Name: Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Aprenda a criar um modelo de carcinoma renal metastático espontâneo em ratos após nefrectomia. Este protocolo permite avaliar a progressão da doença e a eficácia de terapias experimentais de forma padronizada.

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Somos gratos ao laboratório do Dr. Robert S. Kerbel (University of Toronto, Instituto de Pesquisa Sunnybrook, Toronto, Canadá) para obter ajuda técnica e experiência no desenvolvimento deste processo. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Sandra Sexton eo Roswell Park Departamento de Recursos Animais de Laboratório do Instituto do Câncer. Este trabalho foi apoiado por um prêmio da Fundação Aliança Roswell Park (para JMLE).

1. Rim ortotópico Implantação do Tumor <ol><li> Cultura de Células <ol><li> Antes da implantação ortotópico, cultivar células do rato RENCA LUC como uma monocamada a 75% de confluência. </li><li> Seguindo tripsinização e re-suspensão em 5% de FBS contendo meio, as células de centrifugação a 1.000 rpm, 4 ° C durante 5 minutos, repetindo três vezes para lavar em PBS. Em seguida, voltar a suspender as células em meio isento de soro para uma concentração de 5 x 10 4 RENCA LUC / 5 meios livres de soro ul. Nota: Dependendo da variante, ou linha celular utilizada, as células podem ser ressuspendidas numa proporção de matrigel e meio livre de soro de 1:1 a retardar o crescimento de células do rato altamente agressivo e difusão após a implantação. </li></ol></li><li> Cirurgia e implantação de células Nota: Todos os estudos com animais aqui descritos, incluindo a manutenção e determinação de terminais experimentais, foram realizados de acordo com um Comitê Animal Care e Use Institucional (IACUC) protocolo aprovado pelo Roswell Park Cancer Institute. <ol><li> Anestesiar um rato Balb / C utilizando isoflurano (2-3%). Aperte o pé e verificar se há reflexo para garantir anesthetization suficiente. Aplicar veterinário pomada para os olhos para evitar a secagem. Coloque o mouse em decúbito lateral direito e fazer a barba do lado esquerdo entre fore-e traseiras-membro. Aplicar álcool e iodo ao longo da área dorsal lombar para preparar assepticamente área de incisão. </li><li> Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão de pele um centímetro no sentido longitudinal entre a última costela ea articulação do quadril. Solte o tecido conjuntivo sob a pele usando uma tesoura de dissecção romba. Use tesouras cirúrgicas para fazer incisão de 0,5 cm na direcção longitudinal na parede abdominal. Use uma pinça curva para empurrar suavemente para baixo em torno de ferida aberta - isso vai exteriorizar o rim e permitem a imobilização suave do órgão antes da injeção. </li><li> Coloque a seringa de Hamilton com 5 uL da mistura de células preparada. Para implante sub-capsularesções, dois métodos de implantação podem ser empregados: <ol><li> Superficial: Em paralelo com o rim, a agulha de inserção orientada longitudinalmente sob a cápsula renal (mas acima do parênquima) com a borda chanfrada para cima. Uma vez que a agulha está no lugar, injetar todas as células, até formas pequenas bolhas brancas. Lentamente, retire a agulha da cápsula e apagar imediatamente sobre injeção com um algodão aplicador derrubado estéril para absorver qualquer vazamento e evitar a disseminação de células. </li><li> Interno: Com borda chanfrada para cima e a partir do lado oposto do rim definitivo ao local de implantação, inserir a agulha através do interior do rim, até agulha é visível (mas não perfurar) o espaço sub-capsular. Injetar todas as células, até formas de bolhas brancas e local da injeção cotonete para evitar fugas. </li></ol></li><li> Suavemente retornar o rim para a cavidade do corpo. Feche a parede abdominal do corpo usando sutura absorvível 5-0 Vicryl. Uma vez completo, puxar a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 wound clips. Assegurar clips são firmes e uniformemente espaçados para garantir que não haja exposição ferida. Antes de se administrar a recuperação de 500 ul de NaCl a 0,9% e 100 ul de buprenorfina (0,01 mg / mL) por via subcutânea utilizando uma agulha G 25. Rotineiramente monitorar colocação clipe e estabilidade, e retire depois de 10 dias. </li></ol></li></ol> 2. Nephrectomy / remoção do tumor primário <ol><li> Siga o protocolo idêntico para anesthetization mouse, imobilização, incisão e exposição do rim, conforme descrito nas seções 1.2.1 e 1.2.2 (acima). </li><li> Usar um segundo par de fórceps para isolar o rim suavemente a remoção do tecido de gordura de ligação da extremidade caudal e da glândula supra-renal a partir da extremidade craniana do rim. Ao segurar delicadamente o rim, use absorvível sutura Vicryl 5-0 para fazer um nó duplo ao redor do ureter, artéria renal e veia. Lentamente, seguro e, em