Name: Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprenda a expressão transiente de genes em camundongos usando entrega hidrodinâmica de DNA plasmidial. Este método minimiza a resposta inflamatória e permite análise funcional de proteínas in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos Xia Liu (Regeneron Pharmaceuticals) para, inicialmente, nos ensinando a técnica HGD e Dr. Russell Thomson (Albert Einstein College of Medicine), por sua orientação contínua em vários aspectos da tecnologia. Este trabalho foi financiado pelo Hunter College, CUNY arranque fundos e prêmio NSF Pão IOS-1249166. Agradecemos o apoio Grant NYULMC Histopatologia Núcleo NYUCI Center, NIH / NCI 5 P30CA16087-31 para histologia em fígado de camundongos.

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso do Hunter College, Universidade da Cidade de Nova York. 1. Preparação de ADN plasmídico sem endotoxinas <ol><li> Escolha de uma única colónia de bactérias, contendo o gene de interesse num vector de expressão de mamífero a partir de uma placa recentemente riscada selectiva. </li><li> Siga as recomendações encontradas no manual de um kit disponível comercialmente purificação plasmídeo livre de endotoxina para cultivo e colheita bactérias. </li><li> Purifica-se o plasmídeo de ADN livre de endotoxinas a partir de células bacterianas, seguindo o protocolo do kit de purificação de plasmídeo isento de endotoxina disponível comercialmente. </li><li> Use livre de endotoxina plásticas e lidar com DNA com cuidado para garantir que a endotoxina não é re-introduzida na amostra de DNA após a etapa de remoção. </li><li> Medir a concentração de DNA plasmídico sem endotoxinas por determinação da sua absorvância a 260 nm usando um micro-volume do espectrofotómetro de UV, como descrito abaixo, ou um padrão, baseada em espectrofotômetro cuvete. <ol><li> Limpar as superfícies ópticas inferiores e superiores do sistema de retenção de amostra espectrofotômetro micro como se segue. Pipetar 1 mL de água deionizada limpo no sistema óptico menor. Feche o braço de alavanca e toque-o algumas vezes para banhar o sistema óptico superior, em seguida, alavanca de abertura e limpe com um lenço de papel. </li><li> Abra o software do micro espectrofotómetro e seleccionar o módulo de ácidos nucleicos. </li><li> Coloque 1 ml de água deionizada limpa no sistema óptico inferior, o braço de alavanca e selecione &quot;inicializar&quot; do software do programa. Uma vez que a inicialização estiver superfícies completas, limpas tanto ópticos com um lenço de papel .. </li><li> Executar a medição em branco, carregando um ul de tampão TE isento de endotoxina (10 mM Tris-Cl, pH 8,0; EDTA 1 mM) e seleccionando &quot;em branco&quot; do software do programa. Uma vez que a medição é feita em branco, superfícies limpas tanto ópticos com umtecido. </li><li> Realizar medição da amostra, carregando 1 ml de amostra de DNA livre de endotoxina e selecionando &quot;medida&quot; do software do programa. Registre a concentração de DNA. Avaliar a pureza do DNA através da gravação da relação absorbância 260/280 nm que aparece na tela. Uma vez que o uso de ADN puro (260/280 razão de 1,8) para HGD é altamente desejável, evitar a utilização de uma amostra de DNA com uma razão de 260/280 inferior a 1,7. Uma vez que a medição é feita, limpar ambas as superfícies ópticas com um tecido. </li></ol></li></ol> 2. Pesando de ratos <ol><li> Mark camundongos em uma forma apropriada para a tensão. Nota: marcação da cauda não é recomendado para este procedimento. <ol><li> Marcar espécie de rato que têm pele branca (por exemplo, Swiss Webster) em suas costas com um marcador preto. Reaplicar marcas ao longo do tempo, se necessário. </li><li> Mark espécie de rato que têm pele preta (por exemplo, C57BL / 6) pela orelha perfurando vários dias de antecedência. </li></ol></li><li> Pesar camundongos individually delicadamente colocando-os em um prato de pesagem ou animal balde colocado em uma balança de laboratório digital. Registar o peso de cada murganho utilizado na experiência, no dia da experiência. </li></ol> 3. Preparação de seringas <ol><li> Preparação da mistura de injeção <ol><li> Calcula-se a quantidade de DNA necessária, assumindo 5 - 50 ug livre de endotoxina plasmídeo de DNA para a injecção de cada rato. <ol><li> Determinar a quantidade óptima de DNA de plasmídeo experimentalmente. </li><li> Ao determinar a quantidade de DNA necessário, assumir a injeção de um rato adicional por grupo, como o carregamento adequado das seringas vai exigir algum mix injeção extra. Para ajudar os cálculos, considere o seguinte exemplo: injetar 4 camundongos experimentais e 4 de controle, cada um pesando 25 g, com 50 mg de plasmídeo de DNA por mouse. Para determinar a quantidade de DNA necessária neste caso, calcular com cinco ratinhos por grupo de: 5 x 50 mg = 250 ug de ADN necessário para cada grupo. </li></ol></li><li> Determinar a quantidade de soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9%) necessária, assumindo 10% do peso do corpo para a injecção de cada rato. <ol><li> De acordo com o exemplo acima, injecta-se 25 g de cada ratinho, com 50 ug de DNA de plasmídeo em 2,5 ml de solução salina (2,5 g de líquido). </li><li> Ao determinar a quantidade de soro necessária para todo um grupo de ratinhos, assumir a injecção de um rato por grupo adicional para permitir a colocação adequada das seringas. Considerando-se a experiência dada, calcular a quantidade de soro necessária para 5 ratinhos em cada grupo: 5 x 2,5 ml = 12.5 ml de solução salina por cada grupo (ou 25 ml no total). Nota: Se os ratos pertencentes ao mesmo grupo não são o mesmo peso (diferença de mais de 10% do peso corporal), preparar injecção mistura separadamente. </li></ol></li><li> Use conservantes e sem endotoxinas solução salina, estéril, que foi aprovado para uso humano, em 10 ml, frascos de uso múltiplo. </li><li> Utilizando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm) acoplada a uma ponta luer de uma seringa de 20 ml,retirar o líquido a partir de frascos de soro fisiológico e esvaziar as seringas para um tubo cónico de 50 ml. Para ajudar a pipetagem precisa de solução salina, durante a preparação das misturas de injecção de DNA com solução salina, solução salina recolher mais do que o necessário para a injecção de todos os ratinhos na experiência. Para o experimento acima, retirar salina de 3 frascos de 10 ml (um total de cerca de 30 ml), mesmo que o valor calculado de soro necessário para a experiência é de apenas 25 ml. </li><li> Pipetar a quantidade calculada de DNA em um tubo de 50 ml diferente. Tome cuidado para não tocar no lado do tubo com o corpo da pipeta para evitar a introdução de endotoxina. De acordo com o exemplo, uma pipetagem de 250 ug de controlo e 250 ug de DNA do plasmídeo experimental em tubos