Dois métodos para estabelecer células endometriais Humano estromais primários de espécimes de histerectomia

O objetivo geral deste procedimento é estabelecer culturas primárias de células estromais endometriais a partir de histerectomias ressecadas. Isso é feito primeiro distinguindo e separando as camadas uterinas para isolar uma seção do tecido endometrial. O segundo passo é escolher uma técnica de isolamento celular entre os métodos de raspagem e tentativa ao utilizar o método de raspagem.

Força mecânica e raspagem são usadas para separar e dissociar as células estromais endometriais. Alternativamente, ao utilizar o método da tripsina, a atividade enzimática da tripsina é usada para separar e dissociar as células estromais endometriais. Em última análise, a microscopia é usada para observar o crescimento e a morfologia celular, enquanto outras técnicas discutidas no manuscrito são usadas para verificar as culturas estromais endometriais.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave de fisiologia no campo reprodutivo, fenômenos como o ciclo reprodutivo e a menstruação Espécimes de histerectomia usados neste manuscrito foram coletados em concordância com um protocolo de ética aprovado pelo IRB da universidade numerado I-R-B-H-S-R número 1 4 4 2 4. Mantenha o tecido derivado do paciente em um tubo de 50 mililitros contendo RPMI ou DMEM com glicose alta a quatro graus Celsius por no máximo 24 horas antes que a amostra seja processada. Quando estiver pronto para começar, lave a amostra de tecido três vezes com um XPBS e descarte a solução entre cada lavagem.

Em seguida, adicione quatro a 10 mililitros de meio de crescimento suplementado com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina à amostra de tecido. Além disso, adicione uma zona de fungos a uma concentração final de 0,25 microgramas por mililitro e incube por 30 minutos. Em seguida, descarte o meio de crescimento e lave o tecido duas vezes com um XPBS.

Coloque o tecido em uma placa de cultura de células de seis centímetros e identifique a camada de endométrio usando essas imagens como guia. Em seguida, separe o endométrio e guarde as outras camadas de tecido para uso futuro. Use um bisturi ou lâmina de barbear para transeccionar o tecido em pequenos pedaços enquanto arranha a placa de cultura de células.

Os arranhões facilitam a fixação das células estromais endometriais primárias emergentes. Em seguida, adicione delicadamente dois mililitros de meio de crescimento ao prato riscado. Nesta fase, os fragmentos de tecido serão visíveis e imobilizados a partir do movimento de arranhar.

Coloque o prato em uma incubadora de cultura de células designada separada de outras linhas celulares para evitar contaminação. Monitore as células diariamente usando um microscópio de luz. Procure pequenas populações de células que emergem do tecido fatiado no segundo ou terceiro dia a cada três dias.

Remova suavemente as culturas de lavagem de mídia antigas com um XPBS e, em seguida, adicione dois mililitros de mídia de crescimento fresca. Comece adicionando quatro mililitros de meio de crescimento. Assim que a taxa de proliferação aumentar durante as etapas de lavagem, aspire os pedaços restantes de tecido.

É improvável que novas colônias surjam do tecido. Após uma semana de passagem de crescimento, as células usam 0,05% de tripsina. Quando as células atingirem entre 75 e 80% de fluência, congele um prato de células.

Uma vez que duas ou três placas são mantidas, as células primárias não podem ser passadas indefinidamente. Para iniciar o isolamento mediado por tripsina, coloque um pequeno pedaço de tecido endometrial em um tubo cônico com dois mililitros de tripsina a 0,25% suplementado com 0,03 miligramas por mililitro. A micina pode então incubar o tecido em uma plataforma rotativa a 37 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, vórtice breve do tecido e, em seguida, centrifugue a 200 a 400 vezes G por dois minutos, descarte o sobrenadante e adicione tripsina fresca. E a micina pode incubar o tecido a 37 graus Celsius por uma hora durante a rotação. Após a incubação, vórtice o tecido por cinco a 10 segundos.

Em seguida, adicione dois mililitros de meio de crescimento contendo 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. Para desativar a tripsina, centrifugue as células a 200 a 400 vezes G por dois a três minutos. Em seguida, rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular.

Em dois mililitros de meio de crescimento, coloque a suspensão celular em uma placa de cultura de células de seis centímetros e raspe a placa para aumentar a fixação das células primárias. Monitore o crescimento celular diariamente com um microscópio óptico e troque o meio de crescimento a cada dois ou três dias. Uma vez que as células tenham atingido uma cofluência de 75 a 80%, use 0,05% ou 0,25% de tripsina para passá-las, isolando as células estromais endometriais.

O uso do método de raspagem gera aglomerados de células emergentes precoces. Ao longo dos arranhões induzidos pelo bisturi, as células estromais endometriais podem ser identificadas por sua morfologia de fibroblastos. O método da tripsina tem um tempo de preparação mais longo do que o método de raspagem, mas as células viáveis são observadas mais cedo.

O método tryin também gera células com padrões de crescimento agrupados e dispersos. Um marcador específico de tecido para células estromais endometriais ainda não foi descoberto. Uma maneira de identificar as células estromais endometriais é medindo a perda de um marcador.

Para células epiteliais, como citoqueratina. A falta de citoqueratina demonstra ausência de células epiteliais endometriais. A perda de coloração de citoqueratina observada na passagem cinco em comparação com a passagem dois confirma a ausência de células epiteliais.

Evidências funcionais para a presença de células estromais endometriais podem ser fornecidas usando um ensaio de descelularização. O aumento da prolactina e da proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante à insulina em resposta ao tratamento com CAMP e acetato de hidroxiprogesterona indica o estabelecimento bem-sucedido de uma cultura estromal endometrial. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estabelecer culturas de células estromais endometriais primárias a partir de histerectomias ressecadas.