Name: In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a realizar estimulação optogenética in vivo no sistema nervoso central de roedores acordados e em movimento. Este protocolo detalha a configuração de sistemas a laser e a entrega de luz para regiões cerebrais específicas.

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Esses estudos foram financiados por doações recebidas do NIH (MH082876, DA023988).

! ATENÇÃO: Este protocolo envolve o uso de lasers da classe 3B e exigirá diretrizes de treinamento e segurança adequados a serem seguidos. Óculos de segurança deve ser usado em todos os momentos ao operar lasers, com procedimentos de alinhamento apresentando um risco particularmente elevado. Contactar o fornecedor de laser para determinar os óculos que irão proporcionar a atenuação máxima para um dado laser. Se estiver disponível, se inscrever em um curso de treinamento de segurança a laser institucional. Nunca utilize um laser sem o óculos de segurança e treinamento adequados. 1. Laser Aparelho Set-up Se for caso disso, os passos na secção 1 são designados como (A) ou (B) para diferenciar entre os sistemas de laser simples ou dupla, respectivamente. <ol><li> Anexar e garantir lasers à placa de ensaio. Breadboards são excelentes condutores de calor e agir como um dissipador de calor para evitar danos aos componentes internos do laser com o uso prolongado. </li><li> (A) Fixar a pré-las acopladoer a um 10 &quot;x 12&quot; placa de ensaio (ou como necessário) usando ¼-20 &quot;parafusos de fixação e as anilhas (Figura 2A). Se os furos breadboard não se alinham com os furos de montagem do laser, usar pequenas &#39;grampos de mesa&#39; para garantir a laser para breadboard. </li><li> (B) Se os dois lasers a utilizar têm muito diferentes alturas do feixe (&gt; ~ 1 cm), use pequenas 4 &quot;x 6&quot; breadboards para criar uma plataforma para um dos lasers. Anexar estas placas para as principais grandes 12 &quot;x 18&quot; placa de ensaio usando ¼-20 &quot;parafusos de fixação com arruelas, em seguida, anexar o laser para as placas menores usando parafusos de fixação ou grampos de mesa, como mostrado na Figura 2B. Fixe o outro laser diretamente à placa de ensaio usando parafusos de fixação ou uma variável grampo de mesa altura. Passo Crítica: Breadboards, parafusos e componentes ópticos podem ser adquiridos como imperial ou métrica que assim seja consistente na compra de itens; o padrão para este protocolo é imperial. </li><li> (A)Anexar uma espessura de jaqueta-se apegam flat / contato físico (FC / PC) patch cord ao acoplador (referido como um cabo de engate; veja a Figura 3) que está fisicamente conectado à frente do laser (Figura 2A). </li><li> (B) Passe o acoplador para um ¾ &quot;post óptica, então epóxi a articulação entre o acoplador e o topo do poste usando JB Kwik, ou epóxi semelhante, para evitar o afrouxamento e desalinhamento durante o uso. Fixe o correio para o placa de ensaio (como os buracos breadboard nem sempre se alinham com a colocação necessária de componentes ópticos, um investigador, adaptador de base de pedestal, e aperto garfo são usadas para proteger pós óptica do acoplador no lugar). Conecte um cabo de manobra de espessura de jaqueta (cabo de acoplador) para a parte de trás do engate. </li><li> (B) Insira o primeiro espelho de orientação para o laser azul no suporte cinemática, e anexá-lo à placa de ensaio usando um ¾ &quot;post óptica. Fixe este post para uma base de adapTer e fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e montagem postar diretamente na frente do laser azul com espelho inclinado a 45 ° para dirigir o laser em direção ao espelho dicróico. Use o padrão de grade de furos na placa de ensaio como um guia de alinhamento áspera. Uma vez que aproximadamente posicionado, use um parafuso ¼ &quot;-20 tampa para proteger o garfo de fixação à placa de ensaio (ver Figuras 2B, C). </li><li> (B) Insira o espelho dicróico em um suporte de cinemática e anexá-lo a um &quot;post óptica 1 e garantir diretamente à placa de ensaio. Posicione o espelho dicróico para a extrema esquerda de, e de acordo com, o espelho de laser azul. Ângulo do espelho dicróico em um ângulo de 45 ° de tal modo que a luz azul refletida fora do primeiro espelho é refletido no acoplador, em seguida, aperte o parafuso de fixação do titular cinemático para o cargo (ver Figuras 2B, C). </li><li> (B) Fixe o primeiro espelho de direção para o laser amarelo a um ¾ &quot;post óptica. Fixe o optical post para um adaptador de base e de fixação do garfo. Posicione o garfo de fixação e de pós-conjunto em frente do laser amarelo e ângulo do espelho em um ângulo de 45 ° tal que a luz amarela será direcionada para o segundo espelho de direção. Prenda o garfo de aperto no lugar com um ¼ &quot;-20 parafuso e uma arruela. </li><li> (B) Fixe o segundo espelho de direção para o laser amarelo a um &quot;post óptica 1. Ângulo do espelho de modo a que o feixe de luz amarela a partir do primeiro espelho irá ser reflectida através da dicróico e no acoplador (Figura 2C). Prenda o pós diretamente ao placa de ensaio e aperte o parafuso de montagem uma vez que o espelho é inclinado de forma adequada. Ajustes espelho Belas será feita usando as montagens espelho cinemáticas em uma etapa posterior. </li><li> (B) Anexar uma roda de filtro de densidade neutra para uma ¾ &quot;post óptica e colocar o cargo em um suporte pós ligado a uma base de montagem. Fixe o conjunto da placa de ensaio entre o primeiro e seespelhos amarelo cond usando um único ¼ &quot;-20 parafuso. Esta roda é usada para ajustar a energia de luz laser amarelo atingindo o acoplador. Dica: Individualmente aperte todos os componentes (como os parafusos que prendem os titulares espelho cinemáticas para o início de posts, e os fios que prendem adaptadores de base para o fundo de posts) antes de anexá-los à base. Use um veio de uma pequena chave sextavada nos fornecido através de-buracos em postos ópticos para obter torque suficiente. Isso vai evitar que os componentes se soltar durante o uso, necessitando de realinhamento. </li><li> Anexar um FC / PC para PC / adaptador de suporte em L FC para a placa de ensaio. </li><li> Opcional: Garantir um 1 x 2 50/50 mini-fibra cubo divisor directamente para a placa de ensaio para utilização simultânea estimulação in vivo de dois ou mais animais. Além disso, os cabos podem ser adicionadas para facilitar o movimento do conjunto de placa de ensaio (como visto na Figura 2A). </li></ol> 2. Laser Coupling (sem contato Estilo Coupling) Esta seção refere-se a dupla laser-set-up (Figura 2B). Alinhe o caminho laser azul interior antes de alinhar o caminho laser amarelo exterior. ! CUIDADO: Use um baixo consumo de energia de acoplamento da luz (~ 1 mW) para garantir a segurança dos olhos. Use óculos de segurança para ligar o laser e até a intensidade da luz é medida e considerados seguros. <ol><li> Definir os interruptores na parte de trás do laser para &quot;Curr&quot; (corrente) e modo de transístor-transístor lógica (TTL) + para a iluminação constante (como oposto para o modo analógico). Certifique-se de que o botão de energia na frente do condutor é fixado em zero. Ligue o laser ligando o piloto de primeira e, em seguida, a tecla de laser. </li><li> Ajuste lentamente o botão de alimentação localizado na parte frontal do controlador de laser para que ~ 1 mW luz laser está sendo emitida. Aguarde 10 - 15 minutos (ou conforme especificado pelo fabricante) para o laser para aquecer. </li><li> Conecte o cabo de fibra óptica testador diretamente para a free final do patch cord acoplador e ligue o testador de cabo (Figura 3A). Ajustar o ângulo do acoplador, de modo que o feixe de vermelho viaja em linha reta de volta em direcção ao centro do espelho dicróico. O caminho do feixe de luz vermelha emitida a partir do testador de cabo é o caminho exacto que a luz do laser de entrada precisará seguir a fim de ser acoplado para o laser. </li><li> Faça o alinhamento grosseiro: Use os botões laterais e horizontais nos espelhos cinemáticas para dirigir o feixe de luz do laser para o acoplador. As braçadeiras de pedestal pode precisar de ser ligeiramente afrouxado para reposicionar os espelhos e o acoplador. As montagens cinemáticas ainda deve ter algumas viagens disponíveis para mais ajustes finos. Não se preocupe se não houver luz azul está sendo emitida fora do patch cord anexado-acoplador neste momento. </li><li> Coloque um único pedaço de papel semi-translúcido diretamente na frente do espelho dicróico, entre o dicróicas e acoplador. Haverá tanto um azul e ared ponto neste papel do laser e do testador de cabo, respectivamente. Utilize papel que é translúcido o suficiente para ver tanto os pontos vermelhos e azuis simultaneamente a partir do mesmo lado do papel. </li><li> Faça ajustes finos para o primeiro espelho da direcção (ou seja, aquele mais próximo do laser, não o dicróicas), ajustando cuidadosamente os botões laterais e horizontais para alinhar o centro do ponto vermelho com o ponto azul. </li><li> Mover o papel para trás para o