Spinal Cord Injury completo e Cérebro Dissection Protocolo para Wholemount Subsequente In Situ Hibridização em larval da lampreia de mar
14 de outubro de 2014
As lampreias recuperar locomoção após uma lesão completa da medula espinhal. No entanto, alguns neurônios espinhais de projeção são bons regeneradores e outros não. Este artigo ilustra as técnicas para larvas de lampreia mar habitação (e adultos recém-transformados), produzindo completos transecções medulares e preparar cérebros wholemount e medulas espinhais de hibridização in situ.
O objetivo geral deste procedimento é realizar uma medula espinhal completa, transecção e dissecção cerebral para o estudo da orientação do axônio após a lesão. Isso é feito primeiro por transecção, uma medula espinhal lampre no nível da quinta brânquia. Em seguida, o cérebro é dissecado e preso à sileira.
Depois de fixar o cérebro, ele pode ser armazenado em metanol ou imediatamente usado para hibridização in situ, em última análise, alterações na expressão do axonal. Os receptores de orientação podem ser vistos em uma vértebra em regeneração após uma lesão na medula espinhal. A vantagem da técnica que vamos demonstrar hoje sobre o seccionamento de parafina ou seccionamento de criostato mais convencional, é que ela permite que você veja todo o cérebro, incluindo neurônios que se projetam para a medula espinhal que são grandes e identificados.
Demonstrando o procedimento está a Dra. Kathy Zang, uma cientista pesquisadora em nosso laboratório Dos riachos que alimentam os afluentes do Lago Michigan até o rio Delaware, na Pensilvânia, ou riachos no Maine. Larvas do tipo selvagem lampre marinho da espécie. Pet mize em Marus foram obtidos.
As larvas de quatro a 7 anos de idade têm de 10 a 14 centímetros de comprimento e são grandes o suficiente para a lesão e dissecção. Mantenha-os em grupos de 52, cem. Em tanques de água doce de 50 galões a 16 graus Celsius.
O tanque requer um substrato de cascalho de uma polegada para que a lampreia possa ser emprestada Toda a água adicionada ao tanque deve ser condicionada com filtragem de carvão e aeração por pelo menos 48 horas antes de ser adicionada ao tanque. Desde que os animais sejam utilizados no prazo de um ano, não há necessidade de os alimentar para este procedimento. Tenha uma solução de campainha recém-preparada pronta.
Primeiro transfira uma lâmpada para uma solução aquosa saturada de benzocaína. Depois de anestesiado, transfira-o para um prato meio cheio de protetor de silicone. Coloque o prato no gelo e cubra o prato com gelo.
Campainhas frias. Prenda o animal com três alfinetes de insetos de 0,15 de diâmetro, um no focinho e dois na quinta guelra. Em seguida, posicione-o sob um microscópio estéreo para a cirurgia.
Comece usando um bisturi número 11 para fazer uma incisão longitudinal ao longo da linha média dorsal ao nível da quinta brânquia. Isso revelará a medula espinhal ao fazer essa incisão. Use dois ganchos feitos de alfinetes de insetos para prender as paredes da carroceria usando a tesoura Castro revelar número oito.
Faça um corte perpendicular na medula espinhal exposta. Inspecione as extremidades cortadas da medula espinhal para garantir que a transecção esteja completa. Em seguida, usando uma pinça, realinhe as pontas cortadas e feche a ferida.
Transfira a lava lampre para um pedaço de papel de filtro embebido em solução de ringer. Mova a preparação para uma camada de gelo por uma hora para que a ferida possa secar após uma hora. Transfira a lava para seu próprio pequeno tanque de água gelada.
Deixe-o curar por 24 horas. Após 24 horas, verifique se há movimento cordal para a transecção. Se houver algum movimento, a transecção foi incompleta.
