Name: Técnica de transplante heterotópico Murino Coração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-08T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a realizar transplante cardíaco heterotópico em camundongos, incluindo colheita do coração doador, anastomose arterial e venosa, e monitoramento diário da função do enxerto por palpação.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Biagio Pietra por seu trabalho anterior em nosso laboratório.

Todos os animais foram alojados em condições livres de patógenos na Universidade de Colorado Barbara Davis Centro Biotério sob aprovação IACUC e tratados de acordo com as diretrizes do NIH. Profundidade da anestesia é julgado por toe pitada inicialmente e pela observância da taxa de respiração uma vez que o processo já começou. 1. Coração doador Colheita <ol><li> Anestesiar o rato doador através da injeção de pentobarbital (60 mg / kg IP). </li><li> Imobilizar o mouse pelas restrições de 4 vias e clipe da pele. Limpe a pele com álcool. </li><li> Após dissecação afastado da pele, abrir a cavidade abdominal através de uma incisão transversal logo abaixo do diafragma. </li><li> Corte o diafragma para posterior inserção costal e levantar a parede anterior do tórax anterior e superiormente expondo o coração. </li><li> Estender uma espessura total cortar o posterior cavidade torácica lateral nos lados esquerdo e direito do peito. </li><li> Isolar oveia cava inferior (VCI) e coloque um frouxo 5-0 seda de sutura ao redor do IVC adjacente à sua inserção no átrio direito. </li><li> Injetar 1,0 cc de 4 ° C salina heparinizada (200 u / cc) para o IVC, então ligadura do vaso com a sutura de seda 5-0 e dividir. </li><li> Isolar o direito da veia cava superior (VCSD) de forma semelhante e ligadura com fio de seda 5-0 e dividir. </li><li> Rolo delicadamente o coração para o lado direito dos animais e isolar a veia cava superior esquerda (VCSE), ligadura com um fio de seda 5-0 e dividir a exposição da artéria pulmonar esquerda. </li><li> Fixe o coração sob uma gaze molhada, enquanto o timo é fechado dissecado de distância da principal artéria pulmonar (AP) ea PA ramos direito e esquerdo e ascendente do arco aórtico. </li><li> Blunt dissecar o arco aórtico livre dos tecidos circundantes. Micro-tesoura são utilizados para dividir o proximal da aorta até a artéria braquial-cefálica direita, ou seja, não deve haver ramos entre o coração ea divisãoponto da aorta. </li><li> Esta secção do arco aórtico forma o manguito arterial para o processo de implante. </li><li> Refletir a braçadeira aórtica inferiormente para expor o tronco PA e os ramos direito e esquerdo do PA. </li><li> Blunt dissecar os ramos PA esquerdo e direito longe dos tecidos circundantes, tanto do coração quanto possível. Isto permite a fácil dissecção do tronco PA a partir de tecidos circundantes. </li><li> Divida o tronco PA como distalmente quanto possível, logo proximal à sua bifurcação. Esta secção da artéria pulmonar faz o manguito venoso para o processo de implante. </li><li> Coloque uma seda de sutura 5-0 em torno da base do coração e laço. O coração é em seguida cortada na base livre, e colocado em solução salina a 4 ° C. O tempo total de colheita é de aprox. 10-15 min. </li></ol> 2. Técnica de Implantes Coração <ol><li> Anestesiar os ratos receptores com pentobarbital (60 mg / kg de dose inicial de IP, 25 mg / kg IP dose suplementar, se necessário). </li><li> Clipe da pele eimobilizar o mouse pelas restrições de 4 vias e preparar a pele com iodopovidona e cortina de forma estéril. </li><li> Adicione de 2 cm na linha média abdominal incisão vertical e entrar na cavidade abdominal. </li><li> Recolha o intestino superiormente e exteriorizada para o peito. Manter envolto em gaze úmida estéril (solução salina estéril) em todo o caso. </li><li> Isolar a aorta abdominal e veia cava inferior (IVC) abaixo dos vasos renais e colocar 4-0 laços de algodão em torno da aorta e veia cava inferior superior, então inferior à do local da anastomose. </li><li> Identificar todos os vasos lombares dentro do campo e ligar com sutura de nylon 10-0. </li><li> Ate os laços de algodão, primeiro o inferior seguido do superior. Deste modo algum sangue é retida na aorta fazendo o Aortotomia mais fácil. </li><li> Formar o Aortotomia com uma agulha de 30 G para introduzir o lúmen da aorta. Estender a incisão com micro tesouras finas a um comprimento