Transecção medular nos larval Zebrafish
21 de maio de 2014
Após transecção espinhal, adulto zebrafish tem recuperação funcional por seis semanas após a lesão. Para tirar proveito da transparência larval e recuperação mais rápida, apresentamos um método para seccionar a medula espinhal larval. Após transecção, observamos recuperação sensorial começando em 2 dias após a lesão, e movimento C-curva por 3 dias após a lesão.
O objetivo geral deste procedimento é garantir a secção completa da medula espinhal em peixes-zebra larvais por meio de um método relativamente de alto rendimento e reprodutível, ao mesmo tempo que se maximiza a sobrevivência. Isso é conseguido primeiramente acasalando adultos do genótipo apropriado e realizando triagens conforme necessário. O segundo passo é criar os embriões até cinco dias após a fertilização.
Em seguida, realize a secção com uma pipeta de microinjeção biselada. Por fim, os peixes lesionados têm permissão para se recuperar em meio tratado com antibiótico até o final do experimento. Em última instância, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para demonstrar a resposta dos progenitores neurais à lesão.
As principais vantagens desta técnica em comparação com métodos existentes, como os desenvolvidos pelos laboratórios Becker e fetcher, incluem um maior número de animais para estudo, um tempo de recuperação mais curto e o uso de ferramentas genéticas não disponíveis de outra forma no peixe-zebra adulto. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de regeneração, como a resposta dos progenitores neurais à lesão. Inicie os preparativos produzindo placas cirúrgicas utilizando placas de Petri de 60 milímetros e o kit de elastômero de silicone to cell guard 180 4.
Seguindo as instruções do fabricante, preencha as placas com no máximo metade da capacidade e deixe-as polimerizar. Em seguida, armazene as placas cobertas à temperatura ambiente.
Em seguida, fabrique micropipetas aquecendo e puxando tubos capilares de borossilicato de parede fina em um puxador de micropipetas, utilizando as mesmas configurações usadas para fabricar agulhas de microinjeção sob um microscópio estereoscópico. Use pinças para quebrar a ponta da micropipeta até um diâmetro aproximado de 200 microns. Em seguida, afie a borda quebrada com uma microretificadora inicialmente em 35 graus, seguido por um segundo afiamento em 25 graus quando o ruído de moagem cessar.
Verifique em um microscópio estereoscópico para garantir que a ponta esteja afiada e lisa. O uso de uma ponta muito larga tende a resultar em maior taxa de óbitos devido à maior probabilidade de lesar a aorta dorsal. Já uma ponta muito estreita tende a deslizar sobre a pele em vez de cortar o tecido; armazene as micropipetas corretamente biseladas em uma placa de Petri sobre uma pequena quantidade de argila sete dias antes da cirurgia.
Prepare os tanques de acasalamento com machos e fêmeas de spr. Os peixes coletam os embriões fertilizados na manhã seguinte, três horas após a iluminação ser ligada. Para garantir o rendimento máximo.
Se estiver usando uma linhagem transgênica com genótipos mistos, coloque 100 embriões por placa e incube as placas a 28,5 graus Celsius. Se estiver usando uma linhagem com repórter fluorescente, analise os embriões quanto à expressão fluorescente às 48 horas pós-fertilização.
Deixe os embriões fluorescentes amadurecerem a 28,5 graus Celsius até as larvas ou cinco dias após a fertilização. Prepare a placa cirúrgica cobrindo o guardacélulas com E2 e 10 miligramas por litro de sulfato de gentamicina e trica. Adicionalmente, prepare um recipiente de recuperação adicionando 25 mililitros de E2 e sulfato de gentamicina a uma placa de Petri de 100 milímetros.
O próximo passo é preparar um cabo de bisturi fixando três cotonetes com fita adesiva. Isso forma uma ferramenta triangular com três ranhuras. Em seguida, monte a micropipeta preparada sobre os cotonetes, fixando-a com fita adesiva em uma das ranhuras para completar o bisturi; coloque a micropipeta de lado até o momento de utilizá-la.
Inicie a cirurgia anestesiando uma placa com 25 larvas de cada vez. Com trica, os peixes estão suficientemente anestesiados quando não exibem mais resposta ao toque. Transfira as larvas para uma placa cirúrgica e posicione a placa sob um microscópio estereoscópico.
Com a ampliação máxima, gire uma larva de modo que ela fique de lado, com as costas mais próximas à mão que segura o bisturi. Posicione a pinça de forma que ela repouse sobre o guardacélulas. Incline-a sobre a largura da larva, apoiando o bisturi de vidro contra um dos braços da pin�tura.
Corte a face lateral dorsal das larvas ao nível do poro anal. Certifique-se de não cortar além da borda ventral da medula espinhal. Em seguida, gire o bisturi para seccionar a medula espinhal.
O grau de torção necessário é geralmente muito menor que 90 graus. Repita a transecção da medula espinhal com as larvas restantes. Após a conclusão da cirurgia em todo o lote de larvas, utilize uma pipeta posterior e uma bomba de pipetagem para transferir os animais lesionados para a placa de recuperação.
Para eliminar a anestesia, certifique-se de coletar primeiro a cabeça ou a cauda da larva durante a transferência. Não estresse o local da lesão dobrando as larvas após a anestesia ter passado. Transfira as larvas lesionadas da placa de recuperação para placas de 100 milímetros contendo 25 mililitros de E dois e sulfato de gentamicina, numa densidade de 25 larvas por placa.
Em seguida, coloque-os em um incubador a 28,5 graus Celsius enquanto a ferida cicatriza. Verifique as placas diariamente. Remova qualquer animal doente ou morto.