cónicos separadas. </li><li> Adicionar a quantidade necessária de solução salina para o ADN utilizando uma pipeta serológica. Considerando a experiência da amostra, pipeta 12,5 ml de solução salina a cada uma das misturas mestres (experimental e controle). </li><li> Permitir todas as soluções para alcançartemperatura ambiente antes da injecção. </li></ol></li><li> Preparação de seringas <ol><li> Para cada rato, preencher um, 3 ml, a seringa luer-lock esterilizado com a mistura de ADN-salina estéril usando uma agulha de calibre 20 (0.9 mm x 25 mm). Tome cuidado para evitar bolhas de ar. Evitar o uso de seringas de volume mais elevadas que a taxa de fluxo de injecção não pode ser controlada muito bem, e é difícil de manipular as seringas maiores em um lado. Ejetar qualquer mistura DNA-salina em excesso de volta para o tubo cônico, pois isso pode ser reutilizado. </li><li> Mudar a agulha a uma estéril, agulha de calibre 27. Encha a agulha com o líquido completamente sem a introdução de bolhas de ar. Ajustar o volume da mistura de ADN-salina como calculada com base no peso do rato. </li><li> Não permita que a agulha desencapada para tocar em qualquer superfície não-estéril. Se necessário, as agulhas podem ser re-tampado, utilizando a técnica com uma só mão: coloque a tampa sobre uma superfície plana, insira a agulha sem segurar a tampa com a outra mão e pressione a agulha tampadacontra um objecto firme para fixar a tampa para a agulha. As seringas estão agora prontos para injectáveis-veia da cauda. </li></ol></li></ol> 4. Entrega DNA hidrodinâmica <ol><li> Note-se que os ratos a anestesia podem reduzir a viabilidade. Evite realizar HGD em uma sala que é muito frio, pois isso também vai reduzir a viabilidade. Se a sala tem uma temperatura ambiente de 20 ° C ou se estiver usando anestesia, coloque os ratos em uma almofada de aquecimento fixada em 37 ° C pós procedimento para evitar a perda de quaisquer animais. Se estiver usando anestesia, garantir que a boca e focinho do mouse são enquanto desobstruída na almofada de calor e observe o mouse até que recupere totalmente. Não reter água ou comida dos ratos antes de HGD. </li><li> Aqueça os ratos para dilatar os vasos sanguíneos. <ol><li> Coloque a gaiola do rato (com cama incluídos) sobre uma almofada de aquecimento durante 5 minutos de modo que a temperatura do leito é de cerca de 38-39 ° C. A temperatura deve ser baixa o suficiente para manter os ratos na almofada de calor para umperíodo prolongado. </li><li> Alternativamente, coloque o mouse em um limitador de acesso dorsal com restrição mínima. Aqueça a cauda do rato por 1 min delicadamente segurando-a com um pedaço de gaze umedecida em água morna. Permitir mouse para reposicionar, se necessário. Seque a cauda com um lenço de papel para secar. </li><li> Alternativamente, rato quente, colocando a gaiola sob uma lâmpada de calor para não mais de 2 min. Se estiver usando uma lâmpada de calor, tenha cuidado para evitar o superaquecimento do mouse. </li></ol></li><li> Grande volume de injecção na veia da cauda <ol><li> Imobilizar um acesso restrainer dorsal sobre uma superfície plana por fita laboratório. </li><li> Segurando pela cauda, ​​coloque o mouse suavemente para o limitador e insira a ficha. Usar a menor quantidade de retenção como necessário para manter a cauda imobilizada. Certifique-se de que o mouse está respirando livremente. </li><li> Se o mouse está em perigo grave a qualquer momento durante o procedimento, remova o mouse do limitador imediatamente e deixe-a descansar. </li><li> Posicione o mouse parauma das veias caudal lateral é visível. Localizar as veias caudais laterais pelo olhar directamente para baixo, para a parte traseira do rato: a linha vermelha em execução no meio da cauda é uma artéria, enquanto que as linhas azuis em ambos os lados da cauda são as veias caudais laterais. </li><li> Limpe a cauda do rato cuidadosamente com um algodão embebido em álcool. </li><li> Usando a mão não injetáveis, segure a cauda com força entre os dedos indicador e médio, de modo que a cauda passa sob o dedo indicador, mais de meio e terceiro dedos e sob o dedo mindinho. Permitir que o polegar para permanecer livre para se mover. (Figura 1A) </li><li> Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque. </li><li> Pegue a seringa carregada com a mão-de injecção e segurá-la por barril entre o polegar e os outros quatro dígitos. Não se agarre o êmbolo. </li><li> Colocar a seringa de paralelo para a cauda com a agulha apontando para o corpo do rato eo bisel (borda inclinada) da agulha virado para cima. </li><li> Insira a agulha na veia da cauda. Continuar com a injecção apenas se a veia está localizada correctamente, o que é evidente a partir da agulha deslizante em qualquer resistência. Note-se que a profundidade de inserção da agulha é uma matéria de preferência pessoal no entanto, a inserção completa não é recomendada devido a um risco aumentado de ruptura da veia. Evite mover a agulha. </li><li> Usando o polegar da mão-holding cauda, ​​fechar-se no centro da agulha e pressione hub contra a cauda para manter a agulha na posição. Não aplique pressão extrema e não se apegar eixo da agulha, como estes irão impedir o fluxo de líquido na veia. Segurar a cauda com o dedo indicador frouxamente neste ponto de modo a não impedir a injecção (Figura 1A). </li><li> Re-posicione a mão segurando uma seringa de modo que o dedo indicador eo dedo médio estão segurando o flange eo polegar está na extremidade do êmbolo (Figure 1A). </li><li> Pressionar para baixo sobre o êmbolo de um, um movimento contínuo e de injectar o volume total de líquido em 6-8 seg. </li><li> Retire a agulha da veia e parar o sangramento aplicando pressão suave para a cauda com um tecido. </li><li> Remover mouse do limitador e local rato em uma gaiola de recuperação colocado em cima de uma almofada de aquecimento (roupa de cama deve ser 37-38 ° C). Se a sala de injeção é frio, esta etapa é fundamental para a sobrevivência do mouse. Segure a cauda do rato até que o sangramento parar completamente. </li><li> Observe o mouse por 1 hora após o parto DNA hidrodinâmico. Um período inicial de respiração ofegante e imobilidade é normal devido à arritmia temporária causada por HGD mas certifique-se que o rato mostra sinais de recuperação em cerca de 5 min. Se a respiração do mouse torna-se extremamente superficial, massageie suavemente o abdome do mouse para facilitar a respiração. Observam que a taxa de recuperação pode ser ligeiramente influenciada pela estirpe de ratinho utilizada. </li><li> Voltar ratoa gaiola de habitação e garantir que o mouse tem uma abundante oferta de alimentos e água. </li></ol></li><li> Grande volume de injeção na veia da cauda usando uma posição alternativa mão <ol><li> Coloque o mouse no limitador e se preparar para injeção seguindo