acoplador de modo a que seja directamente em frente do acoplador e ajustar os botões no segundo (isto é, dicróico) espelho para alinhar o feixe de laser com o feixe de vermelho. </li><li> Iterar os passos 2.6 e 2.7 até que o centro das vigas azul / amarelo e vermelho são exactamente alinhadas em ambas as posições (isto é, até que os feixes vermelhos e azuis são colineares). </li><li> Retirar o testador cabo do cabo do acoplador. A luz do laser deve agora ser emitida a partir da extremidade do cabo de remendo acoplador. </li><li> Determine eficiência de acoplamento através da medição da energia de luz emitida a partir da ponta da fibra do acoplador de cabo de remendo usando um medidor de potência. Use a configuração de 500 mW em fotodiodo do medidor de energia e alterar a configuração de (λ) de comprimento de onda para o azul (473 nm) ou luz amarela (635 nm) espectro dependendo o laser a ser utilizado. </li><li> Colocar a ponta da fibra perpendicular ao fotodiodo para obter uma leitura de potência. Comparar a energia de luz que entra no acoplador, para a energia de luz emitida a partir da extremidade da fibra. A eficiência de acoplamento de&gt; 80% é considerado muito bom. Muito pequenos ajustes na segunda espelho de orientação às vezes pode melhorar um pouco acoplamento. Em geral, quando o padrão de feixe a partir da extremidade da fibra de ligação é apertado um pequeno ponto central (sem anéis que o rodeiam), a eficiência de acoplamento para dentro do núcleo da fibra é óptima. </li><li> Repita os passos 2,1-2,11 para acoplamento laser amarelo, exceto usar os dois espelhos de direção para o laser amarelo (veja a Figura 2C). Será que nãot ajustar a posição do espelho dicróico ou alinhamento do laser azul será perdido. </li></ol> 3. Estimulação in vivo Optogenetic Certifique-se de que quaisquer procedimentos que envolvam o uso de animais são conduzidos de acordo com as diretrizes locais e nacionais e aprovado pelo correspondente Institutional Animal Care e do Comitê Use. <ol><li> Fibra óptica set-up (ver Figura 3B para a identificação dos diferentes tipos de cabos de remendo referido abaixo). Para estimular um único mouse, conecte o cabo de manobra de acoplamento a um cabo de correção de espessura de jaqueta usando o / FC adaptador de suporte em L FC diretamente ligado à placa de ensaio (ver Figura 4A). Para estimular a dois animais de um laser, conecte o cabo de manobra de acoplamento para dois cordões grossos de jaqueta usando o 1 x 2 50/50 mini-cubo (veja a Figura 4B). Para estimular a três ou mais animais, conecte o cabo de acoplador para um divisor de fibra multimodo usando o 1 x 2 mcube ini já anexado à placa de ensaio (ver Figura 4C). </li><li> Anexar um comutador / junta rotativa para as extremidades livres do splitter remendo cabo / fibra de espessura de jaqueta. Comutadores são essenciais, pois permitem a rotação da fibra com o movimento do roedor, o que impede o acúmulo de torque no cabo de manobra. Demasiada binário pode torcer cabos de, levar à ruptura, e interferir com o movimento natural do animal durante o ensaio. </li><li> Conecte o cabo de remendo animal para o comutador. </li><li> Anexar uma manga de divisão de ligação para o final de metal ponteira livre do cabo de remendo do animal (Figura 5). Não force a manga de todo o caminho até a ponteira; deixar ~ 0,5 cm da manga exposto como este é o que se conecta à fibra óptica implantado afixada ao animal (Figura 6). Passo Crítica: Sempre comprar mangas que contêm uma divisão para permitir a expansão da manga sobre ponteira de fibra implantado durante a ligação eremoção. Muito apertado de um ajuste pode causar trauma grave para o animal se o implante desaloja a partir do crânio ao tentar desconectar a manga do implante. Se isto não ocorrer, o animal deve ser retirado do estudo e recebem cuidados veterinário imediato. Da mesma forma, antes de usar um novo manga, pela primeira vez, &quot;quebrá-lo em &#39;por ligar e desligar um ferrolho até ele desconecta com a quantidade desejada de força. Tip: É fácil de quebrar uma fibra durante a remoção de uma manga que é rigidamente ligada a um ferrolho. Para evitar isso, empurrar o ferrolho para fora através da inserção de uma pequena haste de madeira dentro da extremidade aberta da manga (o identificador de um cotonete padrão é o tamanho correctos). </li><li> Conecte o condutor de laser azul para um gerador de pulsos, utilizando um cabo BNC e vire o gerador de impulsos diante. </li><li> Coloque óculos de segurança apropriadas diante. Definir os interruptores na parte de trás do laser para o modo &quot;Curr&quot; e &quot;TTL +&quot;. Certifique-se de that o botão de energia na frente do condutor é fixada em zero andturn o laser (transformar o motorista em primeiro lugar e, em seguida, a tecla de laser). </li><li> Ajuste o botão de energia na parte frontal do laser de modo a que 5 - 10 mW está a ser emitida a partir da ponta da fibra patch cord animal, tal como medido usando um medidor de energia da luz. 5 - 10 mW é uma orientação geral - a intensidade de potência exacta requerida para afectar um dado volume de tecido deve ser calculada antes do início da experiência, tal como no Aravanis 3 et al. </li><li> Desligue o laser azul para o modo &quot;Analog&quot; in vivo para estimulação. Nota: lasers DPSS amarelas são operados em TTL + modo de iluminação constante. Aguarde 10-15 min para o laser para aquecer. </li><li> Gentilmente restringir o mouse e conecte a manga de divisão no patch cord animal para a fibra implantável crônica (ver Figura 6). Certifique-se as extremidades das duas fibras fazer contato físico com o outro. Use a divisão na manga de ligação como umjanela para visualizar o contato direto entre os dois Passo Crítica:. Às vezes, os restos podem acumular-se na ponteira de metal de fibra implantável do animal e interferir com a conexão adequada. Neste caso, use um etanol limpar para limpar suavemente a ponteira sobre a cabeça do animal antes da fixação. Nunca force uma manga de ligação por cima da ponteira pois isso pode causar trauma grave para o animal. Se uma conexão física entre extremidades da fibra não pode ser feita após a limpeza, remover o animal do estudo. Dica: o vazamento de luz pode ocorrer no ponto de conexão entre a fibra e animal patch cord implantado. Visualization dessa luz por roedores pode apresentar uma confundem experimental 10. Calor psiquiatra tubulação pode ser anexado ao patch cords e deslizou sobre o ponto de conexão para minimizar a luz parasita. </li><li> Permitir que o rato para recuperar durante alguns minutos antes do início do teste de comportamento. Dica: Depending no teste comportamental a ser administrada, é melhor se que se habituem ratos para o processo de ligação e amarrar 2 - 3 dias antes, como a manipulação necessária para ligar o animal pode induzir stress e confundir os ensaios de comportamento. </li><li> Posicione o mouse no aparelho de testes comportamentais garantindo que o cabo do conector está livre de dificuldades. Nunca deixe um animal sem vigilância durante a estimulação. Mesmo com a utilização de comutadores, cordões têm tendência a torcer durante períodos de tempo prolongados e podem interferir com os ensaios de comportamento. </li><li> Use um gerador de pulso a pulso do laser azul com uma frequência pré-determinada que ativará opsina de escolha. Para o uso do laser amarelo: pulsar o laser amarelo com persianas externas ou simplesmente bloqueando o caminho do feixe com um não-reflexivo objeto opaco, e não inflamável. </li></ol> 4. Pós in vivo Considerações Estimulação Esta secção não se destina a ser um proto completacol, mas é oferecido como orientação para procedimentos adicionais que devem ser considerados seguinte in vivo estimulação optogenetic. <ol><li> Após a conclusão de um experimento, confirmar viral e fibra histologicamente colocação para a interpretação precisa dos resultados comportamentais. Eutanásia dos animais de acordo com as orientações institucionais e perfundir o animal com solução salina gelada tamponada com fosfato (PBS) e 4% (w / v) de paraformaldeído em PBS. </li><li> Remover implantado fibra óptica, segurando firmemente a ponteira de metal exposto com um alicate ou hemostats. Suba em um liso, ainda rápido, movimento. É importante para testar a integridade da fibra implantado medindo a emissão de luz no final de cada experiência. </li><li> Post-fixar os cérebros em paraformaldeído por pelo menos 24-48 horas antes do corte através da região de interesse. (Se estiver usando um micrótomo de congelação, incubar cérebros em uma solução de sacarose 30% durante vários dias antes do corte). Execute imunohistoquímica usando standard protocolos para a detecção dos fluorophores marcado com opsina adequadas, ou seja, a proteína verde fluorescente (GFP), o reforço da proteína fluorescente amarela (EYFP) ou mCherry. </li><li> Consulte o site de expressão opsina e implante de fibra sob um microscópio e visualmente confirmar o posicionamento adequado de injeção de vírus e implante com base em coordenadas escolhidas. </li></ol>