seguida, cortada por cima do nó para remover o rim. Se qualquer sinal de perda de sangue imediatamente, ou se houver um risco de retenção insuficientede sutura no ureter, artéria e veia, então use cauterizador em vez de tesoura para cortar acima nó. </li><li> Uma vez rim é removido, verifique cuidadosamente para qualquer sangramento da artéria amarrado e usar cauterizador se necessário. Feche a parede abdominal do corpo usando Vicryl 5-0. Puxe a camada de pele em conjunto e colocar 2-3 clips ferida após mesmas precauções, conforme descrito no 1.2.4. Acompanhar de perto animais diariamente após cirurgia para sinais de sofrimento, sangramento, ou mobilidade limitada. Siga as orientações institucionais para animais com segurança. </li></ol> 3. Monitoramento metastático Progressão e localização em Endpoint <ol><li> Quantificação doença metastática: monitoramento Bioluminescent <ol><li> Ver metodologia previamente descrita na JOVE para monitorar metástase usando células transfectadas com luciferase e quantificados utilizando o sistema de imagem 11,12 Xenogen IVIS. </li></ol></li><li> Guia Visual necropsia para avaliação comparativa de distribuição metastáticoção <ol><li> Sacrificar animais de acordo com as diretrizes institucionais, utilizando endpoints, incluindo sinais de angústia, dificuldade para respirar, perda de peso, etc Nota: Fechar o monitoramento de animais é fundamental como progressão metastática espontânea pode ser altamente variável e rápida. </li><li> Use uma tesoura cirúrgica para iniciar uma incisão acima da uretra, que continua até a cavidade torácica a mandíbula inferior. Use uma tesoura sem corte-ended para separar a pele do músculo da parede abdominal. </li><li> Iniciado incisões ao longo dos braços e pernas. Peel pele de distância. Examine cuidadosamente a pele e fáscia da parede abdominal para nódulos, em seguida, os linfonodos superficiais: inguinal, braquial, axilar e cervical superficial. </li><li> Faça uma incisão na parede abdominal e corte ao longo das laterais esquerda e direita, até o diafragma. Com um corte horizontal remover a parte frontal da parede abdominal a nu as vísceras. </li><li> Examine a aparência imperturbável das vísceras fou grosseiramente tumores notáveis. Além disso, note o conteúdo do estômago e dos intestinos; se eles estão vazios, o rato pode não ter sido capaz de comer. Se o conteúdo for escuro, isto pode indicar evidência de hemorragia gastrointestinal superior / inferior. </li><li> Visualmente marcar cada órgão para a presença ou ausência de tumor, a atribuição de uma pontuação total para cada grupo de rato (4 animais por grupo é usado como exemplo na Figura 1D-i). Notas: 1) alargamento dos gânglios linfáticos, não significa necessariamente que é um crescimento do tumor; se é muito porte, muito firme, e uma cor esbranquiçada, é provável um nódulo metastático. 2) leitoso excessivo ou líquido turvo no abdômen indica ascite. Ascite podem incluir sólidos acumulações nos órgãos abdominais, particularmente entre os lóbulos do fígado e do estômago. 3) para os órgãos, tais como os pulmões, nódulos múltiplos podem estar presentes e contadas para comparações entre animais individuais (ver 13, por exemplo). </li><li> Identificar tumores brutas ou anormalidades dos órgãos abdominais individuais: fígado, baço, rins e pâncreas, removendo cuidadosamente e lavagem com PBS a partir de uma garrafa de esguicho. </li><li> Depois de retirar os órgãos abdominais, inspecionar os linfonodos abdominais, incluindo lombar, sacral, renal e linfonodos mesentéricos. </li><li> Avaliar diafragma para a evidência de metástase. Nota: Ampla propagação sobre o diafragma pode fazer com que perca sua contratilidade, levando ao trabalhado ou perda da respiração. </li><li> Remover diafragma e fazer duas incisões laterais na cavidade torácica, retirando a parte frontal para expor os pulmões eo coração. </li><li> Remover pulmões e coração delicadamente segurando e levantando o esôfago eo corte na traquéia acima do coração. Avaliar tecidos para os nódulos. Esprema coração. A falta de consistência elástica pode indicar presente tumor. </li><li> Use uma tesoura cirúrgica para cortar linearmente através do crânio. Remova cuidadosamente pequenos pedaços de crânio até ttodo ele cérebro está exposto. Olhe ao longo do cérebro para nódulos visíveis ou anomalias descolorações. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+advanced+spontaneous+metastasis+for+experimental+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics.</a> Nat. Rev. Cancer. 11, 135-141 (2011).</li>
<li>Souza, B. M., Chaves, K. B., Chammas, R., Schor, N., Bellini, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endostatin+neoadjuvant+gene+therapy+extends+survival+in+an+orthotopic+metastatic+mouse+model+of+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Endostatin neoadjuvant gene therapy extends survival in an orthotopic metastatic mouse model of renal cell carcinoma.</a> Biomed. Pharmacother. 66, 237-241 (2012).</li>
