In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

O objetivo geral deste procedimento é realizar com sucesso a estimulação optogenética in vivo do sistema nervoso central de roedores em um animal acordado e em movimento livre. Isso é feito primeiro instalando e configurando o sistema de laser apropriado para realizar a estimulação optogenética. Em seguida, fibras ópticas compatíveis com testes comportamentais são configuradas para fornecer luz laser a uma fibra óptica implantada e à região cerebral de opsina que expressa interesse.

Em seguida, o animal é amarrado ao sistema de laser para estimulação optogenética e colocado em um aparelho de teste comportamental. Finalmente, os parâmetros definidos pelo experimentador de estimulação luminosa para ligar ou desligar os neurônios são entregues enquanto o animal executa uma tarefa comportamental. Em última análise, in vivo, a estimulação optogenética é usada para permitir o controle em tempo real de populações definidas de neurônios ou circuitos neurais em animais acordados, comportando-se para determinar seu papel funcional em um determinado comportamento de interesse.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que ela permite o controle em tempo real de populações de neurônios genética e espacialmente definidas em animais acordados, comportando-se com a resolução temporal necessária para vincular padrões de atividade neural a estados comportamentais complexos. Este protocolo envolve o uso de lasers de classe três B e requer que as diretrizes adequadas de treinamento e segurança sejam seguidas. Óculos de segurança devem ser usados em todos os momentos ao operar lasers com procedimentos de alinhamento que apresentem um risco especialmente alto após a configuração do aparelho laser de acordo com o protocolo de texto, realizar o acoplamento a laser do tipo sem contato do laser azul interno ajustando primeiro os interruptores na parte traseira do laser para cur para corrente e TTL para modo lógico de transistor transistor para iluminação constante na frente do driver, Certifique-se de que o botão liga/desliga esteja zerado.

Em seguida, ligue o laser ligando primeiro o driver, seguido pela chave laser. Para garantir a segurança dos olhos, ajuste lentamente o botão liga/desliga para que aproximadamente um miliwatt de luz laser seja emitido. Em seguida, aguarde de 10 a 15 minutos para o laser aquecer.

Em seguida, conecte o testador de cabo de fibra óptica diretamente à extremidade livre do patch cord do acoplador e ligue o testador de cabo. Em seguida, ajuste o ângulo do acoplador para que o feixe vermelho viaje de volta para o centro do espelho dicróico. O caminho do feixe da luz vermelha emitida pelo testador de cabos é o caminho exato que a luz laser de entrada precisará seguir para ser acoplada ao laser.

Para realizar um alinhamento de curso, use os botões laterais e horizontais nos espelhos cinemáticos para direcionar o feixe de luz laser para o acoplador. Não se preocupe se nenhuma luz azul estiver sendo emitida para fora do cabo de conexão conectado ao acoplador neste momento. Agora coloque um único pedaço de papel semitranslúcido diretamente na frente do espelho dicróico entre o dicróico e o acoplador.

Haverá um ponto azul e um ponto vermelho no mesmo lado deste papel do laser e do testador de cabos, respectivamente. Faça ajustes finos no primeiro espelho de direção ajustando cuidadosamente os botões laterais e horizontais para alinhar o centro do ponto vermelho com o ponto azul. Mova o papel de volta para o acoplador de modo que fique diretamente na frente dele e ajuste os botões no segundo espelho dicróico para alinhar o feixe de laser com o feixe vermelho.

Continue a fazer ajustes finos nos dois espelhos até que o centro dos feixes azul e vermelho esteja exatamente alinhado. Coline, remova o testador de cabo do cabo do acoplador. A luz laser agora deve ser admitida na extremidade do cabo de conexão do acoplador.

Para determinar a eficiência do acoplamento, use um medidor de potência de luz para comparar a potência de luz que entra no acoplador com a potência de luz emitida pela extremidade da fibra. Uma eficiência de acoplamento superior a 80% é considerada muito boa, mantendo a posição do espelho dicróico. Use os dois espelhos de direção para o laser amarelo externo e siga o procedimento de alinhamento que acabamos de demonstrar para acoplar o laser amarelo para configurar uma fibra óptica para estimular um único mouse.

Comece usando o adaptador de suporte F-C-F-C-L-L diretamente conectado à placa de ensaio para conectar o patch cord do acoplador a um patch cord revestido grosso. Prenda uma junta rotativa do comutador às extremidades livres do patch cord revestido grosso. Em seguida, prenda o patch cord animal ao comutador.

Prenda uma luva dividida de conexão à extremidade selvagem de metal livre do cordão de remendo do animal sem forçar a luva totalmente para cima. O selvagem deixa cerca de 0,5 centímetros de manga exposta, pois é isso que se conecta à fibra óptica afixada ao animal com um cabo BNC. Conecte o driver de laser azul ao gerador de pulso e ligue o gerador de pulso.

Agora coloque óculos de segurança apropriados. Depois de certificar-se de que o botão liga/desliga na frente do driver está zerado, ligue o laser ligando primeiro o driver e, em seguida, a chave do laser com o laser definido para o modo positivo TT L. Ajuste lentamente o botão na frente do laser e use um medidor de potência de luz para definir uma emissão de energia de luz de cinco a 10 miliwatts da ponta do patch cord animal.

Consulte o protocolo de texto para obter detalhes adicionais sobre essa configuração. Mude o laser azul para o modo analógico para estimulação in vivo e aguarde de 10 a 15 minutos para que o laser aqueça. Em seguida, prenda suavemente o mouse e conecte a manga dividida no patch cord do animal à fibra implantável crônica.

Certifique-se de que as extremidades de ambas as fibras façam contato físico uma com a outra usando a divisão na luva de conexão como uma janela para visualizar o contato direto entre as duas. Deixe o mouse se recuperar por alguns minutos antes do início do teste comportamental. Em seguida, coloque o animal no aparelho de teste comportamental, certificando-se de que o cabo do conector esteja livre de obstáculos.

Use o gerador de pulsos para pulsar um laser azul em uma frequência predeterminada que ativará a opção de escolha. Depois de concluir o experimento, confirme histologicamente a colocação viral e de fibras, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha, para uma interpretação precisa dos resultados comportamentais. Sob um microscópio, verifique o local de expressão da opsina e o implante da fibra e confirme visualmente a colocação apropriada da injeção do vírus e do implante com base nas coordenadas escolhidas.

Neste exemplo de resultados comportamentais obtidos por meio de estimulação optogenética in vivo, neurônios dopaminérgicos na área ventral ou VTA de camundongos creme de tirosina hidroxilase foram transduzidos com uma função de degrau estável OPSINA ou EYFP como um vírus controlado e um implante de fibra foi implantado cronicamente. Grupos de camundongos foram estimulados simultaneamente e o comportamento locomotor foi registrado por uma hora, conforme demonstrado aqui. A estimulação repetida do ops e do camundongo transduzido à esquerda resultou em um fenótipo hiperativo que persistiu durante toda a estimulação.

Embora nenhuma mudança no comportamento locomotor tenha sido observada no camundongo controle à direita após o teste comportamental, a imuno-histoquímica foi realizada para verificar o direcionamento viral preciso para os neurônios dopaminérgicos VTA e a colocação da fibra foi confirmada visualmente, conforme mostrado nesta figura Uma vez dominado. Essa técnica pode ser usada para manipular a atividade neural em qualquer região do cérebro de interesse em combinação com uma variedade de testes comportamentais como uma leitura funcional da modulação do circuito neural.