Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

O objetivo geral deste procedimento é gerar vesículas de bicamada fosfolipídica com maior controle sobre a membrana, unla, molaridade, monodispersidade e conteúdo interno. Usando cad, uma câmara é fabricada a partir de folhas de acrílico e borracha natural. Uma bicamada lipídica suspensa é produzida carregando a câmara com lipídios e solução.

Em seguida, um jato de tinta contendo a solução a ser encapsulada é configurado com o aparelho de jateamento. Uma vez que as configurações apropriadas tenham sido estabelecidas, os pulsos de fluido jateados produzirão vesículas de bicamada lipídica. Em última análise, o jateamento microfluídico produz vesículas de bicamada monodispersas repetíveis.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como eletroformação, emulsão ou geração de gotículas, é o aumento do nível de controle que governa a membrana, molaridade unilateral, monodispersidade e conteúdo interno. Demonstrando o procedimento estará Johanna Harrow, uma estudante de pós-graduação de um laboratório e auxiliando Kara Patel, uma estudante de graduação Usando um software CAD, desenhe uma forma para a câmara que pode ser feita de acrílico usando uma primeira broca de corte a laser, uma 16ª polegada através de orifícios em ambos os lados da câmara de acrílico montada. Isso vai drenar para o poço em forma de infinito.

Em segundo lugar, corte um pequeno retângulo com uma tesoura de uma folha de acrílico de 0,2 milímetro para servir como o fundo da forma de infinito. Bem prenda isso no lugar com adesivo de secagem rápida, certificando-se de não deixar cola nas áreas de visualização. A folha de acrílico deve ser lavada na parede da câmara e fixada no fundo da câmara.

Terceiro, use adesivo de secagem rápida para colar um pedaço fino de folha de borracha natural sobre os orifícios perfurados. Pressione-os no lugar com uma pinça. Teste todas as costuras coladas quanto a vazamentos.

Não deveria haver nenhum. Por fim, usando uma agulha de calibre 23, faça furos na borracha através dos orifícios perfurados, a ponta do jato de tinta piezoelétrica será inserida através desses orifícios. Os fosfolipídios de estoque devem ser dissolvidos em clorofórmio e armazenados a menos 20 graus Celsius.

D-P-H-P-C ou DOPC. Os lipídios são usados nesta demonstração. Os lipídios dissolvidos no clorofórmio são transferidos para um frasco de vidro enquanto mantém o frasco em ângulo, seca suavemente os lipídios sob argônio ou gás nitrogênio.

Em seguida, coloque o frasco com a tampa ligeiramente solta sob vácuo por uma a duas horas para remover o solvente residual. Um dessecador também pode ser usado para esta etapa. Agora solubilize os lipídios no convés final para uma concentração lipídica final de 25 miligramas por mililitro.

Vortex a solução. Feche brevemente a tampa com parâmetro e depois sonice por 15 minutos. Armazene esta solução a menos 20 graus Celsius.

Em seguida, prepare uma solução de estoque de sacarose com osmolaridade fisiológica. Esta é a solução de jateamento. Considere adicionar uma gota de corante alimentar escuro ou contas fluorescentes à solução para adicionar contraste ou fluorescência.

Carregue a solução de sacarose em uma seringa de um mililitro para remover o ar preso. Agite a seringa para que as bolhas subam até a abertura da isca e possam ser expelidas. Em seguida, conecte um filtro de 33 milímetros de 0.22 mícron à seringa e empurre uma gota através do filtro.

Agora desaparafuse o adaptador de isca fêmea do jato de tinta e pressione-o na extremidade do filtro. Empurre um pouco de fluido para remover qualquer ar preso. Por fim, coloque a seringa na parte superior do fluido de jato de tinta.

Deve viajar para a ponta do jato de tinta se a seringa estiver corretamente fixada. Primeiro, monte o conjunto da seringa no estágio do microscópio e conecte o controlador de jato de tinta para este experimento. O palco e a seringa precisam de controle independente, com o palco e a seringa se movendo em três dimensões para visualização.

Configure uma câmera de alta velocidade capaz de pelo menos 1000 quadros por segundo. Defina-o para usar o acionamento automático baseado em imagem para iniciar as gravações. Agora, prenda a câmara ao palco com fita adesiva e alinhe cuidadosamente a ponta do jato de tinta com o orifício feito na folha de borracha na lateral da câmara.

Primeiro, ajuste a olho nu e depois faça ajustes finos usando o microscópio. Uma vez alinhada, retire a seringa ao longo de uma dimensão para carregar a forma de infinito. Bem, então aplique uma leve pressão no êmbolo, de modo que uma gota se forme no bico.

Isso fornece alguma contrapressão inicial. Os parâmetros de jateamento precisam ser definidos. Em seguida, os valores específicos para uma onda bipolar trapezoidal são apresentados na tensão aplicada na tela e o número de pulsos de jato por tamanho da vesícula de controle de gatilho.

Agora carregue a câmara com 25 a 30 microlitros da solução lipídica no final da década, cobrindo toda a superfície da forma infinita. Bem, então para cada um, adicione 25 microlitros de solução de glicose à borda mais externa, pipetando lenta e suavemente, a glicose não deve se misturar à solução lipídica. Dentro de 10 minutos, uma bicamada lipídica se formará no centro da câmara.

A configuração da bicamada é a etapa mais crítica, pois a bicamada é instável e pode quebrar dependendo da preparação. Seja paciente. Vai funcionar quando você praticar o enchimento da câmara algumas vezes.

Agora, insira cuidadosamente a ponta do jato de tinta de volta na câmara quando a ponta estiver a 200 mícrons da interface da gota. Bicamada, inicie o processo de jateamento e registre os dados usando o jato de tinta fornecido informações sobre o processo de geração de vesículas. Por exemplo, variar a distância entre o bico do jato de tinta e a bicamada lipídica afetou a força que deforma a membrana. Fechar.

A proximidade com a bicamada focalizou a corrente de jato e impediu que a membrana dispersasse energia para longe do ponto de geração da vesícula. Além disso, o curso do vórtice aumentou com a tensão aplicada ao atuador elétrico pizo. A formação de vesículas foi visualizada como uma sequência de eventos após sua formação.

A estabilidade da vesícula tendeu a variar com o diâmetro da vesícula, sendo as vesículas menores mais estáveis. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar vesículas violadoras de lipídios usando jateamento microfluídico.