<li>Amagai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+interleukin-2+and+sorafenib+improves+survival+benefits+and+prevents+spontaneous+pulmonary+metastasis+in+murine+renal+cell+carcinoma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of interleukin-2 and sorafenib improves survival benefits and prevents spontaneous pulmonary metastasis in murine renal cell carcinoma models.</a> Jpn. J. Clin. Oncol. 40, 503-507 (2010).</li>
<li>Steeg, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Drug+Development+Must+Consider+the+Impact+on+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical Drug Development Must Consider the Impact on Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 15, 4529-4530 (2009).</li>
<li>Guerin, E., Man, S., Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+postsurgical+advanced+metastatic+breast+cancer+more+accurately+replicates+the+clinical+efficacy+of+antiangiogenic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A model of postsurgical advanced metastatic breast cancer more accurately replicates the clinical efficacy of antiangiogenic drugs.</a> Cancer Res. 73, 2743-2748 (2013).</li>
<li>Day, C. P., Carter, J., Bonomi, C., Hollingshead, M., Merlino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+therapeutic+response+of+residual+metastatic+disease+is+distinct+from+its+primary+tumor+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Preclinical therapeutic response of residual metastatic disease is distinct from its primary tumor of origin.</a> Int. J. Cancer. 130, 190-199 (2012).</li>
<li>Ebos, J. M., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiangiogenic+therapy%3A+impact+on+invasion%2C+disease+progression%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Antiangiogenic therapy: impact on invasion, disease progression, and metastasis.</a> Nat. Rev. Clin. Oncol. 8, 210-221 (2011).</li>
<li>Naito, S., Walker, S. M., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+human+renal+cell+carcinoma+cells+with+high+metastatic+potential+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of human renal cell carcinoma cells with high metastatic potential in nude mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 7, 381-389 (1989).</li>
<li>Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+implantation+in+essential+for+the+selection%2C+growth+and+metastasis+of+human+renal+cell+cancer+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic implantation in essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 9, 145-165 (1990).</li>
<li>Saiki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+invasive+and+metastatic+phenotype+in+human+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of the invasive and metastatic phenotype in human renal cell carcinoma.</a> Clin. Exp. Metastasis. 9, 551-566 (1991).</li>
<li>Mohanty, S., Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+metastasis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Experimental metastasis assay.</a> J. Vis. Exp. 42 (1942), (2010).</li>
<li>Nunez-Cruz, S., Connolly, D. C., Scholler, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+model+of+serous+ovarian+cancer+in+immunocompetent+mice+for+in+vivo+tumor+imaging+and+monitoring+of+tumor+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">An orthotopic model of serous ovarian cancer in immunocompetent mice for in vivo tumor imaging and monitoring of tumor immune responses.</a> J. Vis. Exp. (45), (2010).</li>
<li>Ebos, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+metastasis+after+short-term+treatment+with+a+potent+inhibitor+of+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accelerated metastasis after short-term treatment with a potent inhibitor of tumor angiogenesis.</a> Cancer Cell. 15, 232-239 (2009).</li>
<li>Yang, O. C., Maxwell, P. H., Pollard, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+cell+carcinoma%3A+translational+aspects+of+metabolism+and+therapeutic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal cell carcinoma: translational aspects of metabolism and therapeutic consequences.</a> Kidney Int. 84 (4), 667-681 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O objectivo deste protocolo é o de avaliar a doença metastática espontâneo clinicamente relevantes usando um modelo do rato tumor singênico para descrever técnicas de implantação / ressecção. Actualmente, a maioria dos estudos pré-clínicos de novas terapêuticas experimentais avaliando não incluir o estudo de doença metastática e apenas poucos recapitulam as fases de crescimento do tumor primário, a ressecção cirúrgica, e eventual metástase espontânea. Até o momento, modelos de ratos geneticamente modificados (GEMMs) ger...

