Hot Catálise Biológica: Calorimetria isotérmica de titulação para caracterizar reações enzimáticas

Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão.

O experimento a seguir descreve um método confiável, rápido e livre de rótulos que emprega calorimetria de titulação isotérmica para determinar quantitativamente a termodinâmica e a cinética das reações enzimáticas em solução usando o calor liberado e absorvido ao longo do tempo como uma sonda interna. Isso é conseguido permitindo que a reação enzimática ocorra na célula de amostra do instrumento a uma temperatura constante e monitorando o desvio do traço de calor da linha de base inicial. Em um primeiro experimento denominado Método um ou M1, o substrato é injetado na solução enzimática e o calor para conversão completa do substrato é medido, permitindo a determinação da entalpia molar total da reação.

Em um segundo experimento chamado método dois ou M dois, várias injeções do substrato são realizadas, permitindo a medição da taxa de produção de calor ao longo do tempo em diferentes concentrações de substrato. Os resultados derivados dos dois experimentos calormétricos permitiram a determinação dos parâmetros cinéticos, kcat e km, assumindo uma catálise enzimática meis menton. A principal vantagem de usar a calorimetria de atrito isotérmico em relação a outros métodos, como ensaios petrofotométricos que monitoram a formação do produto ao longo do tempo, é que o ITC não requer nenhuma modificação e rotulagem do sistema em análise e precisa de muito pouca quantidade de material, pois usa o calor intrínseco da reação como uma sonda interna demonstrando que o procedimento será lusai.

Um estudante de doutorado de nosso laboratório Primeiro dilua uma solução concentrada da enzima com dois mililitros de tampão para dar uma concentração final da enzima na faixa nano molar para o experimento M1. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de tampão a uma solução concentrada do substrato para obter uma concentração de substrato de pelo menos três ordens de magnitude maior que a concentração da enzima e acima do km. Para o experimento M dois, prepare uma solução enzimática de dois mililitros com uma concentração final na faixa de picaMolar a nanomolar.

Dilua o substrato com 0,5 mililitros de tampão para obter uma concentração de substrato na faixa milimolar. Depois de verificar se a célula de amostra e a seringa de injeção estão limpas de acordo com as instruções do fabricante, encha a seringa de carregamento com água destilada. Em seguida, insira suavemente a agulha na célula de amostra, encha a célula e remova o líquido usando o método descrito anteriormente, lave a célula de amostra duas vezes com água destilada e duas vezes com tampão.

Injete lentamente a solução enzimática na célula até que ela se espalhe pela parte superior do tronco celular. Para remover bolhas de ar presas na célula de amostra, produza um jato de cerca de 0,25 mililitros de solução na célula. Depois de produzir o surto mais duas vezes.

Coloque a agulha da seringa de carregamento na borda entre o tronco celular e a porta celular e remova o excesso de solução. Inicie o programa VP viewer e equilibre o instrumento ITC a uma temperatura três graus Celsius abaixo da temperatura experimental desejada. Depois de encher a célula de referência com água destilada da mesma forma que antes, ligue uma seringa de plástico à porta de enchimento da seringa de injeção utilizando um tubo fino de silicone, coloque a ponta da seringa de injeção na água e encha a seringa até que a água saia da porta de enchimento superior, indicando que a seringa de injeção está cheia.

Em seguida, retire a ponta da seringa da água e aspire ar para esvaziar a seringa de injeção. Utilizando o mesmo procedimento, lavar a seringa de injeção com tampão e aspirar ar através do sistema. Em seguida, amarre a solução de substrato em um tubo limpo e estreito.

Posicione-o sob a seringa e insira a agulha da seringa de injeção completamente. Encha a seringa para injeção, deixando uma pequena quantidade de solução na parte inferior do tubo da interface do computador. Pressione fechar a porta de preenchimento.

Uma vez removido o tubo de carregamento de silício, pressione purga e reabasteça para desalojar quaisquer bolhas de ar da seringa de injeção e expulsá-las de volta para a solução a granel. Em seguida, limpe as laterais da seringa para injeção com uma toalha de papel para remover qualquer solução residual e coloque-a na célula da amostra. No experimento M1, defina pelo menos duas adições de cinco a 30 microlitros de substrato para verificar a reprodutibilidade.

Em seguida, defina o tempo de espaçamento entre cada injeção grande o suficiente para garantir que o sinal de calor retorne à linha de base antes da próxima adição. No experimento M dois, defina várias injeções de cinco a 10 microlitros. Defina o intervalo entre as injeções, permitindo que o sistema estabilize a energia térmica para a nova linha de base após cada injeção.