de aproximadamente 2 mm. Esta incisão é feita em uma linha reta ao longo da longaitudinal eixo do navio. </li><li> Faça um fim a anastomose da aorta do doador para a aorta destinatário da seguinte forma. Coloque um 10-0 sutura nylon estadia ponto na aorta do doador e para o ângulo inferior da incisão na aorta destinatário e gravata. Coloque um segundo 10-0 nylon oposto ao primeiro na aorta do doador e do canto superior da incisão na aorta abdominal e gravata. </li><li> Faça uma linha de sutura contínua de superior para inferior na parede lateral da aorta e empate contra o ponto estadia previamente colocado. Não se esqueça de trazer os INTIMAS (superfície vaso interior) juntos, como você costurar. Então suturar o lado medial de forma corrida e gravata. O primeiro e último ponto de cada lado deve ser colocado o mais próximo possível dos pontos estadia possível. Em seguida, ter em vista que 3 pontos uniformemente espaçados entre estes dois perfazendo um total de 5 pontos. </li><li> Faça um fim a anastomose da artéria pulmonar dador até ao receptor IVC da seguinte forma. Puncture a VCI com uma agulha 30 G e estender a incisão durante aprox. Dois milímetros com micro tesoura fina. Esta incisão é feita numa linha recta ao longo do eixo longitudinal da embarcação. </li><li> Amarre a artéria pulmonar do doador para o canto inferior da incisão na VCI com 10-0 nylon. Coloque um segundo 10-0 nylon oposto ao primeiro na artéria do doador e do canto superior da incisão no IVC e gravata. </li><li> Faça uma linha de sutura contínua entre a artéria pulmonar ea veia cava inferior e gravata. O primeiro e último ponto de cada lado deve ser colocado o mais próximo possível dos pontos estadia possível. Em seguida, ter em vista que 5 pontos uniformemente espaçados entre esses dois fazendo um total de 7 pontos. </li><li> Solte o algodão 4-0 empate fluxo venoso restabelecer distal. </li><li> Uma vez que a hemostasia da anastomose venosa tem sido observado o proximal empate 4-0 algodão está gradualmente afrouxados ea anastomose arterial observada para a hemostasia. Quando ambas as anastomoses são consideradas seguras, retire o cotton amarra do mouse. </li><li> Retorne o intestino ao abdômen. A parede abdominal é fechada em duas camadas utilizando 5-0 suturas de seda de uma maneira em execução. </li><li> Administrar um bolus de 1,0 ml de solução salina esterilizada quente no abdômen como reposição volêmica após o fechamento, e 0,8 ml de soro fisiológico é injetado por via subcutânea no pós-operatório. Não são necessárias outras medidas de suporte durante a cirurgia. Recuperar o animal em uma manta térmica. Tempo de implante total é de aprox. 90-120 min para iniciantes, 45-60 min com a experiência. Administrar analgesia buprenorfina, 0,05 mg / kg, SC, 0,1-0,2 ml no início do procedimento e cada 6-12 horas para 72 horas pós-op. </li></ol> 3. Avaliação Enxerto <ol><li> Avaliar a função do enxerto diariamente por palpação trans-abdominal. </li><li> Segure o mouse como se fosse para ser dada uma injecção intraperitoneal. </li><li> Pressione suavemente a ponta de um dedo indicador contra a parede abdominal e determinar o str espancamentoength e regularidade do enxerto. </li><li> Dê qualidade palpação uma pontuação de 4 (amplitude e frequência normal) para 0 (não bater rejeitado enxerto). </li></ol> NOTAS IMPORTANTES: Todos os instrumentos são esterilizados, luvas estéreis são usados ​​durante todo o procedimento e um campo estéril é mantida. As cirurgias dadoras e receptoras são realizadas com o uso de um microscópio de operação. Certifique-se de que as anastomoses são &quot;limpa&quot;. Isto é, que as paredes traseiras não são capturados ao colocar pontos. Isso fará com que uma constrição significativa a fluir que mais do que provavelmente resultam em um enxerto falhou e, em casos extremos para as posteriores de membros paralisia. Também é extremamente importante que a espessura total passa incluindo a adventícia vascular e íntima da agulha de sutura são alcançados. Eversão das bordas também assegura que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Outro fato de importância vitalou é assegurar que a tensão das linhas de sutura de anastomose também é óptima. Muito solto e não haverá vazamento irreversível, muito apertado e estenose a fluir irá resultar. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um coração congestionado vai resultar.

