível do centro do palco. Escolha uma objetiva apropriada para obter a maior resolução 3D possível. Uma objetiva de 63 x água será usada para todos os experimentos nesta demonstração.

Para iniciar este procedimento, abra a janela de imagem no livro de slides 5.0. Vários menus estão contidos aqui em guias. Escolha a objetiva de água 63 x usando a segunda guia Z.Defina o intervalo de pilha Z.

Neste exemplo, um passo Z de 1,5 mícron é usado para imagens ao vivo. Selecione a taxa de quadros de lapso de tempo. Uma taxa ideal é aquela que é adequada para resolver suavemente as mudanças com o tempo, como interações de movimento ou eventos de fusão.

Por exemplo, 10 pontos de tempo em intervalos de 32 para um intervalo de tempo total de cinco minutos. Em seguida, selecione a profundidade total de campo enquanto exibe o terminal ao vivo focado manualmente no topo do foco de interesse e, em seguida, vá um pouco acima dele. Selecione set top.

Concentre-se lentamente na amostra até que tudo esteja fora de foco. Novamente, o número de planos e os valores totais de deslocamento exibidos indicarão a profundidade de campo selecionada na janela de captura. Selecione o botão de opção das posições superior e inferior usado para transferir os parâmetros selecionados Para captura de imagem, inicie a aquisição de imagem.

Complete todas as imagens ao vivo para uma preparação específica. Retenha todos os arquivos de dados brutos enquanto o armazenamento digital geralmente não é um problema. O tempo de processamento é significativo mesmo com computadores pessoais ou estações de trabalho rápidas.

Por esse motivo, cortar imagens em uma região de interesse garante que toda a região de interesse esteja na janela cortada durante todo o tempo. O curso D pode envolver pilhas de imagens usando o software apropriado e a função de propagação de pontos correta, confirmar que a resolução foi melhorada e que nenhum artefato foi gerado pelo algoritmo de deconvolução. Use um algoritmo de interpolação para expandir o eixo Z.

Resolução aparente, uma expansão de seis x de uma separação real do plano da imagem de 1,5 mícron para uma separação aparente de 0,25 mícron é sugerida. Execute brilho de contraste, filtragem de ruído, branqueamento de fotos e outros ajustes típicos de processamento de imagem. Se desejar.

Os padrões de manipulação de imagens determinam que, para a maioria dos trabalhos científicos, é apropriado que as mesmas correções sejam aplicadas a todas as imagens, tanto dentro de uma pilha quanto em diferentes pontos de tempo. A consequência de um ajuste específico deve ser avaliada entre todas as imagens. Experimente várias técnicas de filtragem e aprimoramento de imagem.

Por exemplo, lelos e filtragem são úteis para aumentar o contraste de pequenas estruturas acima do plano de fundo. O brilho dos pixels no centro de uma janela em execução é aprimorado, enquanto o brilho das áreas circundantes é reduzido. Observe que alguns métodos de filtragem não funcionam bem em combinação.

Aplique a correção de desvio se houver movimento substancial da preparação ao longo do tempo. Esse movimento é comum em músculos vivos, mesmo com drogas adicionadas para suprimir potenciais de ação e potenciais sinápticos. Um algoritmo de registro de pixel alinha as imagens de lapso de tempo e pode reduzir, mas geralmente não eliminar completamente esse movimento.

Neste estudo, quatro imagens ao vivo D de terminais neuromusculares de cobras foram usadas para determinar se os macro endossomos ou me movem em direção à membrana plasmática e desaparecem rapidamente, sugerindo que seu número diminui porque alguns deles acessam o cito. Os dados são exibidos como visualizações de volume 3D em seis pontos de tempo com um intervalo de quadros de 60 segundos. Para ilustrar a profundidade Z de um único botão, um me pode ser observado afastando-se do eixo Y indicado pela linha tracejada vermelha sobre vários quadros antes de desaparecer entre os pontos de tempo cinco e seis, que o tempo necessário para o desaparecimento foi menor que o intervalo de quadros é consistente com exocitose pouco antes do desaparecimento.

O ME parece estar localizado na membrana plasmática dos bastões. O mesmo conjunto de dados brutos é mostrado a seguir como um filme com uma ampliação menor. A sequência é brevemente pausada no início de cada 24 etapas de rotação 3D em torno do eixo Y para chamar a atenção para o eu que logo desaparecerá, indicado pela seta vermelha.

Observe que o ME é visível, se aproxima da borda do botão, desaparece e não retorna em todas as perspectivas de visualização. Devido à resolução mais baixa do eixo Z em comparação com a resolução XY, a forma do ME parece alongar e encurtar dependendo da perspectiva de visualização. Estudos de microscopia eletrônica mostraram que os endossomos nos terminais do motor são pequenos em tamanho próximo ao limite de difração da luz.

Portanto, a fusão desses endossomos não pode ser absolutamente distinguida da associação espacial próxima no nível da luz. Neste estudo, os Mees foram marcados com FM 1 43 indicados em verde e os endossomos ácidos ou EAs foram marcados com um lisossomô. O corante vital indicado em dados vermelhos de um ponto de tempo de um filme de quatro D é exibido como visualizações de volume 3D em três orientações.

Os painéis superiores de um a três mostram a visão convencional de cima do plano XY. Os painéis do meio de quatro a seis mostram uma visão perpendicular ao plano XY e na direção da grande seta vermelha. Os painéis inferiores de sete a nove mostram uma visão mutuamente perpendicular a ambas as vistas acima na direção da grande seta azul.

Um me é marcado por uma seta verde e dois AEs são marcados por setas vermelhas. Estruturas fluorescentes em ambas as cores aparecendo em amarelo foram ocasionalmente observadas em quatro registros de imagens D. Neste exemplo, um endossomo contendo ambos os corantes é marcado por uma seta amarela nos painéis três, seis e nove.

A sobreposição de vermelho e verde é igualmente completa em todas as três projeções ortogonais, indicando um suposto em me ae fundido. Este filme mostra o mesmo conjunto de dados configurado para girar no eixo Y a um quadro por segundo. O suposto MEAE fundido permanece amarelo de todas as perspectivas.

A deconvolução digital é uma ferramenta útil para melhorar a resolução de imagens 3D e quatro D. Uma comparação entre dados brutos e dados devolvidos é mostrada aqui. Para um terminal nervoso típico de cobra corado durante a estimulação com FM 1 43 Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 60 minutos, se executada corretamente.

Após esse procedimento, outros métodos, como a imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a colocalização de macroendossomos com marcadores pré-sinápticos.