os passos 4.3.1 através 4.3.5, conforme descrito anteriormente. </li><li> Descanse a mão não injetáveis ​​em uma superfície plana, com quatro dedos dobrados em um ângulo de noventa graus. Os dedos (todos excepto o polegar) deve assentar em cima uns dos outros, criando uma plataforma. Segure a cauda do rato entre o polegar eo dedo indicador (Figura 1B). </li><li> Com a outra mão, limpe a área a ser injetado novamente com um algodão embebido em álcool. Permitir que a área seque. </li><li> Agarrar a seringa com a mão-de injecção e segurá-la até ao rebordo e a extremidade do êmbolo, pronto para injecção. </li><li> Conclua o procedimento, seguindo este protocolo a partir do passo 4.3.9 até a etapa 4.3.17, conforme descrito anteriormente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Miao, C. H., Thompson, A. R., Loeb, K., Ye, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+and+therapeutic-level+hepatic+gene+expression+of+human+factor+IX+after+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term and therapeutic-level hepatic gene expression of human factor IX after naked plasmid transfer in vivo.</a> Mol Ther. 3, 947-957 (2001).</li>
<li>Magin-Lachmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+delivery+of+intact+BAC+DNA+--+comparison+of+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo delivery of intact BAC DNA -- comparison of different methods.</a> J Gene Med. 6, 195-209 (2004).</li>
<li>Chang, J., Sigal, L. J., Lerro, A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+the+human+hepatitis+delta+virus+genome+Is+initiated+in+mouse+hepatocytes+following+intravenous+injection+of+naked+DNA+or+RNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of the human hepatitis delta virus genome Is initiated in mouse hepatocytes following intravenous injection of naked DNA or RNA sequences.</a> J Virol. 75, 3469-3473 (2001).</li>
<li>Giladi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+inhibits+hepatitis+B+virus+replication+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA inhibits hepatitis B virus replication in mice.</a> Mol Ther. 8, 769-776 (2003).</li>
<li>Kobayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector-based+in+vivo+RNA+interference%3A+dose-+and+time-dependent+suppression+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Vector-based in vivo RNA interference: dose- and time-dependent suppression of transgene expression.</a> J Pharmacol Exp Ther. 308, 688-693 (2004).</li>
<li>Layzer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+activity+of+nuclease-resistant+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Rna%22%5BJournal%5D)">In vivo activity of nuclease-resistant siRNAs.</a> Rna. 10, 766-771 (2004).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA interference in adult mice.</a> Nature. 418, 38-39 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+hepatitis+C+translational+initiation+in+vitro%2C+in+cultured+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Determinants of hepatitis C translational initiation in vitro, in cultured cells and mice.</a> Mol Ther. 5, 676-684 (2002).</li>
<li>McCaffrey, A. P., Meuse, L., Karimi, M., Contag, C. H., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+potent+and+specific+morpholino+antisense+inhibitor+of+hepatitis+C+translation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice.</a> Hepatology. 38, 503-508 (2003).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroporation+as+the+mechanism+of+hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydroporation as the mechanism of hydrodynamic delivery.</a> Gene Ther. 11, 675-682 (2004).</li>
<li>Kobayashi, N., Kuramoto, T., Yamaoka, K., Hashida, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+uptake+and+gene+expression+mechanisms+following+intravenous+administration+of+plasmid+DNA+by+conventional+and+hydrodynamics-based+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Hepatic uptake and gene expression mechanisms following intravenous administration of plasmid DNA by conventional and hydrodynamics-based procedures.</a> J Pharmacol Exp Ther. 297, 853-860 (2001).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Hirata, K., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+procedure+involves+transient+hyperpermeability+in+the+hepatic+cellular+membrane%3A+implication+of+a+nonspecific+process+in+efficient+intracellular+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based procedure involves transient hyperpermeability in the hepatic cellular membrane: implication of a nonspecific process in efficient intracellular gene delivery.</a> J Gene Med. 6, 584-592 (2004).</li>
<li>Bonamassa, B., Hai, L., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+and+its+applications+in+pharmaceutical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery and its applications in pharmaceutical research.</a> Pharm Res. 28, 694-701 (2011).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+principle%2C+limitations%2C+and+recent+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: principle, limitations, and recent progress.</a> Aaps J. 11, 671-681 (2009).</li>
<li>Gao, X., Kim, K. S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+gene+delivery%3A+what+we+know+and+what+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Aaps+J%22%5BJournal%5D)">Nonviral gene delivery: what we know and what is next.</a> Aaps J. 9, (2007).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+progress+and+prospects%3A+hydrodynamic+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene therapy progress and prospects: hydrodynamic gene delivery.</a> Gene Ther. 14, 99-107 (2007).</li>
<li>Kobayashi, N., Nishikawa, M., Takakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydrodynamics-based+procedure+for+controlling+the+pharmacokinetics+of+gene+medicines+at+whole+body%2C+organ+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">The hydrodynamics-based procedure for controlling the pharmacokinetics of gene medicines at whole body, organ and cellular levels.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 713-731 (2005).</li>
<li>Al-Dosari, M. S., Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery.</a> Adv Genet. 54, 65-82 (2005).</li>
<li>Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+delivery+of+the+Sleeping+Beauty+transposon+system+to+livers+of+mice+by+hydrodynamic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preferential delivery of the Sleeping Beauty transposon system to livers of mice by hydrodynamic injection.</a> Nat Protoc. 2, 3153-3165 (2007).</li>
<li>Osorio, F. G., de la Rosa, J., Freije, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence-based+in+vivo+monitoring+of+NF-kappaB+activity+through+a+gene+delivery+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Luminescence-based in vivo monitoring of NF-kappaB activity through a gene delivery approach.</a> Cell Commun Signal. 11, (2013).</li>