<ol><li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343 (1973).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+experience+of+3%2C000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon.</a> J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).</li>
<li>Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+decades+of+vascularized+heterotopic+cardiac+transplantation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Surg%22%5BJournal%5D)">Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse.</a> J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).</li>
<li>Su, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+suture+technique+in+a+mouse+heart+transplant+model%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified suture technique in a mouse heart transplant model.</a> Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).</li>
<li>Mao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+and+knotless+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice.</a> J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).</li>
<li>Csencsits, K. L., Bishop, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+alloreactive+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells%3A+there%27s+more+to+it+than+MHC+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transplant%22%5BJournal%5D)">Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction.</a> Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).</li>
<li>Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+vascularized+murine+cardiac+transplantation+to+study+graft+arteriopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy.</a> Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).</li>
<li>Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+and+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Rev%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury.</a> Transplant Rev. 23 (1), (2009).</li>
<li>Grazia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cardiac+allograft+rejection+by+directly+cytotoxic+CD4+T+cells%3A+parallel+requirements+for+Fas+and+perforin%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin.</a> Transplantation. 89 (1), 33 (2010).</li>
<li>Liu, F., Kang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> J Vis Exp. (6), (2007).</li>
<li>Plenter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+heart+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Society+for+Surgical+Research.+45th+Annual+Congress%22%5BJournal%5D)">Heterotopic heart transplantation in mice.</a> European Society for Surgical Research. 45th Annual Congress. , (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Esta técnica cirúrgica não é fácil de dominar, mas uma vez dominado é uma poderosa ferramenta de pesquisa. O pesquisador / cirurgião é recompensado pela consistência técnica e pela atenção aos detalhes. Paciência durante a fase de aprendizagem é fundamental. Conforme publicado pelo Niimi 3, com o auxílio de uma ferramenta de aprendizagem de vídeo baseado leva uma média de 11 tentativas para conseguir o primeiro procedimento bem sucedido e 78 tentativas de alcançar uma taxa de sucesso de 90%. Vídeos tornaram-se uma importante ferramenta de ensino em cirurgia 11,12. Solução de problemas Sangramento das anastomoses podem ocorrer e isso é provavelmente devido a qualquer falta de tensão correta nas suturas, ou muito poucas suturas. Enquanto a coagulação do agente indutor, como Gelfoam pode ser útil para reduzir vazamentos, recomendamos que o cirurgião deve contar com boa técnica. Coração não bater congestionada é mais comumente devido à anastomose de que estão muito apertadas, principalmente no lado venoso. A não-beating, enxerto não perfundido é geralmente causada por uma bolha de ar que percorreu a uma das artérias coronárias. É importante manter uma área de humidade a húmido para evitar a entrada de bolhas para dentro dos vasos. Limitações da técnica Esta técnica não é adequada se um investigador pretende investigar efeitos sobre um coração a funcionar em pleno. Isso exigiria uma técnica de transplante ortotópico, que até à data tem-se revelado impossível de executar. Significância com respeito aos métodos existentes Se alguém deseja estudar os efeitos sobre um transplante de órgão totalmente vascularizado, sólida no mouse, em seguida, o modelo de coração é provavelmente o mais simples de dominar. Modelos do rato do pulmão, rim e transplante de fígado existem, mas são muito mais difíceis de aprender e perfeito. As etapas críticas no âmbito do protocolo É de vital importância que a espessura total pasnos incluindo a adventícia vascular e da íntima da agulha de sutura, são alcançados. Eversão das bordas também assegura que não há contacto íntima-a-íntima, que ajuda na cura e selagem das anastomoses. Outro factor extremamente importante é assegurar que a tensão das linhas de sutura de anastomose também é óptima. Muito solto e não haverá vazamento irreversível, muito apertado e estenose a fluir irá resultar. Se no lado arterial isto irá resultar em má perfusão do enxerto, se no lado venoso de um coração congestionado vai resultar. Acima de tudo, a repetição, a consistência do processo e contínua atenção aos detalhes irá produzir grandes resultados e dados financiáveis ​​e publicáveis.