A causa principal de mortalidade em pacientes com carcinoma de células renais (RCC) é a doença metastática sistémica que ocorre normalmente depois da remoção cirúrgica de um tumor primário em crescimento nos rins. No entanto, muito poucos modelos de tumores pré-clínicos que avaliaram terapêutica experimental em ratos incluem doença metastática, e menos ainda recapitular fielmente os estágios clínicos de crescimento localizado, cirurgia e iniciação micro-metástases espontânea e progressão 1-3. Esta diferença nos testes tornou-se cada vez mais importante na avaliação de novas terapias como às vezes impressionantes efeitos anti-tumorais observados em modelos animais nem sempre traduzidos para o tratamento da mesma forma bem-sucedida de pacientes 4. Tais diferenças nos resultados pode decorrer de eficácias de drogas diferenciais entre os modelos de tumor localizado ectópica ou ortotópico primárias e em estágio final de doença metastática 5-7. No caso da RCC, poucos estudos têm empregado estabeleceu umnimal protocolos que incluem a doença recorrente espontânea que imita os pacientes que têm, tipicamente, tinham rins portadores de tumor total ou parcialmente removidos de 2,3. As razões para essa falta de testes de modelo de rato variar. Em primeiro lugar, há o custo elevado dos animais e variabilidade inerente de selecção de células de tumor e o potencial metastático. Por exemplo, as linhas de células renais humanas tendem a raramente metástase, e devem ser selecionados ao longo de várias rodadas de implantação primário ortotópico e seleção metastático para derivar variantes que sempre divulgar e formam lesões distantes (ver descrição de tal linha celular uma derivação humana 8-10) . Por outro lado, células de ratos em modelos imunocompetentes tendem a se comportar de forma agressiva, e os números de celulares de baixa deve ser injetado com matrigel para reduzir a disseminação sistêmica imediato 3. Em segundo lugar, as dificuldades técnicas na realização de implantação adequada, a ressecção cirúrgica (nefrectomia) e rastreamento (e quantificação) metastati espontâneac crescimento pode ser desafiador e várias variáveis ​​críticas precisam de consideração quando se emprega essa técnica (veja a discussão para mais detalhes). O objectivo deste protocolo é o de descrever os passos essenciais (bem como armadilhas potenciais) de implantação ortotópico, a ressecção (nefrectomia), e monitoramento da doença RCC metastático espontânea e para oferecer uma orientação para padronizada (e mais generalizada) use entre laboratórios científicos que avaliar a eficácia de terapêuticas experimentais.