<li>Knapp, J. E., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+delivery+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic delivery of DNA.</a> Methods Mol Biol. 245, 245-250 (2004).</li>
<li>Yang, J., Chen, S., Huang, L., Michalopoulos, G. K., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+expression+of+naked+plasmid+DNA+encoding+hepatocyte+growth+factor+in+mice+promotes+liver+and+overall+body+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sustained expression of naked plasmid DNA encoding hepatocyte growth factor in mice promotes liver and overall body growth.</a> Hepatology. 33, 848-859 (2001).</li>
<li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4, 333-341 (2002).</li>
<li>Hen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+foreign+genes+in+chicks+by+hydrodynamics-based+naked+plasmid+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Domestic+animal+endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of foreign genes in chicks by hydrodynamics-based naked plasmid transfer in vivo.</a> Domestic animal endocrinology. 30, 135-143 (2006).</li>
<li>Eastman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+catheter-based+procedures+for+transducing+the+isolated+rabbit+liver+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of catheter-based procedures for transducing the isolated rabbit liver with plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 13, 2065-2077 (2002).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13, 1696-1702 (2006).</li>
<li>Vanden Bossche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+general+aspects+of+the+distribution+and+epidemiology+of+bovine+trypanosomosis+in+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Some general aspects of the distribution and epidemiology of bovine trypanosomosis in southern Africa.</a> Int J Parasitol. 31, 592-598 (2001).</li>
<li>Fevre, E. M., Picozzi, K., Jannin, J., Welburn, S. C., Maudlin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+Epidemiology+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: Epidemiology and control.</a> Adv Parasitol. 61, 167-221 (2006).</li>
<li>Lugli, E. B., Pouliot, M., Portela Mdel, P., Loomis, M. R., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primate+trypanosome+lytic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of primate trypanosome lytic factors.</a> Mol Biochem Parasitol. 138, 9-20 (2004).</li>
<li>Pays, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trypanolytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The trypanolytic factor of human serum.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 477-486 (2006).</li>
<li>Raper, J., Fung, R., Ghiso, J., Nussenzweig, V., Tomlinson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+trypanosome+lytic+factor+from+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel trypanosome lytic factor from human serum.</a> Infect Immun. 67, 1910-1916 (1999).</li>
<li>Vanhamme, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+is+the+trypanosome+lytic+factor+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I is the trypanosome lytic factor of human serum.</a> Nature. 422, 83-87 (2003).</li>
<li>Nielsen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haptoglobin-related+protein+is+a+high-affinity+hemoglobin-binding+plasma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Haptoglobin-related protein is a high-affinity hemoglobin-binding plasma protein.</a> Blood. 108, 2846-2849 (2006).</li>
<li>Molina-Portela Mdel, P., Lugli, P., Recio-Pinto, E., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+lytic+factor%2C+a+subclass+of+high-density+lipoprotein%2C+forms+cation-selective+pores+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome lytic factor, a subclass of high-density lipoprotein, forms cation-selective pores in membranes.</a> Mol Biochem Parasitol. 144, 218-226 (2005).</li>
<li>Perez-Morga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+L-I+promotes+trypanosome+lysis+by+forming+pores+in+lysosomal+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein L-I promotes trypanosome lysis by forming pores in lysosomal membranes.</a> Science. 309, 469-472 (2005).</li>
<li>Molina-Portela, M. P., Samanovic, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+apolipoprotein+components+within+the+trypanosome+lytic+factor+complex+revealed+in+a+novel+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of apolipoprotein components within the trypanosome lytic factor complex revealed in a novel transgenic mouse model.</a> J Exp Med. 205, 1721-1728 (2008).</li>
<li>Oli, M. W., Cotlin, L. F., Shiflett, A. M., Hajduk, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+resistance-associated+protein+blocks+lysosomal+targeting+of+trypanosome+lytic+factor+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Serum resistance-associated protein blocks lysosomal targeting of trypanosome lytic factor in Trypanosoma brucei.</a> Eukaryot Cell. 5, 132-139 (2006).</li>
<li>Thomson, R., Molina-Portela, P., Mott, H., Carrington, M., Raper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery+of+baboon+trypanosome+lytic+factor+eliminates+both+animal+and+human-infective+African+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery of baboon trypanosome lytic factor eliminates both animal and human-infective African trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 19509-19514 (2009).</li>
<li>Genovese, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+trypanolytic+ApoL1+variants+with+kidney+disease+in+African+Americans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Association of trypanolytic ApoL1 variants with kidney disease in African Americans.</a> Science. 329, 841-845 (2010).</li>
<li>Tzur, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+the+APOL1+gene+are+highly+associated+with+end+stage+kidney+disease+risk+previously+attributed+to+the+MYH9+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in the APOL1 gene are highly associated with end stage kidney disease risk previously attributed to the MYH9 gene.</a> Hum Genet. 128, 345-350 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14, 129-137 (2007).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Quando realizada corretamente, HGD é um meio extremamente eficaz e segura de entrega transgene. Os passos críticos para o sucesso do HGD são: 1) fornecer a quantidade certa de ADN em um grande volume de veículo salino 2) na veia da cauda do rato 3) em menos de 8 segundos. Embora o próprio processo de injecção inegavelmente requer alguma destreza manual, o sucesso deste procedimento de seis segunda encontra-se frequentemente em uma preparação cuidadosa da experiência. A quantidade de ADNp nec...