Se não houver, o transecto foi bom e o animal pode ser movido para um tanque em temperatura ambiente para recuperação enquanto o animal se recupera. Troque a água a cada dois ou três dias. Uma vez que o animal seccionado esteja suficientemente recuperado, anestesiá-lo e prepará-lo para a dissecação conforme descrito anteriormente.
Para dissecar o cérebro, comece com uma incisão transversal entre a narina e o órgão pineal. Em seguida, com a vitela Castro, uma tesoura corta o tecido ao redor do cérebro enquanto protege o animal. Com fórceps.
As estruturas ovais brancas em ambos os lados do tronco cerebral são as cápsulas óticas. Uma vez que o cérebro esteja exposto, use uma pinça para remover o plexo coróide. Em seguida, use os ganchos de pinos modificados para espalhar a cabeça do animal e expor os nervos cranianos.
Em seguida, corte a medula espinhal transversalmente com a tesoura enquanto prende a medula espinhal com uma pinça. Corte os nervos cranianos para dissecar o cérebro. Em seguida, transfira o cérebro para um pequeno pedaço de silicone e prenda-o lá.
Usando um pino de inseto na medula espinhal e um pino através de um dos bulbos olfatórios. Em seguida, com a ajuda de uma tesoura, cortar a comissura do bulbo interolfatório, a comissura do protetor cerebral e o oex do tronco encefálico ao longo da linha média dorsal. Uma vez que as comissuras e oex são cortadas, desvie as placas A LR lateralmente e prenda-as planas ao silicone com um total de sete pinos de insetos, dois nos bulbos olfatórios, dois nas bordas do corte, comissura do protetor cerebral, dois no oex estendido e um na linha média da medula espinhal.
Agora usando reagentes livres de RNAs, fixe a preparação em 4% para formaldeído em temperatura ambiente por três horas com agitação suave. Os cérebros podem então ser analisados por hibridização in situ dois usando o método descrito a expressão de neógeno em transcritos foi identificada na medula espinhal, projetando neurônios de controle, animais e em animais. Duas semanas após a lesão, o exame aqui é um controle representativo não lesionado.
Após a transecção completa da medula espinhal, houve alterações na expressão do receptor de neógeno. Após duas semanas, o receptor de neógeno no não-controle foi preferencialmente expresso em regeneradores ruins como os neurônios M1 I um I dois I quatro, ou MTH. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para nossa capacidade de explorar a expressão de receptores de orientação, receptores para sulfato de condroitina, protio, glicanos e ativação de bases fundidas, tudo no mesmo cérebro.
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Visão Geral
Este estudo demonstra técnicas para realizar transecções completas da medula espinhal e dissecações cerebrais em lampreias-marinhas. Destaca a recuperação da locomoção após lesão medular e as capacidades regenerativas de neurônios específicos que projetam para a medula espinhal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Regenerativa
- Resposta a Lesão
Antecedentes
- As lampreias-marinhas podem recuperar a locomoção após lesão completa da medula espinhal.
- Alguns neurônios que projetam para a medula espinhal exibem boas propriedades regenerativas.
- Compreender o direcionamento axonal após lesão é crucial para obter insights sobre a regeneração da medula espinhal.
- Este estudo utiliza técnicas de hibridização in situ para análise.
Objetivo do Estudo
- Investigar os mecanismos de orientação axonal após lesão medular.
- Ilustrar técnicas de transecção medular e dissecção encefálica.
- Analisar alterações na expressão de receptores de orientação axonal.
Métodos Utilizados
- Transecção completa da medula espinhal ao nível da quinta brânquia.
- Dissecação do cérebro e fixação para análise.
- Armazenamento das amostras cerebrais em metanol ou uso imediato para hibridização in situ.
- Preparação de espécimes inteiros para visualizar grandes neurônios identificados que projetam para a medula espinhal.
Resultados Principais
- Demonstrou recuperação da locomoção em lampreias após lesão.
- Identificou diferenças nas capacidades de regeneração entre neurônios com projeção medular.