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<li>Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortical+excitation%2Finhibition+balance+in+information+processing+and+social+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction.</a> Nature. 477, 171-178 (2011).</li>
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<li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-light+sensitivity+optical+neural+silencer%3A+development+and+application+to+optogenetic+control+of+non-human+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A high-light sensitivity optical neural silencer: development and application to optogenetic control of non-human primate cortex.</a> Front Syst Neurosci. 5 (18), (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a relatar.

As estratégias atuais amarrar a laser descrita set-ups e são compatíveis com uma ampla gama de testes comportamentais de roedores. Na verdade, uma variedade de testes comportamentais têm sido utilizados seguinte, ou que o acompanha, in vivo estimulação optogenetic que incluem tarefas emotivos comportamentais, condicionamento comportamental, aprendendo e paradigmas de memória, sono, excitação e tarefas apetitivas para citar alguns (ver Nieh et al. 6 para uma revisão abrangente). Optogenética mudou a forma como testes comportamentais tradicionais são conduzidas em que os estudos de vários dias já pode ser condensada em uma única sessão em que o comportamento é comparado, dentro-sujeitos, durante épocas distintas de luz &#39;on&#39; versus &#39;off&#39; 5. De nota, aparatos comportamentais que contêm portas, fechadas compartimentos ou outros obstáculos podem ter que ser modificado para acomodar a passagem de fibras amarrados. O descrito estratégias amarrar autorização siestimulação multaneous de ratinhos múltipla a partir de um único laser. Alta capacidade optogenetic teste comportamental pode, por conseguinte, ser conseguida através da utilização de vários lasers e equipamento de teste. O número de animais que podem ser estimulados simultaneamente, no entanto, vai ser limitada pelo poder de luz máxima que pode ser conseguida em cada ponta da fibra. Potência máxima de saída na ponta da fibra depende da 1) de alimentação a partir do laser; 2) eficiência de acoplamento e 3) o número de divisões de feixes. Para um laser de 100 mW azul com ~ 80% de eficiência de acoplamento e até 4 divisões de feixes (como representado na Figura 4C), potência média na ponta da fibra pode variar entre 5-10 mW quando usando 200 um núcleo, 0,22 NA patch cords de fibra (nb de esperar a perda de transmissão de juntas rotativas para ser &lt;15%). Medir a saída de luz na ponta da fibra é essencial para determinar o poder de luz adequada para a ativação opsina como opsinas diferem na sua sensibilidade à luz e, portanto, a densidade de potência de luz (mW/ Mm 2) necessária para a activação 11. Por exemplo, a opsina estável função-passo (SSFO) atua como um acumulador de fótons e, portanto, requer muito pouca densidade de potência de luz para ativação (&lt;8 mW / mm 2) 8. Compare isso com o canal tradicional rodopsina (ChR2) que requer um mínimo de 1 mW / mm 2 de luz para provocar potenciais de ação 2. Tabela 1 é fornecido como uma referência rápida para conhecidos irradiancias mínimos luz necessária para ativar as opsinas mais comuns atualmente em usar. Por último, é preciso considerar que espalha luz e absorve enquanto viaja através do tecido cerebral de tal forma que mais energia de luz é necessário para estruturas mais profundas do cérebro 3. Um recurso útil está disponível em linha em <a href="http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php">http://www.stanford.edu/group/dlab/cgi-bin/graph/chart.php</a> que vai calcular a intensidade de luz em várias profundidades através dos tecidos cerebrais, tendo emconta a dimensão do núcleo da fibra, abertura numérica, comprimento de onda da luz utilizada, e o poder de luz a partir da ponta da fibra. Para uma excelente visão geral dos princípios teóricos subjacentes a estes cálculos, consulte Foutz et al. (2012) 12. Exemplos de como aplicar esses princípios e cálculos ao delineamento experimental, são demonstrados em Aravanis et al. (2007) 3 e Tye et al. (2012) 13. Realizando esses cálculos antes do início de um experimento é crucial para garantir irradiância luz adequada para a ativação opsina. Dadas estas considerações, é vantajoso para comprar lasers de alta potência para garantir potência adequada. Lasers com uma potência entre 100-200 mW são geralmente suficientes para compensar pequenas fibras de núcleo, divisão de fibra múltipla, acoplamento de ineficiência e transmissão perde 7. Se estiver usando lasers de alta potência, no entanto, deve-se tomar cuidado para evitar danos neural ou calor e luz-associadod artefactos que podem ocorrer com iluminação de luz alimentado prolongada e / ou de alta 7. A faixa de segurança para experimentos in vivo é de até 75 mW / mm 2 14. Decidir sobre o tipo de laser a compra pode ser uma questão complicada, pois há muitos fatores a considerar. Por exemplo, lasers de diodo diretos fornecer saída pulsada mais estável e repetível do que de estado sólido (DPSS) Lasers de diodo, e são mais confiáveis ​​ao longo do tempo em um ambiente de laboratório. Em alguns casos, no entanto, os lasers de diodo directos podem emitir um menor consumo de energia de luz, ~ 0,1 mW, mesmo quando a tensão de comando é de 0 V, devido a uma polarização de corrente constante a ser enviada ao diodo pelo sistema electrónico de controlo do laser. Esta emissão &quot;espontânea&quot; tem um espectro mais amplo do que a emissão de laser a partir do mesmo laser, por isso pode ser especificamente reduzido pela instalação de um passa-banda estreita (ou &#39;limpeza&#39;) filtro entre o laser e acoplador (ver lista de peças). Este filtro tambémreduzir a produção de energia por ~ 50% quando lasing, então comprar um laser de alta potência em conformidade. Deve notar-se que os lasers DPSS amarelas são extremamente sensíveis e podem comportar-se de forma irregular e têm reduzida vida útil se rapidamente modulada por um gerador de impulsos. Ajuste de potência do laser amarelo deve ser feito através de rodas de filtros densidade externos colocados no caminho do feixe (Seção 1.7), enquanto o laser operando em modo TTL +. Como alternativa, a compra de um laser de 532 nm DPSS verde é uma alternativa de baixo custo que pode ativar halorhodopsins e archaerhodopsins. A abertura numérica (NA) de uma fibra é importante considerar ao projetar e compra de componentes de fibra para a montagem do laser set-up. O NA de uma fibra óptica determina o ângulo dos raios de luz que podem ser aceites e emitidos na ponta de uma fibra. Se uma fibra de alta NA é acoplado a uma fibra inferior-NA, perda significativa irá ocorrer nessa interface, por isso, é importante ser consistente wi<html> th fibra NA dentro de uma única configuração (ou para garantir que NA aumenta ao longo do caminho da luz). O efeito da fibra de NA no volume de tecido cerebral iluminado é menos importante, uma vez que o tecido cerebral é dispersores, e uma vez que a luz acoplada a partir de uma fonte de laser tenderá para fibras de alta-NA underfill &#39;&#39;; no entanto fibras ópticas com uma NA de 0,22 e 0,37 são comumente usados. Da mesma forma, o acoplamento de uma maior-core a uma fibra menor-core também irá resultar em perdas significativas, por isso certifique-se sempre de usar crescentes ou iguais diâmetros núcleo quando a progredir a partir da fonte de laser para o implante animal. De um modo geral, extremidades da fibra deve ser sempre tampados quando não estiver em uso para evitar a poeira e partículas build-up. É uma boa idéia para regularmente extremidades da fibra limpas e ligações (70% de álcool isopropílico funciona bem) para garantir a máxima potência de saída de luz, e para testar a potência de luz através de um &quot;implante fictício &#39;antes de começar as experiências de cada dia. &quot;&gt; Durante o teste comportamental, é imperativo que sejam tomadas medidas para controlar os efeitos da infecção viral, a expressão da proteína exógena, luz visível, e os possíveis efeitos de aquecimento dos tecidos e artefatos em comportamento animal. Portanto, o grupo controle adequado deve ser composto de animais transduzidas com um vírus de controlo (por exemplo, GFP, EYFP, mCherry) que recebem os parâmetros de estimulação luz idênticos. verificação experimental é um passo fundamental final, os dados de comportamento usados ​​para análise é inteiramente dependente da opsina e colocação adequada de fibra óptica na região de interesse . Especificamente, em animais, onde é detectado nenhum sinal imuno-histoquímica, ou se a colocação de sinal ou de fibra não é na região de interesse, em seguida, os dados de comportamento para o animal deve ser removido a partir do experimento. Além disso, é essencial para testar a saída da luz em a ponta da fibra, tanto antes implantação cirúrgica e de novo post-mortem para garantir energia luz adequada para a ativação opsina. Em animals em que tenha ocorrido a perda de luz intensa através da fibra após a experimentação (&gt; 30%) 9, os dados para que animais devem ser considerados para a remoção. Os critérios para a remoção deve ser estabelecido a priori. Por fim, deve-se considerar a freqüência de pulso necessário para modular disparo neural, o que dependerá da estrutura do cérebro e sub-tipos neuronais sendo alvejado. Existem parâmetros de estimulação de luz Optogenetic Publicado por vários sub-tipos neuronais, no entanto, a capacidade de modular disparo neural devem ser confirmadas de forma independente através in vivo ou fatia do cérebro registros eletrofisiológicos. Como uma pessoa se torna adepto com o uso de laser e modificação de laser de set-ups, as combinações de diferentes comprimentos de onda pode ser amarrado a várias fibras em um único animal ou entregues pela mesma fibra para optogenética combinatória 8. Estimulação multi-comprimento de onda vai se tornar cada vez mais importante, dado o rápido desenvolvimento da vermelho-shifted channelrhodopsins 8, a engenharia de azul-deslocada opsins hiperpolarizantes 15, o uso de biestáveis ​​opsins de função passo 8,16,17, eo crescente lista geral de opsinas com espectros de ativação distinta 11. Esta expansão da caixa de ferramentas optogenetic permitirá o controle sem precedentes de vários sub-tipos neuronais, tanto dentro como entre as regiões cerebrais para determinar seu papel no governo de estados comportamentais complexas.