Desde sua primeira descrição por Liu et al. E Zhang et al., Entrega gene hidrodinâmico (HGD) tornou-se uma ferramenta valiosa para estudar a função do gene em roedores sistemas modelo 1, 2. A técnica envolve a injecção rápida (5-7 segundos) de um grande volume (8-12% de peso corporal) de solução para a veia da cauda dos ratinhos a fim de facilitar a absorção de ADN de plasmídeo por as células de órgãos alvo 1, 2. Estas condições conduzem a expressão do gene robusto no fígado e menos expressão do gene no rim, baço, pulmão e coração. A injecção de 10 ug de pCMV-LacZ plasmídeo pode transfectar tanto como 40% dos hepatócitos, tornando HGD o mais eficiente, não-viral in vivo, o método de entrega de genes para uma data. Ao contrário dos portadores virais, pDNA é fácil de preparar, não provocar uma resposta imunológica no hospedeiro roedor 3 e não representa um risco para a saúde por meio da recombinação com finalvírus ogenous. Além disso, uma vez que as moléculas de ADN entregue por HGD não precisa de embalagem, este método é adequado para a entrega de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) tão grandes como 150 kb 4. Outros tipos de moléculas que foram entregues por um método de hidrodinâmica incluem ARN 5-10, morfolinos 11, proteínas de 12, 13 e outras moléculas pequenas, 12, 14. As vantagens e desvantagens de HGD sobre outros métodos de entrega tem sido discutido em excelentes revisões na literatura 15-20 e um número de autores fornecida uma descrição detalhada do procedimento 21-23. Introduzindo transgenes em murganhos por HGD é segura e eficaz 1-3, 24 e o método tem sido utilizado com sucesso em ratos comparáveis ​​25. Com certas modificações, as experiências de prova-de-conceito foram realizadas em 26 galinhas, rabBits 27 e 28 porcos, embora, a aplicação vivo no da técnica em animais maiores continua a ser um desafio. Ao utilizar este método, uma outra limitação é comum que muitos dos vectores de expressão de mamíferos disponíveis não possuem os componentes para realizar um persistente, elevado nível de expressão do gene. Usando um plasmídeo, a expressão do gene de pCMV-Luc em órgãos alvo é evidente tão cedo quanto 10 minutos após HGD, no entanto, o elevado nível inicial, a expressão cai drasticamente, na primeira semana após a injecção 1. A expressão do transgene a longo prazo, é possível, dependendo do promotor e o intrão utilizado na criação do plasmídeo 3, 24 injecções no entanto, a manutenção da expressão de genes de alto nível geralmente requer repetidas. Por esta razão, HGD pode ser menos adequado para estudar doenças crônicas, que são resultado de exposição a longo prazo às proteínas prejudiciais ou produtos de proteína. Com estas limitações, HGD é uma ferramenta extremamente poderosa para estudar a pocial papel de um gene e o efeito de que os mutantes in vivo, bem como os efeitos terapêuticos e regulação de proteínas e para o estabelecimento de modelos animais da doença (para uma revisão, ver 15). Por exemplo, HGD pode ser utilizado para designar uma função de domínios e aminoácidos de proteínas através da introdução de várias construções de gene individualmente em ratinhos que têm os respectivos genes batido para fora. Além disso, esta técnica pode ser usada em qualquer estirpe de ratinho. Este protocolo descreve HGD em ratos com um foco sobre os aspectos técnicos necessários para alcançar a transfecção de sucesso: a inserção da agulha correta para a veia, o volume de injeção e velocidade de entrega. A aplicação deste método é demonstrado em um modelo do rato da tripanossomíase Africano, uma doença fatal dos seres humanos e de animais 29, 30. Enquanto várias espécies de tripanossomas causar doenças em animais, a maioria não pode causar a doença em humanos devido à inata complexos imunes em blood chamados fatores líticas tripanossomas (Tlfs) 29, 31, 32. Estes, lipoproteínas de alta densidade que formam poros (HDL) contêm dois, proteínas primatas específicas exclusivas:. HPR, o ligante, o que facilita a captação de FPTs em tripanossomas e APOL-I, o componente lítica 31, 33-38 Trypanosoma brucei rhodesiense é capaz de infectar seres humanos, devido à expressão de uma proteína associada a resistência soro (SRA), que se liga e neutraliza humano APOL-I 34, 39. Babuíno TLF não é neutralizado por SRA, devido à sua divergente APOL-I da proteína 40. Como relatado anteriormente, utilizando um vector de expressão de mamífero (pRG977), a expressão transgénica do babuíno componentes TLF em ratinhos confere protecção contra tripanossomas humanos-infeccioso 40. Os dados representativos aqui apresentados demonstram como a entrega do gene hidrodinâmico pode ser aplicado para estudar os efeitos terapêuticos de uma proteína.