- Mostrou alterações na expressão de receptores de orientação axonal em vértebras regenerativas.
- Destacou as vantagens das técnicas de preparação em bloco sobre os métodos tradicionais de corte em série.
Conclusões
- As técnicas apresentadas fornecem informações valiosas sobre a regeneração da medula espinhal.
- Compreender a regeneração de neurônios pode orientar estratégias terapêuticas futuras.
- Preparações em montagem inteira permitem uma análise abrangente das conexões neuronais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a desmistificação mecanicista de alvos de regeneração de axônios ao fornecer um sistema relevante para a doença, que estuda as respostas neuronais intrínsecas à lesão medular. O preparo em lâmina inteira permite a validação de alvos por meio da visualização direta de neurônios grandes e identificáveis que projetam para a medula espinhal, facilitando a análise comparativa da expressão gênica entre bons e maus regeneradores. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta, ao associar fenótipos moleculares a resultados funcionais de regeneração em um modelo do SNC de vertebrado.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da comparação de perfis de expressão gênica entre populações neuronais funcionalmente distintas.
- Valor Operacional: Oferece um método reprodutível para isolar e analisar subtipos neuronais específicos implicados no sucesso ou fracasso da regeneração.
- Valor Estratégico: Apoia a priorização de alvos ao identificar assinaturas moleculares associadas à capacidade regenerativa.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para avaliação quantitativa de alterações na expressão de receptores de orientação axonal após lesão.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo de CNS em preparação integral para leituras consistentes de hibridização in situ entre diferentes condições experimentais.
- Valor Estratégico: Permite triagem escalonável de receptores de orientação, receptores de sulfato de condroitina e alvos relacionados em uma única plataforma.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Estabelece relevância para doenças ao modelar lesão e dinâmicas de regeneração do sistema nervoso central de vertebrados em lampreias marinhas.
- Valor Operacional: Garante continuidade translacional, desde a descoberta até a validação pré-clínica, por meio de preparação consistente em montagem inteira.
- Valor Estratégico: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco ao permitir a eliminação mecanicista de vias de orientação axonal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo leituras moleculares que orientam estratégias de modulação de vias.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao permitir a comparação direta da expressão gênica em neurônios identificados como regenerativos versus não regenerativos.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio de preparação padronizada de espécimes inteiros, compatível com hibridização in situ multiplex para receptores de orientação axonal.
- Análises: Gera leituras espaciais quantitativas das alterações na expressão de receptores, permitindo que as equipes correlacionem mudanças moleculares com os resultados fenotípicos da regeneração.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de um modelo de lesão no SNC de vertebrados que exibe recuperação funcional e regeneração axonal proximal.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o estudo de múltiplas famílias de receptores de orientação (por exemplo, Neogenina, sulfato de condroitina, proteoglicanos) no mesmo contexto neuronal.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista nas vias de regeneração de axônios por meio da resolução direta de neurônios.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização e reprodutibilidade da dissecação e fixação neuronais para análises moleculares subsequentes.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper ao fornecer evidências precoces de biomarcadores do engajamento do alvo em neurônios com capacidade de regeneração.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de alvos de orientação axonal com base na dinâmica de expressão em populações neuronais validadas.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em técnicas microcirúrgicas para transecção da medula espinhal e dissecção encefálica em lampreias marinhas larvais.
- Depende do acesso a microscopia estereoscópica, pinos para insetos, substratos de silicone e reagentes livres de RNase para preparação e fixação de espécimes inteiros.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de anestesia, recuperação e fixação para garantir qualidade tecidual consistente.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir protocolos entre estágios de desenvolvimento ou espécies, devido a variações na anatomia e no tamanho do sistema nervoso central.
- Limitado pela janela de cicatrização de 24 horas após a lesão, necessária para confirmar a transecção completa antes de prosseguir com a recuperação e a dissecção.