Optogenética revolucionou os sistemas de nível de neurociência na busca de elementos do circuito neural condução estados comportamentais normais e pertinentes à doença. A descoberta de que opsins microbianas sensíveis à luz um poderia ser funcionalmente expressos em células de mamíferos, desde a plataforma para usar a luz para ganhar o controle sem precedentes da atividade neural com alta precisão espacial e temporal 2. Ao contrário de métodos electrofisiológicos ou farmacológicos tradicionais para a manipulação da actividade neural, Optogenetics permite o controlo de tipos específicos de células (com base na projecção genética identificar ou espacial) dentro de populações heterogéneas e em escalas de tempo fisiologicamente relevantes. A introdução posterior de uma interface neural-óptico fornecido uma ferramenta prática para a entrega de luz para comportar os animais 3. Isto permitiu para modulação em tempo real dos circuitos neuronais definidas em roedores comportando acordado, a fim de testar a causalmentepapel desses circuitos neurais na governação dos estados comportamentais relevantes para a doença neurológica e psiquiátrica 4-6. Optogenética, portanto, representa uma poderosa ferramenta para a introdução em qualquer laboratório interessado em investigar a relação funcional entre a atividade cerebral e medidas comportamentais ou fisiológicas em modelos animais. Projeto de sucesso e conclusão de um experimento optogenetic envolve várias etapas e considerações (ver Figura 1). O objetivo do protocolo atual é proporcionar aos indivíduos com as ferramentas e componentes, juntamente com o conhecimento teórico e prático, necessário para realizar a estimulação optogenetic em roedores comportando acordado. Actualmente, existem dois comprimentos de onda predominantes utilizados para activar canais de opsinas microbianas: no espectro azul (geralmente 473 nm) e os espectros de verde-amarelo (normalmente 532 ou 591 nm). Ambos os lasers e os diodos emissores de luz (LEDs) podem ser usados ​​como fontes de luz para deliver comprimentos de onda específicos da luz para o tecido cerebral. A luz não coerente emitida pelos LEDs, no entanto, faz com que a transmissão eficaz de difícil luz quando o acoplamento para as pequenas fibras básicos necessários para a estimulação in vivo roedor. Decidir sobre o conjunto do laser adequado é um passo inicial crucial e vai depender da utilização prevista para Optogenetics no laboratório. O protocolo atual descreve duas configurações básicas que diferem na sua facilidade de montagem e utilização: solteiro lasers pré-acoplado e sistemas laser duplos (ver Figura 2). Sistemas de laser individuais que são pré-acopladas pelo fabricante são, essencialmente, ready-to-go na chegada, com pouco ou nenhum set-up necessário, mas têm a desvantagem de mínima personalização do usuário final. Um sistema de laser duplo permite a entrega de dois comprimentos de onda diferentes para baixo da mesma fibra. Isto vai tornar-se cada vez mais importante com o advento de Optogenetics combinatória em que diferentes comprimentos de onda pode ser utilizado para activar / inibir Refiratipos de células T que são espacialmente co-localizado. Isto também é essencial para o uso com bi-estáveis ​​opsins função degrau onde fotocorrentes são iniciadas e terminadas pela luz azul e amarelo, respectivamente 7,8. Sistemas de laser duplo também são personalizáveis ​​como o usuário pode adicionar ou remover componentes (por exemplo, persianas externas, filtros de vara, medidores de energia em linha) a partir do caminho do feixe, conforme necessário. Devido a sua versatilidade, o duplo de laser set-up é recomendado se optogenética vai ser uma ferramenta continuou utilizada no laboratório. O acoplamento dos lasers, no entanto, pode apresentar um desafio e por isso um mecanismo de acoplamento rápido, fácil e confiável é proposto neste protocolo. Note-se, este protocolo detalha a montagem de componentes ópticos e utiliza patch cords e componentes que são otimizados para fibras multimodo passo-index com um núcleo de 200 mm e uma abertura numérica (NA) de 0,22. Tamanhos de núcleo diferentes e NA estão disponíveis para compra, no entanto todos os componentes devem, idealmente, corresponder em termos de núcleotamanho e NA, para evitar a perda de luz em pontos de conexão de fibra. Alternativamente, numa ligação de fibra, a luz pode passar a partir de um pequeno para um maior tamanho do núcleo; e / ou a partir de uma baixa para uma NA NA mais elevado de fibra sem perda adicional. Estratégias de amarrar são fornecidos para permitir que a estimulação simultânea de vários ratinhos de alto rendimento para os ensaios de comportamento. Os protocolos fornecidos pressupõem a utilização de fibras implantáveis ​​crónicas para o teste comportamental, mas pode ser modificado para protocolos de estimulação agudas. Fibras agudamente implantados são vantajosos para a combinação de estimulação optogenetic com manipulação farmacológica, uma vez que a mesma cula pode ser usada para administrar drogas e a ponta de uma fibra óptica para o mesmo local. O uso de fibras cronicamente implantados-se, no entanto, altamente recomendado para de vários dias de teste comportamental, uma vez que reduz os danos nos tecidos associados com a inserção e remoção repetidas de fibras e aumenta a precisão em termos de posicionamento consistente de fibra parailuminação tecido 3. Quando combinada com as configurações de ancoragem descritas aqui, o comportamento pode ser gravado de forma fiável através de vários dias. Meses Na verdade, a transmissão de luz de confiança foi avaliado após a implantação de fibra 9 de tal forma que a estimulação crônica e paradigmas de testes comportamentais podem, teoricamente, ser levada a cabo em vários dias e semanas. Outras informações sobre os componentes de hardware foram adicionados ao protocolo para permitir a escolha leitor o melhor produto que irá atender as suas necessidades individuais, incluindo alternativas e produtos de baixo custo que podem ser feitas em casa. Dicas importantes que são úteis durante a configuração e implementação também são fornecidos.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Configuração do laser</td></tr><tr><td>Sistema de laser de diodo de 100 mW 473nm ou 488nm, < 2% de estabilidade (quantidade: 1)</td> <td>Omicron</td><td>Luxx / Phoxx 473 / 488-100</td><td>Acessório opcional inclui um controle remoto
caixa com interruptor de chave e display LED</td></tr><tr><td>100 mW 594nm DPSS laser (quantidade: 1)</td> <td>Colbolt</td><td>0594-04-01-0100-300</td><td>04-01 série laser amarelo; sensível à reflexão traseira