<table><tbody><tr><td>DMEM-glicose alta com Pyr. E L-Glutamina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>1x DPBS sem Cálcio & Magnésio</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>deve ser mantido no gelo</td></tr><tr><td>Lágrimas artificiais-lubrificante pomada oftálmica</td><td>Akorn Animal Health</td><td>17478-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Aparador de bolso para animais de estimação</td><td>Braintree scientific</td><td>CLP9931B</td><td></td></tr><tr><td>Cotonete com álcool</td><td>VWR</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Cotonete de solução Betadine</td><td>VWR</td><td>67618-152-01</td><td></td></tr><tr><td>MICRO DISSECTING sissors retos, sem corte - lâminas de 25 mm - 4.5"&nbsp;</td>Fórceps de Íris <td>Cirúrgica Southpointe</td><td>RS-5982</td><td></td></tr><tr><td>, serrilhada, curvada, 10 cm de comprimento</td><td>Kent scientific</td><td>INS15915</td><td>precisa de dois desses</td></tr><tr><td>10 &micro; l Seringa Hamilton</td><td></td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>30 G, 45 graus, agulha RN</td><td>Hamilton</td><td>7803-07</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador estéril com ponta de algodão</td><td>VWR</td><td>10805-144</td><td></td></tr><tr><td>Kit de cautério de alta temperatura</td><td>Kent scientific</td><td>INS500392</td><td></td></tr><tr><td>5-0 revestido Vicryl, agulha de corte convencional&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>J834</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de clipe Reflex para clipes de 7 mm</td><td>Kent scientific</td><td>INS500343</td><td></td></tr><tr><td>Clips Reflex, 7 mm, não estéril</td><td>Kent scientific</td><td>INS500344</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de removência, 12 cm de comprimento</td><td>Kent scientific</td><td>INS500347</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Cloreto de sódio</td><td>Baxter Healthcare</td><td>2B1322</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina 0,01 mg/ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G Agulha de 5/8"</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml sem agulha</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina</td><td>Gold Biotecnologia</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mrcc) em ratos após nefrectomia