Numa época em que é possível realizar transplantes de rim, pulmão, fígado e pâncreas em ratos, a pedra angular de transplante de órgão de pesquisa básica e imunologia desde 1973 1-4 permanece o modelo de transplante cardíaco heterotópico no mouse. Nos anos seguintes vários artigos foram publicados detalhando melhorias / aperfeiçoamentos 5,6 a este procedimento. Como um modelo de transplante de órgãos sólidos, principalmente vascularizado este procedimento é segundo a nenhum. Uma vez dominado este procedimento se presta à investigação de respostas de rejeição alogênicos 7, o desenvolvimento de vasculopatias crônicas 8 e os mecanismos de lesão de isquemia e reperfusão 9. As chaves para a aprendizagem com sucesso este procedimento são como qualquer outra cirurgia, paciência por parte do instrutor e do estagiário e atenção aos detalhes. No início do processo, o cirurgião irá encontrar novos que they vai gastar muitas horas em cada transplante. À luz da experiência adquirida, tempos cirúrgicos e, portanto, a isquemia, irá reduzir drasticamente. Prestar atenção aos detalhes de cada passo, mais cedo ou mais tarde levar ao sucesso. Enquanto o instrutor pode fazer o seu melhor para passar, e para antecipar, todas as possíveis quedas do poço que podem ser encontrados durante estas cirurgias, o estagiário &quot;criativa&quot; provavelmente vai encontrar alguns dos seus próprios! Os princípios básicos do procedimento são os seguintes. O doador ascendente do arco aórtico é ponta-a-lado anastomosada à aorta abdominal destinatário ea artéria pulmonar de doadores é de ponta-a-side anastomosado ao destinatário abdominal da veia cava inferior (VCI). O sangue flui desde a aorta do receptor em forma retrógrada pela aorta dador para as artérias coronárias. Quando o sangue fluiu através do sistema coronário que drena para o átrio direito através do seio coronário, é bombeado para o ventrículo direito eem seguida, através da artéria pulmonar para o destinatário da VCI. Desta forma, o sistema é fornecido coronária arterial e ritmo sinusal retorna para o enxerto dentro de 1-2 min de reperfusão. Desde as câmaras esquerdas do coração são, essencialmente, a pressão sub-carregado na parede livre do ventrículo esquerdo vai atrofiar com o tempo.