de fibras</td></tr><tr><td>200 mW 532 nm DPSS laser; 5% de estabilidade de energia (quantidade: 1)</td> <td>Shanghai Lasers</td><td>GL532T3-200</td><td>Alternativa econômica ao laser DPSS amarelo
para ativação de halorodopsinas e
archaerhodopsins</td></tr><tr><td>Acoplador de laser para fibra multimodo sem contato (quantidade: 1)</td><td>OZ Optics</td><td>HPUC-23-400/700-M-20AC-11</td><td>Para uso com configuração de laser duplo; Especificações: 33 mm
OD para 400 - 700 nm; Receptáculo FC, lente f = 20 mm
com adaptador de cabeça de laser de montagem em poste #11</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio, 12" x 18" x 1/2", 1/4"-20 Rosqueada (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1213</td><td>Para sistema de laser duplo</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio, 10" x 12" x 1/2". 1/4"-20 Rosqueado (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>MB1012</td><td>Para sistema de laser único</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio, 4" x 6" x 1/2", 1/4"-20 Rosqueado (quantidade: 2)</td><td>Thorlabs</td><td>MB4</td><td>Para laser azul; sistema de laser duplo</td></tr><tr><td>Grampo compacto de altura variável, 1/4"-20 Roscado (quantidade: 4)</td><td>Thorlabs</td><td>CL3</td><td></td></tr><tr><td>Poste de aço inoxidável de 3/4" (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TR075</td><td></td></tr><tr><td>Poste de aço inoxidável de 1" (quantidade: 4)</td><td>Suporte de poste Thorlabs</td><td>TR1</td><td></td></tr><tr><td>com travamento hexagonal acionado por mola parafuso de aperto manual (quantidade: 2)</td><td>Adaptador de base de pedestal Thorlabs</td><td>PH1</td><td></td></tr><tr><td>(quantidade: 3)</td>Garfo de fixação pequeno <td>Thorlabs</td><td>BE1</td><td></td></tr><tr><td>(quantidade: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>CF1253</td><td></td></tr><tr><td>Montagem cinemática para óptica de 1" com espelho de qualidade laser visível (quantidade: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100-E02</td><td></td></tr><tr><td>Roda de densidade de filtro neutro (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-2M</td><td></td></tr><tr><td>1" Longpass espelho dicróico 50% (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td></td></tr><tr><td>Montagem cinemática para óptica de 1" (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>Para espelho dicróico</td></tr><tr><td>Kit de chave hexagonal de 20 peças com suporte (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>TC2</td><td></td></tr><tr><td>1/4"-20 kit de parafuso de cabeça e hardware (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2</td><td></td></tr><tr><td>Base de montagem 1" x 2.3" x 3/8" (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC para FC/PC L-Bracket mating sleeve (quantidade: 2)</td><td>Thorlabs</td><td>ADAFCB1</td><td>Dual FC/PC L-BRACKET também disponível</td></tr><tr><td>Alças de elevação de placa de ensaio (quantidade: 3)</td><td>Thorlabs</td><td>BBH1</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; Filtro passa-banda de 1", CWL = 450 &plusmn; 2 nm, FWHM = 10 &plusmn; 2 nm (quantidade: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>FB450-10</td><td>Para uso com lasers de diodo que espontaneamente
emitir</td></tr><tr><td colspan="4">2. Acoplamento a laser</td></tr><tr><td>! Óculos de proteção a laser (quantidade: 1 para cada usuário em cada comprimento de onda)</td> <td>Vários</td><td></td><td>! Consulte o fornecedor de laser para garantir o adequado
seleção de óculos que fornecerão o máximo
atenuação de luz para o testador</td></tr> de <tr><td>cabo de fibra óptica a laser comprado (quantidade: 1)</td> <td>Eclipse</td><td>902-186N</td><td></td></tr><tr><td>Limpador de conector de fibra de uma etapa (quantidade: 1)</td> Cabo de remendo do acoplador <td>Thorlabs</td><td>FBC1</td><td></td></tr><tr><td>(0,75 metro) (quantidade: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td></td><td>0,75 m 200 &mu; m core, 0,22 NA, conectores FC/PC fibras multimodo; para sistema de laser duplo</td></tr><tr><td>Cabo de conexão do acoplador (0,5 metro) (quantidade: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td></td><td>0,5 m 200 &mu; m core, 0,22 NA, conectores FC/PC, multimodo; para sistema de laser único</td></tr><tr><td>Mini cubo Doric (quantidade: 2)</td> <td>DORIC</td><td>DMC_1x2_FC-2FC</td><td></td></tr><tr><td>Console compacto do medidor de energia e potência (quantidade: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digital 4 "LCD</td></tr><tr><td>C-series slim power sensor 5 - 500 mW (quantidade: 1)</td> <td>Thorlabs</td><td>S130C</td><td>Vários tipos de detectores estão disponíveis; verifique
com vendor</td></tr><tr><td colspan="4">3. In vivo</td></tr><tr><td>Divisores de fibra multimodo de estimulação optogenética (quantidade: 2)</td><td>FONT Canada</td><td></td><td>Divisor de fibra óptica de núcleo grande 1 x 2, proporção 50/50, conectores FC, robustos. Comprimento, tamanho do núcleo e abertura numérica podem ser especificados ao fazer o pedido; Custo-beneficio
tamanhos de núcleo menores disponíveis</td></tr><tr><td>Gerador de função de forma de onda arbitrária (2 canais) (quantidade: 1)</td><td>Rigol</td><td>DG1022</td><td>Pode controlar até 2 lasers ao mesmo tempo</td></tr><tr><td>Junta rotativa de fibra óptica (comutador) (quantidade: 6 - 8)</td><td>DORIC*</td><td>FRJ_1X1_FC-FC*</td><td>Também disponível através de cabos de remendo Thorlabs e Prizmatix</td></tr><tr><td>Animal (Cânula de Fibra Óptica Mono Personalizada com ponteiras de 10mm, conector FC/PC) (quantidade: 8)</td><td>DORIC</td><td>MFP_200 / 240/900-0.22_2m_FC-MF2.5</td><td>Comprimento, tamanho do núcleo e abertura numérica podem
ser especificado ao fazer o pedido; alternativamente, estes
pode ser feito internamente (veja
Sparta et al. 2012)9.</td></tr><tr><td>Luva rachada cerâmica de PFP, identificação de 2.5mm, comprimento de 11.40mm (25/pkg) (quantidade: 1)</td> Produtos <td>SM-CS1140S1</td> <td>da fibra da precisão</td><td>usados unindo a fibra ótica implantada sobre
animal a um cabo de remendo luz-entregando da fibra com
extremidade plana (FC)</td></tr><tr><td>Tampas de poeira transparentes para &Oslash; Ponteiras de 2,5 mm (25/pkg) (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>CAPF</td><td></td></tr><tr><td>Metal cap para mangas de acoplamento FC/PC e FC/APC (quantidade: 1)</td><td>Thorlabs</td><td>CAPF1</td><td></td></tr><tr><td>Cabos de remendo grossos (pedido personalizado) (quantidade: 4)</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>200 &mu; m core, 0,22 NA, conectores FC/PC fibras multimodo; comprimento, tamanho do núcleo e abertura numérica podem ser especificados ao fazer o pedido</td></tr></tbody></table>