Modeling Spontaneous Metastatic Renal Cell Carcinoma (mRCC) in Mice Following Nephrectomy

Um dos desafios chave para melhorar o teste de novas terapias experimentais em carcinoma de células renais (CCR) é o desenvolvimento de modelos que recapitulam fielmente evolução precoce e tardia da fase da doença metastática. Modelos de implantação do tumor típicos utilizar implantação do tumor primário ectópica ou ortotópico, mas poucos incluem doença metastática espontânea sistêmica que imita o ambiente clínico. Este protocolo descreve os principais passos para desenvolver RCC progressão da doença estágios semelhantes aos pacientes. Primeiro, ela usa um mouse linha de células tumorais altamente metastático em um modelo singênico para mostrar a implantação de células tumorais ortotópico. Os métodos incluem a implantação superficial e interna para o espaço sub-capsular com células combinadas com matrigel a evitar fugas e disseminação precoce. Em seguida, ele descreve os procedimentos para a excisão do rolamento de tumor de rim (nefrectomia), com crítica cuidados pré e pós-cirúrgico mouse. Finalmente, descreve as etapas necessárias para monitorar e avaliarmicro e macro-evolução da doença metastática, incluindo a imagem de bioluminescência também fornece um guia de necropsia visual detalhada para marcar distribuição da doença sistêmica. O objetivo desta descrição protocolo é facilitar o uso generalizado de modelos RCC metastático clinicamente relevantes para melhorar o valor preditivo do futuro teste terapêutico.

Figura 1A mostra um esquema que define os procedimentos detalhados neste resumo protocolo. Vários fatores importantes devem ser considerados para cada etapa. Por exemplo, no Passo 1 que mostra dois métodos para a implantação de células de tumor sub-capsular para o rim. As células tumorais podem ser implantados no espaço sub-capsular com um pequeno branco-bolha confirmando a colocação localizada de células com fugas impedido por remoção cuidadosa da agulha e limpando o excesso de escape de fluidos <stron...

Todos os modelos de metástase espontânea do carcinoma de células renais (RCC), a progressão da doença podem ser utilizados para avaliar os tratamentos em um ambiente clinicamente relevante. Este protocolo demonstra procedimentos diferentes para a implantação de células tumorais renal ortotópico, nefrectomia adequada, e, finalmente, apresenta um guia de necropsia para avaliação visual e bioluminescente de carga metastático e localização.

Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

One of the key challenges to improved testing of new experimental therapeutics in renal cell carcinoma (RCC) is the development of models that faithfully ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar um carcinoma de células renais com metástase espontânea que seja clinicamente relevante. Isso é realizado primeiramente preparando as células reka Luke para implante. O segundo passo consiste em realizar um implante ortotópico de células tumorais no rim.Em seguida, após o crescimento do tumor, o tumor primário é removido mediante realização de nefrectomia. O passo final consiste em monitorar a progressão da metástase espontânea após a nefrectomia e avaliar a distribuição da doença em diversos locais. Em última análise, este protocolo permite o monitoramento da doença espontânea de carcinoma de células renais metastático e oferece uma orientação para padronizar a avaliação da eficácia de terapêuticas experimentais.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a implantação ectópica, muitas vezes superficial ou subcutânea, de células tumorais, é que ela recapitula o carcinoma de células renais ou CCR conforme se apresenta em pacientes, incluindo a capacidade das células tumorais de se espalharem para o resto do corpo. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento do carcinoma de células renais, pois é a doença metastática sistêmica que realmente representa a causa primária de mortalidade em pacientes. Modelos em camundongos normalmente não tratam a doença metastática espontânea que pode ocasionalmente ocorrer após nefrectomia.Embora este método possa fornecer informações sobre a doença de RCC metastática espontânea, ele também pode ser aplicado a outros tipos de câncer em que a remoção do tumor primário é comum e a principal causa de mortalidade é a recorrência da doença metastática pós-cirúrgica. Isso inclui modelos de câncer de mama e melanoma, entre outros.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades principalmente por dois motivos: primeiro, a dificuldade em localizar o rim e garantir que as células tumorais permaneçam localizadas após o implante, sem vazamento. E segundo, a necessidade de realizar a cirurgia com eficácia e permitir a recuperação pós-cirúrgica. Antes do implante ortotópico, cultive células de câncer de rim marcadas com luciferase de rato (células reca) ou células reka Luke como uma monocamada até atingirem 75% de confluência. Após a tripsinização, realize a centrifugação das células, repetindo o processo três vezes com lavagem em PBS, e então re-suspenda as células em meio contendo 5% de FBS. Centrifugue novamente e, por fim, re-suspenda as células em meio sem soro até uma concentração de cinco vezes 10 à quarta células reka Luke por cinco microlitros de meio sem soro.Após anestesiar um rato-do-mar com 2 a 3% de isoflurano, pinçe um pé para verificar a anestesia adequada após aplicar pomada veterinária nos olhos para prevenir ressecamento, posicione o animal em decúbito lateral direito e depile o lado esquerdo entre as patas dianteiras e traseiras. Em seguida, aplique álcool e iodo na região lombar dorsal. Use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão cutânea de um centímetro de comprimento na direção longitudinal entre a última costela e a articulação do quadril.Em seguida, use tesoura de dissecação romba para soltar o tecido conjuntivo sob a pele. A seguir, use tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de 0,5 centímetro na direção longitudinal na parede abdominal. Agora, use pinça curva para empurrar suavemente para baixo ao redor da ferida aberta.Isso exterioriza o rim e permite a imobilização suave do órgão antes da injeção. Carregue uma seringa Hamilton com cinco microlitros da mistura celular preparada para uma implantação subcapsular superficial. Mantenha a agulha paralela ao rim orientado longitudinalmente, com a borda biselada voltada para cima, e insira a agulha sob a cápsula renal, mas acima do parênquima.Uma vez que a agulha estiver no lugar, injete todas as células até que se forme uma pequena bolha branca. Retire lentamente a agulha da cápsula e, imediatamente, use um aplicador estéril com ponta de algodão para obstruir o local da injeção, garantindo um implante subcapsular interno. Comece pelo lado do rim oposto ao local de implantação desejado.Segure a agulha com a borda biselada voltada para cima e para dentro. Insira-a através do interior do rim até que a agulha seja visível, mas sem perfurar o espaço subcapsular no lado oposto. Injete as células até formar uma bolha branca e limpe o local da injeção para evitar qualquer vazamento.Retorne suavemente o rim à cavidade corporal. Feche a parede abdominal utilizando sutura absorvível Vicryl 5.0. Após a conclusão, mantenha as camadas da pele unidas e coloque dois a três clipes cirúrgicos antes da recuperação.Administre 500 microlitros de cloreto de sódio a 0,9% e 100 microlitros de buprenorfina por via subcutânea. De 26 a 30 dias após o implante, anestesie o animal e exponha o rim como anteriormente. Em seguida, use uma pinça para remover cuidadosamente o tecido adiposo conectivo da extremidade caudal do rim e remova a glândula adrenal da extremidade cranial.Use uma pin&ccedil;a para segurar suavemente o rim e, em seguida, passe um fio absorv&iacute;vel de Vicryl 5.0 ao redor do ureter, da art&eacute;ria renal e da veia renal. Em seguida, d&ecirc; um n&oacute; duplo lentamente ap&oacute;s prender os fios com hemostatos. Use uma tesoura para cortar acima do n&oacute; e remover o rim.Após a remoção do rim, verifique cuidadosamente a presença de sangramento na artéria e na veia, e realize a cauterização, se necessário. Após suturar a parede corporal abdominal com Vicryl 5,0, utilize clipes cirúrgicos para fechar a pele. Monitore o animal diariamente em busca de sinais de desconforto, sangramento ou mobilidade limitada.Após eutanasiar o animal, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma incisão começando acima da uretra e seguindo até a cavidade torácica, alcançando a mandíbula inferior. Use uma tesoura de ponta romba para separar a pele do músculo da parede abdominal. Em seguida, corte a pele ao longo dos braços e pernas e retire lentamente a pele.Examine cuidadosamente a fáscia cutânea e a parede abdominal em busca de nódulos. Em seguida, examine os linfonodos superficiais. Faça uma incisão na parede abdominal e corte ao longo dos lados laterais esquerdo e direito até o diafragma.Com um corte horizontal, remova a porção frontal da parede abdominal para expor as vísceras. Examine a aparência não perturbada das vísceras em busca de tumores visivelmente notáveis.Observe também o conteúdo do estômago e dos intestinos em busca de evidências de alimento ou hemorragia. Avalie visualmente cada órgão quanto à presença ou ausência de tumor, utilizando uma lista de verificação com 22 sítios; os resultados são tabulados para os animais de um grupo específico, a fim de comparar a distribuição da doença. Agora, remova cuidadosamente o fígado e lave-o com PBS.Em seguida, examine-o quanto a tumores ou anormalidades evidentes e pontue-o como antes. Depois, prossiga com a remoção e pontuação do baço, do rim e do pâncreas. A seguir, inspecione os linfonodos abdominais, incluindo os linfonodos lombossacrais, renais e mesentéricos.Após avaliar o diafragma quanto a sinais de disseminação metastática, remova o diafragma e faça duas incisões laterais na cavidade torácica, removendo a porção frontal para expor os pulmões e o coração; levante suavemente o esôfago e corte a traqueia acima do coração. Após remover os pulmões e o coração, examine os tecidos em busca de nódulos. Em seguida, use uma pinça para comprimir o coração.A falta de consistência elástica pode indicar a presença de um tumor. Por fim, use tesoura cirúrgica para cortar linearmente através do crânio. Remova cuidadosamente pequenos fragmentos do crânio até que todo o cérebro seja exposto.Um sistema de pontuação visual foi utilizado para avaliar a doença, a distribuição e a gravidade da doença em cinco grupos diferentes de animais. Esses grupos apresentaram extensão e gravidade da doença distintas. Uma medição adicional, consistindo em imagem bioluminescente imediatamente após o sacrifício, foi utilizada para avaliar quantitativamente lesões metastáticas micro e macroscópicas.Uma vez dominados, o implante, a nefrectomia ou a necropsia podem ser realizados em cinco a dez minutos por animal, se feitos corretamente. Para examinar se as respostas ao tratamento difeririam entre tipos de células tumorais metastáticas. Células do carcinoma renal metastático.Atualmente, pacientes estão sendo utilizados para implante direto em animais a fim de avaliar o crescimento da doença local e metastática após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de carcinoma de células renais (RCC) explorassem a progressão da doença clinicamente relevante e as respostas à terapia. Em particular, se essas respostas diferem dependendo da doença localizada primária ou do crescimento metastático espontâneo.Não se esqueça de que trabalhar com animais pequenos que estão passando por múltiplas cirurgias exige aderência rigorosa às diretrizes institucionais de protocolo animal e condições estéreis. O conforto e a recuperação dos animais são variáveis críticas para realizar adequadamente este procedimento.