<table><tbody><tr><td>Instrumento</td><td>Roboz #</td><td>Fine Science Tools #</td><td>Arosurgical #</td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação reta #</td>5 <td>RS-5015</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de microdissecação curva #</td>7 <td>RS-5047</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinça serrilhada curva</td><td>RS-5137</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação Vannas, curta</td><td>RS-5610</td><td></td><td>09.140.08</td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação, reta, afiada, longa</td><td></td><td>11.602.11</td><td></td></tr><tr>Porta-agulha <td></td><td></td><td>com cabo de mola micro</td><td>11.549.15</td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td> de mosquito reta <td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação, reta, sem corte</td><td>RS-5962</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de microdissecação, curva, romba</td><td>RS-5981</td><td>14079-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro retrator</td><td>RS-6540</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de instrumentos, 10" x 6 &frac12; &rdquo; x &frac34; "</td><td>RT-1350S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura de seda, 5/0, carretel de 22,5 m</td><td>18020-50</td><td></td>10/0 nylon T4A10Q07 5/0 seda E19A05N Luvas Biogel da Medex Supply Drapes Precept, #64-9012-9 Seringas B-D 1 cc de insulina, #329424 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores</td><td></td><td>de algodão Marca Fisher, #23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Cotonetes de iodo-povidona</td><td></td><td>PDI, #B40600</td><td></td></tr><tr><td>4/0 Laços de algodão Algodão</td><td></td><td></td><td>doméstico autoclavado com instrumentos</td></tr></tbody></table>

técnica de transplante heterotópico murino coração

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

É agora mais de quarenta anos desde que esta técnica foi primeiramente relatada por Corry, Wynn e Russell. Embora tenha demorado alguns anos para outros laboratórios para se tornar proficientes em e utilizar esta técnica, é hoje amplamente utilizada por muitos laboratórios em todo o mundo. Um refinamento significativo para a técnica original foi desenvolvido e relatado em 2001 pelo Niimi. Descrito aqui estão as técnicas que evoluíram ao longo de mais de uma década nas mãos de três cirurgiões (Plenter, Grazia, Pietra) em nosso centro. Estas técnicas estão sendo repassados ​​para uma nova geração de cirurgiões e pesquisadores. Baseado em grande parte na experiência Niimi, os procedimentos utilizados têm evoluído nos pequenos detalhes - detalhes que vamos nos esforçar para relatar aqui, de tal forma que outras pessoas podem ser capazes de usar este modelo muito útil. Como Niimi, descobrimos que um auxiliar de vídeo para a aprendizagem é um recurso de valor inestimável para o novato.

<html> A utilização desta técnica cirúrgica abre o caminho tanto para estudos de sobrevivência do enxerto / rejeição simples, ou protocolos experimentais bastante complexas. No estudo brevemente descrito na figura abaixo, buscou-se definir o envolvimento, se houver, de Fas e / ou perforina como mecanismos de rejeição cardíaca celular mediada CD4 T. Isto foi possível graças à extraordinária variedade de linhagens de camundongos que estão disponíveis hoje. Os resultados demonstram que a rejeição direta de aloenxertos cardíacos por células efetoras CD4 T requer a contribuição alternativa de enxerto expressão de Fas e T expressão perforina celular. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira demonstração de que a atividade citolítica de células T CD4 pode desempenhar um papel obrigatório para a rejeição do enxerto aguda primária in vivo. 1.jpg &quot;/&gt; . Figura 1 Perforin e Fas Representar Obrigatórios e vias paralelas de CD4 T mediada por células B6 rejeição cardíaca, B6 PFPKO (perforina knock-out) e B6 GLD (deficientes Fas-ligante), as células T CD4 foram utilizados para reconstituir B6 rag - / - destinatários de C3H tipo selvagem ou C3H Fas-deficiente lpr aloenxertos cardíacos. Remoção de sozinho Fas (♦, p = NS vs controle Wt C3H + B6 células T CD4) dos corações de doadores ou remoção ou perforina sozinho a partir de células T CD4 (■, p = NS vs controle Wt C3H + B6 CD4 T células) não revogar rejeição. Curiosamente, a remoção de FasL de efectores de células T CD4 fez rejeição demora significativamente (●, p &lt;0,02 versus células C3H Wt + B6 T CD4, p &lt;0,01 versus células C3H Wt + B6 PFPKO T CD4, e p &lt;0,01 vs . C3H lpr + B6 células T CD4). No entanto, a maioria dos enxertos ainda foram rejeitadas (4 de 5). Significativamente, a remoção simultânea do dador Fas e CD4 T perforina celularrejeição completamente revogada (○, p &lt;0,002 vs controle Wt C3H + B6 células T CD4, Wt C3H + B6 células T CD4 PFPKO e C3H lpr B6 células T CD4 +). Esta revogação foi significativamente mais forte do que a remoção individual de FasL células CD4 T (○, p &lt;0,003 vs controle Wt C3H + B6 GLD células T CD4). De Grazia et al 10. Reproduzido com permissão.