in vivo optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

A capacidade de sondar circuitos neurais definidos em animais acordados e em movimento livre com especificidade de tipo de célula, precisão espacial e alta resolução temporal tem sido uma ferramenta há muito procurada por neurocientistas na busca em nível de sistemas pelos circuitos neurais que governam estados comportamentais complexos. A optogenética é uma ferramenta de ponta que está revolucionando o campo da neurociência e representa uma das primeiras abordagens sistemáticas para permitir testes causais sobre a relação entre eventos de sinalização neural e comportamento. Ao combinar abordagens ópticas e genéticas, a sinalização neural pode ser controlada bidirecionalmente por meio da expressão de canais iônicos sensíveis à luz (opsinas) em células de mamíferos. O protocolo atual descreve a entrega de comprimentos de onda específicos de luz para células que expressam opsina em estruturas cerebrais profundas de roedores acordados e em movimento livre para modulação do circuito neural. Os princípios teóricos da transmissão de luz como uma consideração experimental são discutidos no contexto da realização de estimulação optogenética in vivo. O protocolo detalha o projeto e a construção de configurações de laser simples e complexas e descreve estratégias de amarração para permitir a estimulação simultânea de vários animais para testes comportamentais de alto rendimento.

Resultados obtidos com comportamentais in vivo estimulação optogenetic são inteiramente dependentes do circuito neural a ser alvo, o modelo animal usado, e os parâmetros de modulação. Para fins de demonstração atuais, os neurônios de dopamina na área tegmental ventral, ou VTA, de tirosina-hidroxilase :: ratos Cre foram transduzidas com uma opsina estável função-passo (SSFO) 8, ou vírus de controlo (EYFP), e um implante de fibra era cronicamente implantado. A utilização de ratinhos transgénicos TH :: Cre assegura que opsina expressão está restringida às células TH + (dopamina) na ATV. A Figura 7 mostra os resultados representativos obtidos com o comportamento descrito actual do laser set-up para a estimulação simultânea de vários ratinhos. Aqui, os ratos foram estimulados com fio e ao mesmo tempo usando lasers separados (3 ratinhos / laser como na Figura 4C) e comportamento locomotora foi registada durante 1 h. Estimulação repetida dos neurónios dopaminérgicos na ATV resultou numafenótipo hiperativo que persistiu durante toda a duração da estimulação. Nenhuma mudança no comportamento locomotor foi visto em EYFP ratos (ver vídeo 1). Após teste comportamental, imuno-histoquímica foi realizada para verificar a segmentação viral preciso para VTA neurônios de dopamina e colocação de fibra foi confirmada visualmente (ver Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig1highres.jpg" /> Figura 1. passos experimentais para in vivo estimulação optogenetic. Existem quatro passos gerais envolvidos na concepção e realização in vivo estimulação optogenetic. Este protocolo especificamente detalha os passos envolvidos na entrega de luz a partir de uma fonte de luz laser para estruturas profundas no cérebro do roedor comportar e inclui 1) a montagem do sistema de acoplamento da luz laser e; 2) as estratégias de amarração para conectar vários animais para uma fonte de luz para o teste de comportamento de alto rendimento e 3) proporciona orientações para confirmar a estratégia de direccionamento para entrega a luz - um passo que é essencial para a interpretação dos dados. Nota: apesar de o protocolo não é exclusivo de fibras implantáveis ​​crônicas para fins de amarração, recomenda-se e assumiu quando se combina a estimulação optogenetic com testes comportamentais. Ver tanto Ung &amp; Arenkiel de 2012 e 18 de Sparta et al., 2012 9 para a produção e implantação de fibras ópticas crônicas in-house. As linhas sólidas = passos abordados neste protocolo. <img alt="Figura 2" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig2highres.jpg" /> Figura 2. Sistemas de laser usados ​​para estimulação in vivo optogenetic. (A) sistema de laser único para estimulação in vivo. Este laser é ph<html> ysically pré-acoplada pelo fabricante e requer pouca usuário final set-up. (B) sistema de laser duplo. Dois lasers são acoplados numa única fibra, através da utilização de espelhos que actuam para guiar cada trajecto do feixe para um estilo de engate sem contacto. Este é o mais versátil set-up como componentes ópticos podem ser removido ou adicionado como necessário, mas apresenta mais um desafio em termos de acoplamento do laser eficiente. (C) Esquema do sistema de laser duplo mostrado em (B), indicando a colocação de lasers e espelhos com o caminho do feixe de luz laser correspondente (setas) representado. Aqui, o espelho dicróico &quot;D&quot; é usado para desviar a comprimentos de onda de luz azul durante a transmissão através de comprimentos de onda amarelo para o acoplador de &quot;C&quot; e para o cabo de remendo acoplador ligado. B = laser azul; C = sem contato acoplador estilo; D = espelho dicróico; FW roda = filtro; M = Espelho; Y = laser amarelo.obter = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig3highres.jpg" /> Figura 3. tester (A) Cabo utilizado no protocolo de acoplamento não-físico inferior:. Testador de cabo conectado diretamente a um cabo de manobra. Insert retrata ponto de conexão de cabo tester para cordas (B) de Patch referidos ao longo do protocolo do exterior para interior:.. A fibra multimodo divisor, animal patch cord preto com camisa de manga com divisão de zircônia branca anexado ao-se apegam plano final (FC), cabo de remendo com camisa de espessura (também referido como um &quot;cabo do acoplador&quot;). Patch cords grossas de jaqueta são revestidas com policloreto de vinila (PVC) tubos para proteção extra. Para esses cabos, códigos de cores padrão da indústria são utilizados para distinguir entre diferentes tipos de fibra, onde laranja = fibra multimodo. Patch cords animal são<html> mais fino revestido para permitir flexibilidade para o movimento dos animais durante o teste comportamental. Note-se que a poeira tampas são colocados no FC / PC termina quando os cabos não estão em uso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig4highres.jpg" /> Figura 4. As estratégias de tethering para in vivo estimulação optogenetic de (A) um único animal, (B) dois animais; . (C) três ou quatro animais configurações possíveis não se limitam àquelas mostradas acima - várias configurações são possíveis através da combinação única de adaptadores, divisores de fibra e de ramificação patch cords que estão disponíveis comercialmente ou por ordem feita sob encomenda. Nota: patch cords e divisores de fibra conter FC conectores / PC em ambas as extremidades (apenas um final é retratado).&quot;target =&quot; _ ww.