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Duas técnicas podem ser usadas para estabelecer esse modelo: injeção de uma suspensão de células de câncer na parede cecal ou transplante de um pedaço de tumor subcutâneo para o ceco. Este modelo é útil para estudar a progressão natural do câncer colo-retal e testes de novos agentes terapêuticos contra o câncer colorretal.

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Este vídeo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de camundongo com metástase espontânea de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer colorretal ou PDXs. Esses modelos de xenoenxerto imitam parcialmente as características dos carcinomas humanos e entendem os aspectos críticos das malignidades humanas, incluindo invasão e metástase.

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Neste vídeo, desenvolvemos um modelo ortotópico de carcinoma de células renais em camundongos. Esse modelo resulta em tumores primários reprodutíveis no rim injetado e tumores metastáticos no pulmão, permitindo a avaliação da progressão da doença e do tratamento.

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Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

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Um modelo de tumor primário do cancro da mama ortotópico e remoção cirúrgica do tumor primário para prolongar a vida do rato para gerar metástase espontânea são descritos. O crescimento do tumor e progressão são monitorados e quantificado por imagens de fluorescência da luciferase.

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O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

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Implementação de um modelo ortotópico de carcinoma de células renais, em ratinhos imunocompetente proporciona o investigador um sistema clinicamente relevante definida pela presença de um primárias metástases tumorais e pulmonares renais no mesmo animal. Este sistema pode ser usado para testar pré-clinicamente uma variedade de tratamentos in vivo.

Um carcinoma de células Singênico Rato Modelo de metastático renal para Quantitativa e Longitudinal Avaliação da pré-clínicos Terapias

Apresentamos um modelo de câncer de mama murino ortotópico e modelo de mastectomia radical com tecnologia de bioluminescência para quantificar a carga do tumor para imitar a progressão do câncer de mama humano.

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Este protocolo descreve a geração de modelos transplantação orthotopic do paciente-derivados do xenograft por intra-vesically incutir pilhas urotelial de primeira qualidade da carcinoma da pilha ou de injetar intra-rectal pilhas de cancro colorretal em não-obeso diabético/severo combinado ratos da imunodeficiência (NOD/SCID) para o crescimento preliminar do tumor e metástases espontâneas a influência de pilhas stromal do nó de linfa, que imita a progressão de doenças metastáticas humanas.

Modelos de xenoenxertos Ortotópicos derivados do paciente para Carcinoma de células urotelial humana e crescimento do tumor do câncer colorretal e metástase espontânea

Nós descrevemos em detalhe um modelo clinicamente relevante do tumor das metástases do fígado do cancro colorretal (crlm) e a influência do reperfusão da isquemia do fígado (I/R) no crescimento e na metástase do tumor. Este modelo pode ajudar a compreender melhor os mecanismos subjacentes à promoção cirurgia-induzida do crescimento metastático do fígado.

Modelo murino de tumores hepáticos metastáticos no cenário de lesão de reperfusão de isquemia

Carcinoma de células renais metastáticas claras é uma doença sem um modelo animal abrangente para investigação pré-clínica completa. Este protocolo ilustra dois novos modelos animais para a doença: o modelo de camundongo sutópicamente implantado e o modelo de membrana chorioallantoico de frango, ambos demonstram metástase pulmonar semelhante a casos clínicos.

Comparando modelo de carcinoma de célula séuológica metastática clara estabelecida no rim do rato e na membrana chorioallantoico de frango

Aprenda a criar um modelo de carcinoma renal metastático espontâneo em ratos após nefrectomia. Este protocolo permite avaliar a progressão da doença e a eficácia de terapias experimentais de forma padronizada.

Modelagem espontânea metastático carcinoma de células renais (mRCC) em ratos após nefrectomia

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