O manuscrito descreve as etapas necessárias para realizar o transplante cardíaco heterotópico no mouse.

Técnica de transplante heterotópico Murino Coração

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar e avaliar a saúde de um transplante cardíaco heterotópico em camundongo. Isso é realizado primeiramente colhendo cuidadosamente o coração do doador. Na segunda etapa, o local do enxerto é cirurgicamente preparado no receptor para permitir espaço suficiente para implantar o tecido doador.Em seguida, o coração doador é transplantado mediante a formação de anastomoses arteriais e venosas. Na etapa final, a hemostasia das linhas de sutura vasculares é verificada antes do fechamento do receptor. Por fim, a saúde do enxerto pode ser monitorada por palpação diária para avaliar os efeitos de diversos fatores na sobrevida do enxerto doador.A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos da anastomose são difíceis de aprender. A tensão dos pontos deve ser exata para evitar vazamentos e constrição do fluxo sanguíneo. Para colher o coração do doador, primeiramente imobilize o animal doador anestesiado com contenções em quatro pontos.Após aparar o pêlo, limpe a pele com álcool. Após dissecar a pele, faça uma incisão transversal logo abaixo do diafragma. Para abrir a cavidade abdominal, corte o diafragma posteriormente à inserção costal.Estenda uma incisão de espessura total, abrindo a cavidade torácica posterior lateral nos lados direito e esquerdo do tórax com gelo, isole a veia cava inferior ou VCI e, em seguida, posicione uma sutura frouxa de seda 5-0 ao redor da VCI adjacente à sua inserção. No átrio direito, injete um cc de solução salina SA heparinizada a quatro graus Celsius na VCI, ligue o vaso com a sutura de seda 5-0 e seccione.Em seguida, após ligar e suturar a veia cava superior direita de maneira semelhante, gire suavemente o coração em direção ao lado direito do animal e isole e ligue a veia cava superior esquerda, expondo a artéria pulmonar esquerda. Agora, fixe o coração sob uma gaze úmida e, com dissecação romba, separe o timo da artéria pulmonar principal, dos ramos das artérias pulmonares esquerda e direita e do arco aórtico ascendente. Disseque o arco aórtico dos tecidos circundantes e, então, use tesoura microcirúrgica para seccionar a aorta proximalmente à artéria braquiocefálica direita, até que não haja ramos entre o coração e o ponto de seccionamento da aorta.Esta seção do arco aórtico forma o retalho arterial para o processo de implante. Em seguida, reflita o retalho aórtico em direção inferior para expor o tronco da artéria pulmonar e os ramos esquerdo e direito da artéria pulmonar. Então, dissecione cuidadosamente os ramos esquerdo e direito da artéria pulmonar, separando-os dos tecidos circundantes o mais distante possível do coração.Divida o tronco da artéria pulmonar o mais distalmente possível, logo acima de sua bifurcação, para formar o manguito venoso no processo de implante. Em seguida, amarre um fio de seda número cinco em volta da base do coração. Corte-o livre na base e transfira o tecido excisado para solução salina a quatro graus Celsius.O tempo total de coleta é de aproximadamente 10 a 15 minutos para implantar o coração do doador. Após anestesiar e imobilizar o animal receptor, limpe a pele com iodopovidona e enxágue intercaladamente com álcool ou água estéril. Repita este procedimento três vezes e, em seguida, cubra a área cirúrgica de forma estéril.Em seguida, inicie o procedimento fazendo uma incisão abdominal vertical mediana de dois centímetros. Para acessar a cavidade abdominal, retrai o intestino superiormente e exteriorize o tecido sobre o tórax, envolvendo-o em gaze estéril umedecida com soro fisiológico estéril. A seguir, isole a aorta abdominal e a veia cava inferior abaixo dos vasos renais e coloque quatro laços de algodão zero ao redor da porção superior do tecido, e depois na porção inferior ao local da anastomose.Identifique quaisquer vasos lombares na área e ligue-os com nylon 10 T. Suture, depois desfaça o laço de algodão inferior, seguido pelo superior, para manter algum sangue