<table><tbody><tr><td>Toalhete de Preparação de Álcool</td><td>Webcol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>AST kit, Amplite Colorimetric</td><td>AAT Bioquest</td><td>13801</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico, 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>KIMTECH</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador de Cauda de Mouse</td><td>Braintree Scientific</td><td>MTI RST</td><td>Ou equivalente</td></tr><tr><td>Agulha, 20 Gx 1 (0.9mmx25mm)</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Agulha, 27 Gx 1/2 (0.9mmx25mm)</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>pRG977 (vetor de expressão de mamíferos)</td><td>Regeneron Pharmaceuticals</td><td></td><td>Acordo de Transferência de Material necessário</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio, 0.9% INJ USP 10 ml, Hospira&nbsp;</td><td>Seringa</td><td>Fisher NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>, 3 ml, ponta Luer-Lok</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Luer Lock necessária para suportar a pressão do HGD</td></tr></tbody></table>

expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica gene entrega em ratos

Transient Expression of Proteins by Hydrodynamic Gene Delivery in Mice

Expressão eficiente de transgenes in vivo é de fundamental importância no estudo da função dos genes e desenvolvimento de tratamentos para doenças. Nos últimos anos, a entrega do gene hidrodinâmico (HGD) surgiu como um método simples, rápido, seguro e eficaz para a entrega de transgenes em roedores. Esta técnica baseia-se na força gerada pela rápida injecção de um grande volume de solução fisiológica para aumentar a permeabilidade das membranas celulares dos órgãos perfundidos e assim entregar o ADN em células. Uma das principais vantagens de HGD é a capacidade para introduzir os transgenes em células de mamíferos usando o DNA de plasmídeo despido (ADNp). A introdução de um gene exógeno usando um plasmídeo é minimamente trabalhoso, altamente eficiente e, ao contrário de transportadores virais, notavelmente segura. HGD foi inicialmente utilizado para entregar genes em ratos, é agora usado para proporcionar uma vasta gama de substâncias, incluindo oligonucleótidos, cromossomas artificiais, ARN, proteínas e pequenas moléculas em ratinhos, ratazanase, num grau limitado, de outros animais. Este protocolo descreve HGD em ratos e se concentra em três aspectos-chave do método que são fundamentais para realizar o procedimento com sucesso: correta inserção da agulha na veia, o volume de injeção ea velocidade de entrega. Os exemplos são apresentados para mostrar a aplicação deste método para a expressão transitória de dois genes que codificam para proteínas secretadas, primatas-específica, apolipoproteína LI (APOL-I) e proteína relacionada com haptoglobina (HPR).

O posicionamento correcto da agulha na veia da cauda do rato (conforme ilustrado na Figura 1) é um pré-requisito para o sucesso de entregar um transgene através de transfecção à base de hidrodinâmica. Muitas vezes, a parte mais difícil da técnica, no entanto, é a retenção da agulha dentro da veia da cauda, ​​sem movimento, de modo que todo o volume de injecção pode ser entregue dentro de um período de 6-8 s. Os pequenos erros durante o processo de injeção pode resultar em muito reduzida eficiência de tr...

Na transfecção in vivo de ADN nu por entrega de genes hidrodinâmico apresenta genes no tecido de um animal com uma resposta inflamatória mínima. Uma quantidade suficiente de produto do gene são gerados de tal forma que a função do gene e regulação, bem como a estrutura e função da proteína pode ser analisado.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Efficient expression of transgenes in vivo is of critical importance in studying gene function and developing treatments for diseases. Over the past ...