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig4large.jpg blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig5highres.jpg" /> Figura 5. Conexão corretas e incorretas (vermelho x) de um cabo de manobra para uma fibra óptica implantável usando uma luva de divisão. (Painel esquerdo) A zircônia split-manga é utilizada para ligar um cabo de manobra para a ponteira de uma fibra óptica implantável (mostrado aqui não aposta em um animal). Seta está apontando para o ponto de conexão entre o cabo de remendo e implantável de fibra óptica. Compare com (painel direito), onde existe uma lacuna entre o patch cord e implantável de fibra óptica, como visualizado através da divisão da manga de ligação. Observe o vazamento de luz que pode ocorrer com uma conexão deficiente (canto inferior direito). Inserção inferior em upper painel esquerdo descreve componentes individuais utilizados. De cima para baixo de inserção: cânula de fibra óptica implantável dórico, branco zircônia split-manga,-cleeve plana (FC) final de um patch cord animal branco de jaqueta (patch cord completo apresentado na Figura 3B). Em todos os painéis, note que a manga de conexão não esteja alinhada com o FC extremidade do cabo de patch. Deixar ~ 0,5 centímetros de um excesso de cair para a ligação à fibra óptica implantável aposta no animal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig6highres.jpg" /> Figura 6. lateral (esquerda) e vista frontal (direita) de um rato com uma fibra óptica implantada conectado a um cabo de manobra. Use a divisão na manga de ligação para ajudar a visualizar a conexão apropriada do patch cord to ferrolho da fibra óptica implantado. O ponto de conexão é destacado por uma caixa tracejado vermelho e também representado na inserção superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-="" src="/files/ftp_upload/51483/51483fig7highres.jpg" /> Figura 7. Os resultados representativos. (Esquerda) leitura comportamental de in vivo estimulação optogenetic. Exemplo de comportamento que podem ser obtidos utilizando o laser descrita set-up e protocolo de tethering. A actividade locomotora foi registada durante a estimulação optogenetic de área tegmental ventral (VTA) em tirosina-hidroxilase (TH) :: ratinhos Cre (n = 7-8 / grupo) ou transduzidas com um opsina funções-degrau (AAV5-DIO-SSFO-EYFP ) ou vírus de controlo (AAV5-DIO-EYFP) na VTA. Grupos de três ratos foram simultaneamente ligado a uma únicado laser, como representado na Figura 4C e estimuladas com um pulso de 5 s 447 ou 473 nm de luz entregue, após cada 15 min. Two-way ANOVA medidas repetidas revelou uma interação grupo significativo x tempo (F 3,39 = 15,27, p &lt;0,0001) e um efeito principal de tempo significativo (F 3,39 = 4,67, p = 0,007), pelo que a estimulação optogenetic aumento da atividade locomotora apenas em ratinhos SSFO (Bonferroni post-hoc de p &lt;0,0001, em relação ao t = 0 - 15 horas bin) resultando num aumento global na actividade locomotora em comparação com ratinhos EYFP (efeito principal do grupo de: F 1,39 = 10,69, p = 0,0061; Bonferroni post-hoc de p &lt;0,01 em t = de 15 - 30 e p &lt;0,001, em t = 30 - 45 e t = 45 - 60). Specs Fibra: 200 um núcleo, 0,22 NA. Luz irradiância = 6-66 mW / mm 2, correspondendo a distância da ponta de fibra de 0,1-0,6 mm do local da injeção viral com potência de luz 5 mW emitida a ponta da fibra antes de tethering. As barras de erro representam o erro padrão da média. EYFPvs SSFO: ** p &lt;0,01; *** P &lt;0,001; efeito do tempo: #### p &lt;0,0001 (Direito) a confirmação histológica da colocação viral e de fibra óptica.. Imagem de fluorescência confocal adquirido em uma Leica TCS microscópio de varredura a laser SP5 foi usada para visualizar a colocação de fibra (de linha pontilhada) e expressão viral mediada (verde) no rato área tegmental ventral seguinte in vivo estimulação optogenetic. Neurônios de dopamina (TH +) são vistos em azul. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/51483fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Vídeo 1. In vivo estimulação optogenetic:. A hiperatividade durante a estimulação VTA usando SSFO em camundongos TH :: Cre <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51483/JOVE_video_1.mov" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="5"> Tabela 1. irradiancias luz necessária para ativar opsins comumente usados. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Opsina Variant </td><td rowspan="2"> λ </td><td rowspan="2"> Densidade de Potência (/ mm 2) </td><td></td><td rowspan="2"> Propriedades </td></tr><tr><td> ON / OFF Kinetics </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitação óptica: channelrhodopsins de ação rápida </td></tr><tr><td> ChR2 2 </td><td> 470 </td><td> 1 - 5mW </td><td> 1,21 / 12 mseg </td><td> Incêndios até 40 Hz </td></tr><tr><td> Cheta 19 </td><td> 490 </td><td> 5 mW </td><td> 0,86 / 8,5 mseg </td><td> Incêndios até 200 Hz </td></tr><tr><td> Chefe 20 </td><td> 450 </td><td> 1,65 mW </td><td> 1,62 / 12 mseg </td><td> Forma não-dessensibilização de ChR2 </td></tr><tr><td rowspan="2"> C1V 18 </td><td rowspan="2"> 540-630 </td><td> 8 mW (540 nm) </td><td> 5/34 a 54 mseg0 nM </td><td rowspan="2"> Vermelho-deslocado </td></tr><tr><td> 3.2 mW (630 nm) </td><td> 67 ms (ON) na 630nm </td></tr><tr><td colspan="5"> Excitação óptica: de ação lenta rodopsinas canal </td></tr><tr><td> Estável função degrau opsina (SFO) 8 </td><td> 470/590 </td><td> 8 mW (470 nm) </td><td> 20 ms / 29 min </td><td> Nova variante SFO; Estado mais aberto. Aberto por 470 nm, fechado por 590 nm </td></tr><tr><td colspan="4"> Inibição Optical </td><td></td></tr><tr><td rowspan="2"> eNpHR3.0 21 </td><td rowspan="2"> 560-630 </td><td rowspan="2"> 3-5 mW </td><td rowspan="2"> 2,5 ms / &lt;10 mseg </td><td> Inibição sustentada por 30 min 22 com luz constante * </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> ArchT3.0 11, 23 </td><td> 520-560 </td><td> 1-5 mW </td><td> 2 / &lt;10 mseg </td><td> Mais sensível com fotocorrentes maiores do que eNpHR3.0 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td colspan="5"> Esta tabela é fornecida apenas como um guia; irradiâncias de luz específicas necessárias para a modulação neural deve ser confirmada de forma independente. </td></tr><tr><td colspan="5"> Validação experimental é importante verificar se a opsina, a estratégia de segmentação e parâmetros de estimulação de luz modular disparo neural da forma pretendida 5. </td></tr><tr><td colspan="5"> A densidade de potência (mW / mm 2) refere-se à potência da luz iluminado numa dada área do tecido do cérebro e não se refere a energia de luz emitida a partir da ponta da fibra. </td></tr><tr><td colspan="5"> * Use sempre a menor intensidade de luz possível, especialmente com a estimulação de luz prolongada. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. irradiancias luz necessária para ativar opsins comumente usados. Abreviações AAV = vírus adeno-associado DPSS = estado sólido bombeado diodo- <br/&gt; EYFP = reforçada proteína fluorescente amarela FC / PC = cleave flat / contato físico GFP = proteína fluorescente verde PBS = solução salina tamponada com fosfato PVC = cloreto de polivinila mW = miliwatt NA = Abertura numérica SSFO = estável-function passo opsina TH = tirosina hidroxilase TTL lógica = transistor-transistor V = voltagem VTA = área tegmental ventral