na aorta, facilitando a realização da autoatomia A. Após assegurar os nós, penetre na luz da aorta com uma agulha de calibre 30.Em seguida, utilize uma tesoura microcirúrgica fina para estender o corte até um comprimento de aproximadamente dois milímetros em linha reta ao longo do eixo longitudinal do vaso. Agora, coloque um fio de sutura de náilon 10-0. Faça um ponto de fixação na aorta do doador e no ângulo inferior do corte na aorta do receptor para realizar uma anastomose término-lateral da aorta do doador para a aorta do receptor.Após dar o nó na sutura, coloque uma segunda sutura em nylon 10 T oposta à primeira na aorta do doador e no canto superior da incisão e na aorta abdominal, e também dê o nó nessa sutura. Quando a segunda sutura estiver posicionada, faça uma linha de sutura contínua do superior ao inferior na parede lateral da aorta, tomando cuidado para alinhar as túnicas íntimas e amarrar contra a sutura de retenção previamente colocada. Em seguida, suture o lado medial de forma contínua e dê o nó, posicionando os pontos inicial e final de cada lado o mais próximo possível das suturas de retenção.Busque fazer três pontos igualmente espaçados entre esses dois, totalizando cinco pontos. Em seguida, para realizar uma anastomose término-lateral da artéria pulmonar do doador com a veia cava inferior do receptor, primeiro fure a VCI com uma agulha de calibre 30 e, depois, use a tesoura microcirúrgica fina para ampliar a incisão por cerca de dois milímetros em linha reta ao longo do eixo longitudinal do vaso. A seguir, fixe a artéria pulmonar do doador ao canto inferior da incisão na VCI com nylon de 10 nós.Coloque um segundo nylon 10 oh oposto ao primeiro na artéria doadora e no canto superior da incisão na veia cava inferior abdominal e amarre. Em seguida, faça uma sutura contínua entre a artéria pulmonar e a veia cava inferior e amarre, posicionando os pontos inicial e final de cada lado o mais próximo possível dos pontos de fixação. Busque ter cinco pontos uniformemente espaçados entre esses dois, totalizando sete pontos.Agora solte os quatro laços de algodão OTT distais para restabelecer o fluxo venoso. Após observar a hemostasia da anastomose venosa, afrouxe gradualmente os quatro laços de algodão OTT proximais e observe a anastomose arterial quanto à hemostasia. Quando ambas as anastomoses forem consideradas seguras, remova os laços de algodão do camundongo, retorne o intestino ao abdômen e use seda 5-0 para fechar a parede abdominal em duas camadas.De forma contínua, administre uma dose de um mililitro de solução salina normal estéril e aquecida no abdômen como ressuscitação hídrica durante o fechamento e injete 0,8 mililitros de solução salina normal por via subcutânea. Por fim, para avaliar a função do enxerto por meio de palpação transabdominal diária, imobilize o camundongo como se fosse realizar uma injeção intraperitoneal. Em seguida, pressione suavemente a ponta de um dedo da mão contra a parede abdominal para verificar a intensidade e regularidade dos batimentos do enxerto.Atribua uma pontuação de quatro para uma amplitude e frequência normais até zero para um enxerto rejeitado sem batimento. Esta técnica cirúrgica facilita tanto estudos simples de sobrevivência de enxertos quanto protocolos experimentais complexos. Por exemplo, neste experimento representativo, investigou-se o envolvimento da ação rápida e/ou da perforina como mecanismos da rejeição cardíaca mediada por linfócitos T CD4 positivos.Os resultados demonstram que a rejeição direta dos enxertos cardíacos por linfócitos T efetores positivos para CD4 requer a contribuição alternativa da expressão rápida do enxerto e da expressão de perran nos linfócitos T, indicando pela primeira vez que a atividade citolítica por linfócitos T positivos para CD4 pode desempenhar um papel obrigatório na rejeição aguda primária de enxertos em condições in vivo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como posicionar os pontos na sua anastomose para obter um enxerto cardíaco saudável e com batimento regular.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