O objetivo geral deste procedimento é expressar temporariamente genes em camundongos utilizando a entrega hidrodinâmica de genes ou HGD para isso. Os camundongos são pesados e um volume apropriado de solução salina contendo plasmídeo de DNA é preparado e carregado em uma seringa.O camundongo é então aquecido para dilatar os vasos sanguíneos da cauda e colocado em um dispositivo de contenção utilizando a artéria dorsal. Como referência, as veias coccígeas laterais são localizadas e a mistura de DNA em solução salina é injetada em uma das veias coccígeas. Por fim, o camundongo é removido do dispositivo de contenção e colocado sobre uma almofada aquecida para recuperação.Por fim, podem-se obter resultados que demonstram expressões de transgenes por meio do monitoramento dos níveis de proteínas no sangue por meio de Western blot. A principal vantagem dessa técnica em comparação com outros métodos existentes, como a expressão por transfusão viral, é que a entrega gênica hidrodinâmica permite o uso de DNA plasmidial nu, que é fácil de produzir, seguro para uso e apresenta menos limitações de tamanho. Eu sou Daniela Kovacic.Sou pós-doutorando no laboratório da Dra. Jane Raper e demonstrarei este método. Inicie este procedimento utilizando uma caneta Sharpie para marcar as costas de camundongos brancos, indicando seu grupo experimental; reaplique as marcas ao longo do tempo conforme necessário. No dia do experimento, pese cada camundongo individualmente em uma bandeja ou balde para animais colocado sobre uma balança laboratorial digital.Registre o peso de cada camundongo seguindo as instruções do documento anexo. Prepare quantidade suficiente da mistura de injeção para cada camundongo a ser injetado, mais um adicional, pois o carregamento adequado das seringas exigirá um pouco a mais da mistura. Utilize solução salina estéril livre de conservantes e endotoxinas, aprovada para uso humano.Após deixar todas as soluções atingirem a temperatura ambiente, acople uma agulha estéril de 20 gauge a uma seringa de três mililitros com fechamento de segurança e aspire a mistura de DNA em solução salina x. Prepare uma seringa para cada injeção. Certifique-se de não gerar bolhas de ar.Evite usar seringas de maior volume, pois o fluoreto de injeção não pode ser controlado muito bem e é difícil manipular seringas maiores com uma única mão. Em seguida, troque para uma agulha estéril de 27 graus. Ajuste o volume da mistura de DNA com solução salina conforme calculado.Ejete qualquer solução excedente de volta no tubo cônico para uso posterior. Isso encherá a agulha, sem introduzir bolhas de ar.Não permita que a agulha descoberta entre em contato com qualquer superfície não estéril para proteger a agulha antes das injeções. Reencape-a utilizando uma técnica com uma única mão. Coloque a tampa sobre uma superfície plana e, sem segurá-la com a outra mão, insira a agulha e pressione a agulha encapada contra um objeto firme.Para fixar a tampa, prepare todas as seringas necessárias da mesma maneira. Faça isso antes de iniciar as injeções. Coloque a gaiola do camundongo com a cama incluída sobre uma placa aquecida por cinco minutos, de modo que a temperatura da cama seja aproximadamente de 38 a 39 graus Celsius.Isso dilatará os vasos sanguíneos dos camundongos. Observe que a anestesia não é recomendada para este procedimento enquanto os camundongos estão aquecendo; use fita laboratorial para imobilizar um suporte de acesso dorsal sobre uma superfície plana. Após cinco minutos, retire a tampa da seringa que será usada para a primeira injeção nos camundongos.Coloque a seringa na tampa para evitar que a agulha descoberta entre em contato com superfícies sujas. Tanto para segurança quanto para limpeza. Mantenha apenas uma agulha descoberta por vez.Em seguida, pegue um camundongo pela cauda. Coloque-o suavemente no aparato de contenção e insira a tampa. Utilize o mínimo de contenção necessário para manter a cauda imobilizada.Certifique-se de que o camundongo esteja respirando livremente. Em seguida, localize as veias laterais da cauda observando diretamente a parte traseira do camundongo. A linha vermelha que percorre o meio da cauda é uma artéria.Embora as linhas azuis em ambos os lados da cauda sejam as veias coccígeas laterais, posicione o camundongo de modo que uma das veias coccígeas laterais fique visível. Em seguida, limpe a cauda do camundongo cuidadosamente com um cotonete embebido em álcool. Com a mão não injetora, segure firmemente a cauda entre o indicador e o dedo médio, de modo que a cauda passe sob o indicador, sobre o médio e o anelar, e sob o dedo mínimo.Permita que o polegar permaneça livre para mover-se. Com a outra mão, utilize um cotonete com álcool para limpar a área de injeção. Novamente, deixe a área secar.Agora, com a mão que injeta, pegue a seringa carregada e segure-a pelo corpo entre o polegar e os outros quatro dedos. Não segure o êmbolo. Posicione a seringa paralelamente à cauda, com a agulha apontando em direção ao corpo do camundongo e o bisel ou borda inclinada da agulha voltada para cima.Insira a agulha na veia da cauda. Se a veia foi localizada corretamente, a agulha deslizará sem resistência; mantendo a agulha estável, use o polegar da mão que segura a cauda para comprimir o conector da agulha e pressioná-lo contra a cauda, mantendo assim a agulha em posição. Não aplique pressão excessiva nem segure o corpo da agulha, pois isso impedirá o fluxo de líquido para dentro da veia.Em seguida, reposicione a mão que segura a seringa de modo que o indicador e o dedo médio segurem a aba e o polegar fique na extremidade do êmbolo. Pressione o êmbolo em um único movimento contínuo e injete todo o volume do líquido em seis a oito segundos. Retire a agulha da veia e, com um lenço, aplique pressão suave sobre a cauda para interromper qualquer sangramento.Aqui, o processo de injeção é mostrado em tempo real. Observe que a inserção completa da agulha não é recomendada devido ao aumento do risco de rompimento da veia. Após a injeção, retire o camundongo do dispositivo de contenção e coloque-o em uma gaiola de recuperação posicionada sobre um aquecedor. Se o ambiente da sala de injeção estiver frio, este passo é essencial para a sobrevivência do camundongo.Segure a cauda do camundongo até que o sangramento pare completamente. Observe o camundongo por uma hora após a entrega hidrodinâmica de DNA.Um período inicial de ofegante e imobilidade é normal, mas certifique-se de que o camundongo apresente sinais de recuperação. Aproximadamente cinco minutos após o camundongo ter se recuperado, devolva-o à gaiola de alojamento e garanta que ele tenha suprimento abundante de alimento e água. Em seguida, demonstraremos a injeção na cauda utilizando uma posição alternativa da mão.Este método é particularmente útil quando é necessário injetar camundongos mais próximos da base da cauda. Por exemplo, ao corrigir uma injeção mal-sucedida no mesmo dia ou ao injetar camundongos com caudas mais curtas, prepare o camundongo para a injeção e posicione-o em um dispositivo de contenção. Como antes, apoie a mão que não realiza a injeção sobre uma superfície plana com os quatro dedos dobrados em um ângulo de 90 graus, devendo os dedos repousar uns sobre os outros.Criando uma plataforma, segure a cauda do camundongo entre o polegar e o indicador. Com a outra mão, limpe a área a ser injetada com um cotonete umedecido em álcool. Deixe a área secar.Segure a seringa de injeção com a mão injetora e empunhe-a pelo flange e pela extremidade do êmbolo, pronta para a injeção. Em seguida, posicione a seringa paralelamente à cauda, com a agulha voltada para o corpo do camundongo e o bisel da agulha voltado para cima. Injete como anteriormente para avaliar se a adição de uma marcação de sinal em locais específicos da sequência interfere no processamento e na secreção corretos do APO de babuíno.A proteína APO L um foi expressa em camundongos injetados com um plasmídeo que carregava um dos três genes de APO L um de babuíno com diferentes marcações de histidina, e outro plasmídeo que carregava HPR de babuíno. O sucesso das injeções foi avaliado por meio de análise sanguínea ocidental dos níveis circulantes de HPR no sangue dos camundongos dois dias após a injeção. Como mostrado aqui, o HPR de babuíno foi altamente expresso no plasma de todos, exceto um dos camundongos transfectados, indicando que a HGD foi bem-sucedida.Pequenas quedas nos níveis de expressão, como observadas em um dos dois camundongos no B APO L um, grupo etiquetado um, geralmente são atribuídas a uma redução muito pequena na velocidade de injeção, de um a dois segundos. Aqui, a amostra de plasma na via um mostra ausência completa de expressão proteica. Isso indica uma falha na HGD, muito provavelmente devido à injeção incompleta do volume total do veículo de entrega. Para avaliar o efeito da etiqueta his na secreção do B APO L um, a expressão da etiqueta his também foi avaliada, conforme mostrado aqui.Não houve nenhuma detecção de proteína marcada com histidina nos grupos um e dois. O único grupo de camundongos que apresentou níveis detectáveis da proteína em seu plasma foi o grupo três. Em conjunto, esses dados indicam que a ausência da proteína marcada com histidina nos grupos um e dois é resultado de diferenças na expressão gênica ou no processamento proteico, e não de uma falha nas injeções.Ele também destaca a importância de incluir uma proteína marcadora na mistura de injeção para monitorar o sucesso da entrega gênica hidrodinâmica. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar os camundongos e as seringas e de como inserir a agulha na veia da cauda para a injeção rápida de DNA terapêutico com o objetivo de expressar genes em camundongos por meio da entrega gênica hidrodinâmica. O aspecto mais difícil deste procedimento é manter a agulha na posição correta durante toda a injeção.A agulha corretamente inserida pode sair de posição devido a movimentos acidentais da pessoa que está injetando ou do camundongo não anestesiado, o que reduz a chance de sucesso. Evitamos injetar camundongos com mais de 27 gramas de peso, pois o manuseio de uma seringa carregada com três ml de capacidade é mais difícil.Verificamos que camundongos com peso entre 23 e 27 gramas são os mais convenientes para a injeção. As veias de camundongos com peso inferior a 20 gramas podem ser pequenas demais para a injeção.