Não troque o meio até que os coops de protozoários de água doce estejam visíveis no meio. Ao trocar o meio, não transfira o peixe para uma nova placa. Em vez disso, remova o máximo de meio possível e encha a mesma placa com meio novo.
Repita a troca do meio conforme necessário para reduzir a população de coops. Alimente as larvas diariamente com uma pequena quantidade de ração em pó para alevinos. Um peixe-zebra com medula espinhal completamente seccionada é mostrado aqui após um dia.
Após a lesão, a GFP é expressa em todos os neurônios, e a seta amarela identifica o local da lesão. Um peixe-zebra com a medula espinhal completamente transeccionada é mostrado aqui três dias após a lesão. Este peixe-zebra fixado e marcado com UCD mostra uma medula espinhal completamente transeccionada.
A seta amarela novamente identifica o local da lesão. Em contraste, a região contígua de marcação de neurônios ao longo da borda ventral da medula espinhal. Neste peixe-zebra fixado três dias após a lesão, observa-se uma transecção incompleta.
Uma vez dominada, 300 larvas por hora podem ser processadas usando esta técnica.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para transecção da medula espinhal em zebrafish larvais, aproveitando sua transparência e rápida recuperação. Após a transecção, a recuperação sensorial é observada já aos 2 dias após a lesão, com movimento em C observado aos 3 dias após a lesão.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Regenerativa
- Modelos de Peixe-zebra
Antecedentes
- Lesões na medula espinhal apresentam desafios significativos na recuperação.
- O peixe-zebra é um modelo valioso para o estudo da regeneração da medula espinhal.
- As larvas de peixe-zebra oferecem vantagens devido à sua transparência e cicatrização rápida.
- Compreender os mecanismos de recuperação pode orientar estratégias terapêuticas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método reprodutível para transecção da medula espinhal em peixes-zebra larvais.
- Avaliar a linha do tempo e os mecanismos de recuperação após a lesão.
- Utilizar microscopia de imunofluorescência para avaliar as respostas neurais.
Métodos Utilizados
- Acasalamento de peixes-zebra adultos com o genótipo apropriado.
- Triagem e criação de embriões até cinco dias após a fertilização.
- Realização da secção com uma pipeta de microinjeção biselada.
- Recuperação dos peixes lesionados em meio tratado com antibiótico.
Resultados Principais
- Recuperação funcional observada após seis semanas da lesão.
- A recuperação sensorial começa em 2 dias após a lesão.
- O movimento de curva em C é observado em 3 dias após a lesão.
- A microscopia de imunofluorescência revela a resposta de progenitores neurais.
Conclusões
- O método permite a secção eficaz da medula espinhal em peixes-zebra larvais.
- A recuperação rápida fornece informações sobre a regeneração da medula espinhal.
- Os achados podem contribuir para a compreensão dos mecanismos de reparação neural.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A lebre de peixe-zebra larval permite uma avaliação rápida e de alto rendimento da regeneração da medula espinhal, oferecendo um modelo complementar aos sistemas adultos para a desmistificação mecanicista em estágios iniciais. O método apoia a validação de alvos ao fornecer leituras quantificáveis da recuperação funcional e sensorial em poucos dias, acelerando a avaliação pré-clínica de candidatos neuro-restauradores. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no engajamento de alvos e na modulação de vias antes da otimização do composto líder.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas ao rebrotamento axonal e à iniciação da neurogênese.
- Valor Operacional: Fornece métricas reprodutíveis de secção e recuperação para avaliação consistente do engajamento do alvo.
- Valor Preditivo: Respostas precoces sensoriais e motoras apoiam a validação funcional do alvo e a redução de riscos da via.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaios: Gera modelos padronizados de lesão adequados para triagem de compostos e análise de resposta à dose.
- Saídas quantitativas: Permite a medição do início da recuperação sensorial (2 dpi), movimento de curva em C (3 dpi) e retomada da natação (5 dpi) como pontos finais funcionais.
- Escalabilidade: Permite o processamento de até 300 larvas por hora, facilitando campanhas de triagem de média escala.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela mecanismos conservados de regeneração relevantes para a fisiopatologia da lesão medular humana.
- Continuidade Tradutiva: Conecta descobertas científicas com validação pré-clínica por meio de leituras compartilhadas da resposta de progenitores neurais.
- Avanço Ajustado ao Risco: Permite decisões precoces de avançar/não avançar com base na cinética da recuperação funcional, reduzindo o risco de falhas em estágios tardios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer um modelo vertebrado para validação de alvos e triagem mecanicista antes da identificação de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre alvos neuroregenerativos por meio de cronogramas observáveis de recuperação sensorial e motora.
- Triagem: Fornece fenótipos padronizados e quantificáveis para avaliar os efeitos de compostos sobre a regeneração.
- Análises: A microscopia de imunofluorescência permite a quantificação objetiva da proliferação e migração de progenitores neurais como biomarcadores mecanicistas.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados em larvas a modelos de peixes-zebra adultos e mamíferos por meio de vias conservadas de regeneração.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para validação iterativa de alvos em múltiplos programas neuroregenerativos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos por meio da observação direta da dinâmica de regeneração.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade e padronização por meio de protocolos definidos de transecção e recuperação.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir avaliação funcional precoce de alvos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de candidatos neuroregenerativos com base na cinética de recuperação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manejo de peixes-zebra, microcirurgia e microscopia de fluorescência.
- Depende da preparação de pipetas de microinjeção e da infraestrutura para observação de comportamento.
- Necessita de protocolos padronizados de anestesia e recuperação entre as equipes.
- As considerações para adaptação incluem o background genético e a compatibilidade com repórteres transgênicos.
- As limitações práticas incluem as restrições de tamanho das larvas e a necessidade de uma técnica precisa de transecção dorsal-lateral.