O rato modelo de transplante cardíaco heterotópico tem sido comprovada por muitos pesquisadores de ser um método importante para o estudo dos mecanismos de rejeição e de resposta imune. No entanto, as técnicas envolvidas são ainda um desafio. Ao modificar as técnicas padrão que temos tido sucesso com mais de 1.000 transplantes.

Transplante cardíaco heterotópico em ratos

O modelo de transplante de coração de murídeo cervical é bem adequado para imunológico, bem como estudos de lesão de reperfusão de isquemia. Nós modificamos o procedimento usando uma técnica cuff não sutura e realizou mais de 1.000 transplantes de sucesso com essa abordagem.  Aqui, nós fornecemos mais detalhes desta técnica para complementar o vídeo.

Murino Cervical Modelo de coração Transplante usando uma técnica Cuff Modificado

Uma técnica é demonstrada para o procedimento microcirúrgico para transplante heterotópico de corações em camundongos, incluindo métodos simplificados para coleta de doadores e anastomose de vasos receptores.

Um método modificado para heterotópico Rato coração transplante

A técnica do manguito encurta e facilita o modelo de transplante cardíaco cervical heterotópico em camundongos, evitando anastomoses de sutura tecnicamente desafiadoras de pequenos vasos. Os detalhes técnicos mostrados neste vídeo devem permitir que as pesquisas estabeleçam esse modelo em seus laboratórios.

Heterotopic Cervical Transplante Cardíaco em Ratos

Introduzimos uma abordagem interna do tubo da técnica de manguito para transplante de coração heterotópico cervical do rato para ajudar a everter o vaso sobre a braçadeira. Descobrimos que a cooperação entre dois cirurgiões experientes diminui significativamente o tempo de operação.

Otimização da Técnica de Manguito para Transplante de Coração de Murine

Uma nova técnica para reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de camundongo heterotópico é demonstrada.

Reconstrução do circuito sanguíneo em um modelo de transplante de coração de rato abdominal

No presente protocolo, um modelo de transplante cardíaco em camundongos é utilizado para investigar o mecanismo de rejeição do enxerto cardíaco. Neste modelo heterotópico de transplante cardíaco, a eficiência da operação é melhorada, e a sobrevida dos enxertos cardíacos é garantida por uma anastomose cervical término-terminal do implante cardíaco usando uma técnica de Cuff modificada.

Técnica de Cuff Modificada para Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Cervical:

Modelos de transplante cardíaco de camundongos representam valiosas ferramentas de pesquisa para o estudo da imunologia do transplante. O presente protocolo detalha o transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongos que envolve a colocação de manguitos na artéria carótida comum do receptor e no tronco da artéria pulmonar do doador para permitir o fluxo sanguíneo laminar.

Transplante cardíaco cervical heterotópico de camundongo utilizando manguitos vasculares

O presente artigo descreve uma técnica modificada para transplante cardíaco vascularizado heterotópico com técnica asséptica atualizada, analgesia e anestesia.

Protocolo de transplante cardíaco heterotópico murino modificado que atende aos padrões contemporâneos de técnica asséptica, anestesia e analgesia

Este protocolo apresenta uma técnica simplificada de anastomose de sutura ponta a ponta para transplante cardíaco cervical murino, fornecendo um modelo robusto e reprodutível para o estudo da imunologia de transplantes.

Transplante cardíaco de camundongo heterópico cervical usando a técnica de anastomose ponta a lateral para estudar imunologia de transplante

Aprenda a realizar transplante cardíaco heterotópico em camundongos, incluindo colheita do coração doador, anastomose arterial e venosa, e monitoramento diário da função do enxerto por palpação.

Técnica de transplante heterotópico Murino Coração

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