transient-expression-of-proteins-by-hydrodynamic-gene-delivery-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neste vídeo, apresentamos o protocolo de injeção hidrodinâmica de plasmídeos na pelve renal do rim de camundongo para transfecção de ácido nucleico. Essa técnica permite a entrega de plasmídeos específicos do órgão, utilizando o princípio da alta pressão hidrostática, que impulsiona com força os plasmídeos para o local específico sem causar lesão tecidual.

Injeção hidrodinâmica da pelve renal: uma técnica para entregar DNA diretamente em células renais de modelo murino

Este vídeo descreve a técnica de transfecção genética in vivo de hepatócitos murinos por injeção hidrodinâmica da veia da cauda. Este sistema de transfecção gera uma expressão de longo prazo do transgene nos hepatócitos.

Entrega de genes hidrodinâmicos: uma técnica para transfecção in vivo de DNA exógeno em hepatócitos murinos via injeção de veia da cauda

Os ratinhos transgénicos ou vectores virais têm sido utilizados para aumentar a expressão de proteína dentro do pulmão. No entanto, estas técnicas são demoradas e tecnicamente desafiante e têm efeitos fora do alvo, que pode confundir os resultados. O protocolo de transfecção de proteínas utiliza um reagente de transfecção à base de lipidos e uma microsprayer ultrafina para entregar uniformemente proteína activa a células do pulmão.

A transfecção de proteína de rato Lung

Apesar da importância funcional e clínico do...

Manipulação genética do rato em desenvolvimento Hipotálamo através<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

Neste manuscrito, é descrito um método para preparar vetores recombinantes do vírus adeno-associado 9 (rAAV9) para manipular a expressão gênica no coração de camundongos.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Este protocolo descreve um método para injetar plasmídeo no rim do rato através da pelve renal para produzir a expressão do transgene especificamente no rim.

Injeção hidrodinâmica pelve Renal para a expressão não-virais de proteínas no rim

Permite a injeção de veia cauda hidrodinâmica de vetores de integração baseada em transposon transfection estável de hepatócitos murino in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo prático para sistemas de transfeccao que permite a longo prazo expressão constitutiva de um transgene único ou expressão constitutiva e doxiciclina-inducible combinada de um transgene ou miR-shRNA no fígado.

Constitutivos e Inducible sistemas para modificação genética In Vivo dos hepatócitos de rato usando injeção de veia de cauda hidrodinâmica

Aqui, apresentamos um protocolo para promover a integração do transgene e produção de ratos transgénicos fundador com eficácia elevada por uma simples injeção de um vetor de Lentivirus no espaço de um oócito fertilizado perivitelline.

Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

Neste artigo, nós fornecemos que um protocolo detalhado para a expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino medula óssea derivada de macrófagos e células dendríticas. O método é baseado na transdução da medula óssea progenitores com construções retrovirais seguidas por diferenciação em macrófagos e dendríticas células em vitro.

Expressão de proteínas da fusão fluorescente em murino derivadas da medula óssea as células dendríticas e macrófagos

Este protocolo apresenta uma estrutura metodológica detalhada para a transgênese baseada em eletroporação de células cardíacas em corações de camundongos em desenvolvimento. Os recursos de vídeo fornecidos aqui facilitarão o aprendizado dessa técnica versátil.

Uma abordagem eficiente de transgênese para entrega de genes no coração embrionário de camundongos

Aprenda a expressão transiente de genes em camundongos usando entrega hidrodinâmica de DNA plasmidial. Este método minimiza a resposta inflamatória e permite análise funcional de proteínas in vivo.

Expressão transiente de proteínas por hidrodinâmica Gene Entrega em Ratos

Explorar mais vídeos