Neste ponto, defina a potência de referência para 20. Em seguida, defina as concentrações experimentais de enzimas e substratos e escolha um nome para o experimento. Defina a temperatura para 25 graus Celsius e inicie o experimento.

Quando o experimento estiver concluído, limpe a célula de amostra e a seringa de acordo com as instruções do fabricante. Após abrir o software origin 7.0, clique no botão abrir e selecione o arquivo correspondente à primeira injeção no traço de calor do experimento M1. Para determinar o delta H da reação, integre o primeiro pico resultante do desvio da linha de base no termograma da injeção única.

M1. Em seguida, divida o valor da área obtida correspondente ao calor total da reação expresso em microcalorias pelo substrato final, concentração na célula da amostra expressa em micromolar e o volume da célula da amostra expresso em litros. Repetir o mesmo procedimento para o segundo pico da experiência M1 e calcular a média dos valores obtidos para as duas medições delta H determinar subsequentemente DQ sobre DT a partir da experiência M dois, medindo a diferença entre a linha de base original e a nova linha de base após cada injeção.

Isso pode ser feito convertendo os dados experimentais em taxas de reação de acordo com a seguinte equação. Utilizando o valor de entalpia obtido no experimento M1. Em seguida, ajuste os dados à equação de Michalis-Menon, em particular do programa de análise.

Clique no botão ler dados e navegue até a pasta onde o M dois experimentos foi localizado. Em seguida, clique na seta de rolagem para baixo dos arquivos do tipo e escolha o ensaio enzimático. Em seguida, clique e abra o arquivo.

Faça ITC do experimento M dois. Depois que a caixa de diálogo do ensaio enzimático for aberta, selecione o substrato do método dois apenas na janela delta H para indicar o valor do delta H obtido no experimento M1. Em seguida, clique no botão do eixo y zero e clique duas vezes antes do primeiro ponto de injeção.

Clique no botão calcular taxa para plotar a taxa versus a concentração do substrato. Por fim, use a função ajustar ao modelo para ajustar a curva e obter a constância cinética. A atividade lítica de cannavale e URIs de CMIS ou feijão JAK foi escolhida como uma reação representativa para demonstrar a aplicabilidade do ITC na determinação quantitativa da catálise enzimática.

Um valor delta H de 10,5 quilocalorias negativas por mol foi medido no experimento M1 integrando a energia térmica decorrente da injeção de substrato de ureia na solução de urease e permitindo que a reação prossiga até a conclusão. A potência térmica registrada no experimento M dois foi convertida para a taxa de reação usando a seguinte equação. O ajuste dos dados obtidos à equação da Cementina de McKayla forneceu os parâmetros cinéticos para a urease do feijão JAK em montes de 20 milimolares.

pH sete como kcat é igual a 30, 200 por segundo e KM é igual a 3,45 milimolares de acordo com os dados relatados anteriormente. A mudança de calor total medida no experimento M1 representa a soma de todos os eventos ocorridos durante a reação em análise e depende da entalpia molar de todos os processos envolvidos, e não apenas da conversão do substrato para o produto. Em um processo genérico no qual o sistema reagente adquire prótons em uma solução tamponada, o tampão libera prótons produzindo calor adicional dentro da célula de reação.

Portanto, o delta H medido é aparente e inclui o delta H intrínseco da reação, bem como a entalpia de ionização do tampão e o número de prótons trocados de acordo com a equação destacada. Usando esta equação em experimentos M1, o número de prótons de troca e o delta H intrínseco podem ser determinados realizando o mesmo experimento em tampões com diferentes entalpias de ionização. A reação geral de hidrólise da ureia resulta na aquisição de um próton do tampão.

Assim, conforme descrito acima, o calor da reação inclui a contribuição da protonação tampão d. Para calcular a idade delta intrínseca da reação de hidrólise, três experimentos M1 foram realizados em diferentes tampões, caracterizados por três entalpias de ionização diferentes conhecidas. A entalpia intrínseca e o número de prótons liberados do tampão podem ser calculados a partir da interceptação e da inclinação do ajuste linear dos dados experimentais.

Eles foram negativos 14,7 quilocalorias por mol e 0,98, respectivamente, em total concordância com os dados relatados anteriormente. As aplicações deste procedimento se estendem da pesquisa básica à aplicada e triagem de drogas, uma vez que a cinética da reação enzimática tenha sido determinada. O experimento pode ser repetido na presença de diferentes tipos e concentrações de inibidores enzimáticos para monitorar a inibição, constantes.