A optogenética tornou-se uma ferramenta poderosa para uso em experimentos de neurociência comportamental. Este protocolo oferece um guia passo a passo para o projeto e configuração de sistemas de laser e fornece um protocolo completo para a realização de estímulos optogenéticos in vivo múltiplos e simultâneos compatíveis com a maioria dos paradigmas de teste comportamental de roedores.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar com sucesso a estimulação optogenética in vivo do sistema nervoso central de roedores em um animal acordado e livre para se movimentar. Isso é conseguido primeiramente configurando e ajustando o sistema apropriado de laser para realizar a estimulação optogenética. Em seguida, são montadas fibras ópticas compatíveis com testes comportamentais para entregar a luz do laser a uma fibra óptica implantada e à região cerebral de interesse que expressa a opsina.Em seguida, o animal é preso ao sistema a laser para estimulação optogenética e é colocado em um aparato de teste comportamental. Por fim, parâmetros definidos pelo experimentador para estimulação luminosa, com o objetivo de ativar ou desativar neurônios, são aplicados enquanto o animal realiza uma tarefa comportamental. Em última instância, a estimulação optogenética in vivo é utilizada para permitir o controle em tempo real de populações definidas de neurônios ou circuitos neurais em animais acordados e em atividade, a fim de determinar seu papel funcional em um determinado comportamento de interesse.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que ela permite o controle em tempo real de populações de neurônios definidas geneticamente e espacialmente em animais acordados e em atividade, com a resolução temporal necessária para associar padrões de atividade neural a estados comportamentais complexos. Este protocolo envolve o uso de lasers da classe três B e exige que o treinamento adequado e as diretrizes de segurança sejam seguidos. Óculos de proteção devem ser usados o tempo todo ao operar lasers, sendo os procedimentos de alinhamento especialmente arriscados. Após a montagem do aparelho a laser de acordo com o protocolo descrito, realize o acoplamento a laser do feixe azul interno em estilo sem contato, primeiro ajustando as chaves na parte traseira do laser para cur (corrente) e TTL (lógica de transistor a transistor) para modo de iluminação constante na frente do driver; certifique-se de que o botão de potência esteja ajustado em zero.Em seguida, ligue o laser primeiro ligando o driver, seguido pela chave do laser. Para garantir a segurança ocular, ajuste lentamente o botão de potência para que aproximadamente um miliwatt de luz laser seja emitido. Em seguida, aguarde de 10 a 15 minutos para que o laser aqueça.Em seguida, conecte o testador de cabo de fibra óptica diretamente à extremidade livre do cabo do acoplador e ligue o testador de cabo. Depois, ajuste o ângulo do acoplador para que o feixe vermelho retorne diretamente ao centro do espelho dicromático. O trajeto do feixe de luz vermelha emitido pelo testador de cabo é exatamente o caminho que a luz laser de entrada precisará seguir para ser acoplada ao laser.Para realizar um alinhamento do feixe, utilize os botões laterais e horizontais dos espelhos cinemáticos para direcionar o feixe de luz laser para dentro do acoplador. Não se preocupe se nenhuma luz azul estiver sendo emitida pelo acoplador conectado ao cabo de conexão neste momento. Agora, coloque um único pedaço de papel semitranslúcido diretamente na frente do espelho dicromático, entre o espelho dicromático e o acoplador.Haverá tanto um ponto azul quanto um ponto vermelho no mesmo lado desta folha de papel, provenientes respectivamente do laser e do testador de cabos. Faça ajustes finos no primeiro espelho direcional ajustando cuidadosamente os botões laterais e horizontais para alinhar o centro do ponto vermelho com o ponto azul. Mova a folha de volta em direção ao acoplador, de modo que fique diretamente à sua frente, e ajuste os botões no segundo espelho dicróico para alinhar o feixe do laser com o feixe vermelho.Continue fazendo ajustes finos nos dois espelhos até que os centros dos feixes azul e vermelho estejam exatamente alinhados. Coline, remova o testador de cabo do cabo acoplador. A luz do laser agora deve ser admitida pela extremidade do cabo de conexão acoplador.Para determinar a eficiência de acoplamento, utilize um medidor de potência luminosa para comparar a potência luminosa que entra no acoplador com a potência luminosa emitida pela extremidade da fibra. Uma eficiência de acoplamento superior a 80% é considerada muito boa, mantendo-se a posição do espelho dicróico. Utilize os dois espelhos direcionadores para o laser amarelo externo e siga o procedimento de alinhamento recém-demonstrado para acoplar o laser amarelo e configurar uma fibra óptica para estimular um único camundongo.Inicie utilizando o adaptador de suporte F-C-F-C-L diretamente conectado à placa de prototipagem para ligar o cabo de conexão ao cabo de conexão com revestimento grosso. Conecte uma junta rotativa comutadora às extremidades livres do cabo de conexão com revestimento grosso. Em seguida, conecte o cabo de conexão do animal à junta comutadora.Conecte uma luva divisora de conexão à extremidade metálica livre do cabo de derivação do animal sem empurrar completamente a luva. Deixe cerca de 0,5 centímetros da luva exposta, pois é essa parte que se conecta à fibra óptica fixada ao animal com um cabo BNC. Conecte o driver a laser azul ao gerador de pulsos e ligue o gerador de pulsos.Agora coloque óculos de segurança apropriados. Em seguida, após verificar se o botão de potência na frente do driver está ajustado em zero, ligue o laser primeiro ligando o driver e depois a chave do laser, com o laser configurado no modo TT L positivo. Ajuste lentamente o botão na frente do laser e use um medidor de potência luminosa para definir uma emissão de luz de cinco a 10 miliwatts na ponta do cabo de conexão do animal.Consulte o protocolo textual para obter mais detalhes sobre esta configuração. Altere o laser azul para o modo analógico para estimulação in vivo e aguarde de 10 a 15 minutos para que o laser aqueça. Em seguida, imobilize suavemente o camundongo e conecte a luva dividida do cabo de conexão do animal ao fibra implantável crônica.Certifique-se de que as extremidades de ambas as fibras entrem em contato físico uma com a outra, utilizando o corte no soquete de conexão como uma janela para visualizar o contato direto entre as duas. Deixe o camundongo se recuperar por alguns minutos antes do início do teste comportamental. Em seguida, coloque o animal no aparelho de teste comportamental, certificando-se de que o cabo do conector esteja livre de obstáculos.Use o gerador de pulsos para pulsar um laser azul em uma frequência predeterminada que ativará a opção de escolha. Após concluir o experimento, confirme histologicamente a colocação do vírus e da fibra conforme descrito no protocolo de texto associado, para uma interpretação precisa dos resultados comportamentais. Sob um microscópio, verifique o local de expressão da opsina e do implante da fibra e confirme visualmente a colocação adequada da injeção do vírus e do implante com base nas coordenadas escolhidas.Neste exemplo de resultados comportamentais obtidos por meio de estimulação optogenética in vivo, neurônios dopaminérgicos na área ventral ou VTA de camundongos tyrosine hydroxylase cre foram transduzidos com uma opsina de função estável ou com EYFP como vírus controle, e um implante de fibra foi cronologicamente inserido. Grupos de camundongos foram simultaneamente estimulados e o comportamento locomotor foi registrado durante uma hora, conforme demonstrado aqui. A estimulação repetida da opsina em camundongos transduzidos, mostrada à esquerda, resultou em um fenótipo hiperalético que persistiu durante toda a estimulação.Embora nenhuma alteração no comportamento locomotor tenha sido observada no camundongo controle à direita após os testes comportamentais, realizou-se imunohistoquímica para verificar o direcionamento preciso do vírus aos neurônios dopaminérgicos da área tegmental ventral, e a colocação da fibra foi confirmada visualmente conforme mostrado nesta figura após domínio da técnica. Uma vez dominada, esta técnica pode ser utilizada para manipular a atividade neural em qualquer região cerebral de interesse em combinação com diversos testes comportamentais como leitura funcional da modulação de circuitos neurais.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Dois diferentes paradigmas de preferência em tempo real usando optogenética dentro da área tegmental ventral do mouse

Com a manipulação optogenética de populações neuronais específicas ou regiões cerebrais, o comportamento pode ser modificado com alta resolução temporal e espacial em animais em movimento livre. Usando diferentes ferramentas optogenéticas em combinação com fibras ópticas cronicamente implantadas, uma variedade de modulações neuronais e testes comportamentais podem ser realizados.

Manipulação optogenética da atividade neuronal para modular o comportamento em camundongos em movimento livre

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa para o estudo da biologia na saúde e na doença. Este protocolo descreve imagens transpupilares da retina de camundongos com um microscópio padrão de dois fótons. Também demonstra diferentes métodos de imagem in vivo para marcar fluorescentemente múltiplas coortes celulares da retina.

Imagem transpupilar de dois fótons in vivo da retina do rato

Como implementado atualmente, a optogenética em primatas não humanos requer injeção de vetores virais no cérebro. Um método de injeção ideal deve ser confiável e, para muitas aplicações, capaz de atingir locais individuais de profundidade arbitrária que são facilmente e inequivocamente identificados na histologia pós-morte. Um método de injeção com essas propriedades é apresentado.

Injeções de vetores AAV para optogenética em cérebro de primata anestêm e acordado comportando-se não-humano

O presente protocolo descreve como usar optogenética sem fio combinada com videografia de alta velocidade em uma única tarefa de alcance à compreensão de pelotas para caracterizar os circuitos neurais envolvidos no desempenho do comportamento motor qualificado em camundongos em movimento livre.

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Aprenda a realizar estimulação optogenética in vivo no sistema nervoso central de roedores acordados e em movimento. Este protocolo detalha a configuração de sistemas a laser e a entrega de luz para regiões cerebrais específicas.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

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