Electrospinning Fator de Crescimento Releasing Microesferas em fibrosa Andaimes

Este protocolo combina eletrofiação e microesferas para desenvolver andaimes de engenharia de tecidos para direcionar os neurônios. O fator de crescimento nervoso foi encapsulado em microesferas de PLGA e eletrofiado em arcabouços fibrosos de ácido hialurônico (HA). A bioatividade da proteína foi testada semeando os scaffolds com gânglios primários da raiz dorsal do pintinho e cultivando por 4-6 dias.

O objetivo geral deste procedimento é criar um ambiente multifacetado para apoiar o crescimento e reparo do nervo. Isso é feito encapsulando primeiro os fatores de crescimento em microesferas degradáveis. O segundo passo é preparar o material de apoio para a maior parte do ambiente.

Em seguida, as microesferas e o material de suporte são combinados e eletrofiados em um andaime fibroso alinhado. A etapa final é testar o andaime com neurônios dos gânglios da raiz dorsal do pintinho. Em última análise, a microscopia de imunofluorescência é usada para mostrar que o crescimento e a direção dos neuritos são acelerados em comparação com os controles.

Embora este sistema seja projetado para tecido neural com pequenas alterações nas proteínas e materiais usados, ele também pode ser aplicado a vários tipos de tecido, incluindo corações, pulmões e ossos. Antes de iniciar este procedimento, prepare os reagentes necessários, soluções de álcool polivinílico ou PVA a 2% e 0,5% em peso por volume em água deionizada, uma solução a 2% volume por volume, álcool isopropílico e água deionizada e uma solução aquosa da proteína hidrofílica desejada. Lugar. 40 mililitros da solução de 0,5% PVA em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e reservados em um pequeno frasco dissolveram 300 miligramas de ácido coglicólico polilático 65 a 35 ou PLGA e três mililitros de di clorometano.

Um misturador de vórtice pode ser usado para acelerar a dissolução do PLGA combinando 200 microlitros de solução de proteína e quatro microlitros de solução de 2% de PVA. Despeje a mistura de proteína PVA na solução de PLGA. As soluções permanecerão em grande parte separadas.

Coloque o frasco em um copo de água gelada usando um W ator a cerca de 10 watts, agite a solução por cinco a 10 segundos até que uma emulsão branca cremosa uniforme seja criada. Despeje a emulsão no tubo de 50 mililitros previamente preparado contendo 0,5% PVA. Misture a solução em alta velocidade em um misturador de vórtice por cerca de 20 segundos.

A solução desenvolverá uma aparência turva. Transferir a emulsão para um copo de 200 ml e colocar numa placa de agitação a 350 rpm durante dois minutos. Adicione 50 mililitros de álcool isopropílico a 2% ao copo na placa de agitação.

Deixe a mistura continuar mexendo por no mínimo uma hora para permitir que o clorometano evapore e o PLGA endureça. Em seguida, transfira a solução de microesferas para tubos de centrífuga, centrifugue a 425 vezes G por três minutos. As microesferas se acumularão no fundo do tubo e parecerão brancas Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo acima das microesferas e armazene em um frasco de 500 mililitros.

Enxágue as microesferas com água deionizada enchendo cada tubo com três quartos de enchimento e agitando-o para redistribuir as microesferas no líquido. Repetir a centrifugação, a remoção do sobrenadante e o enxaguamento das microesferas com água desionizada quatro vezes após o enxaguamento final. Retirar o sobrenadante e colocá-lo no frasco de 500 ml com as outras amostras.

Congele as microesferas coletadas nos tubos da centrífuga a 20 graus Celsius negativos durante a noite e, em seguida, liofilize por pelo menos 24 horas. A seguinte solução de eletrofiação deve ser preparada previamente em água deionizada, 2% de peso por volume, ácido hialurônico relacionado à metanfetamina ou miha com 3% de peso por volume, 900 kilodalton de óxido de polietileno ou PEO e 0,05% de peso por volume. Solução de iniciador de fotos.

Depois de fazer o volume desejado de solução eletrofiatória, adicione microesferas na concentração desejada até 400 miligramas por mililitro. Misture a solução em um misturador de vórtice até que as microesferas estejam uniformemente distribuídas na solução. Transfira a solução para uma seringa e coloque uma agulha de ponta romba de calibre 18 de seis polegadas.

Coloque a seringa em uma bomba de seringa e ajuste-a para dispensar em 1.2 mililitros por hora. Cole uma camada de papel alumínio no mandril. Isso permite fácil limpeza e armazenamento do andaime acabado.

Um mandril rotativo é usado para criar fibras alinhadas. Conecte o fio terra de um alto voltage fonte de alimentação ao aparelho de coleta. Conecte o fio positivo à agulha Para garantir uma eletrofiação bem-sucedida.

É muito importante verificar se todas as conexões e configurações estão corretas. Inicie o bombeamento de polímero e quando a solução estiver visível no final da seringa, ligue a fonte de tensão e ajuste a tensão para 24 quilovolts. Execute a solução até que a espessura desejada do andaime seja alcançada.

Quando terminar, desligue a fonte de tensão e a bomba de seringa. Para iniciar este procedimento, prenda as lamínulas relacionadas à área de coleta do eletrogirador com fita dupla face removível antes da eletrofiação. Girar nas lamínulas facilita o manuseio e a visualização após a fiação elétrica até a espessura desejada.

Conforme demonstrado no segmento de vídeo anterior, remova cuidadosamente as lamínulas do mandril. Coloque as lamínulas revestidas com andaime em uma câmara de nitrogênio transparente e certifique-se de que todo o oxigênio seja purgado. Coloque a câmara e o andaime sob uma luz de 10 miliwatts centímetros quadrados de 365 nanômetros por 15 minutos.

Após a reticulação do local, a tampa desliza para uma placa de poço de tamanho apropriado. Certifique-se de que o lado do andaime esteja voltado para cima. Coloque 100 a 200 microlitros de mídia em cada andaime na placa do poço. Cuidadosamente.

Coloque um gânglio da raiz dorsal ou DRG em cada andaime na gota de mídia. Para um andaime espesso, mais mídia pode ser necessária. O DRG precisa estar totalmente submerso e não flutuando.

Incube o andaime e o DRG a 37 graus Celsius por quatro horas para permitir que a célula adira ao andaime. Em seguida, encha a mídia até o nível apropriado para o poço. Retorne a placa à incubadora e incube por quatro a seis dias após o período de incubação.

Remova cuidadosamente a mídia de cada poço e lave suavemente uma vez com PBS. Fixe as células por 30 minutos usando 4% de peso por volume. O paraformaldeído subsequentemente cora as células em busca de neurofilamentos e núcleos seguindo um protocolo estabelecido.

Para visualizar as células usando um microscópio fluorescente, coloque a placa do poço no estágio do microscópio e localize a massa celular usando as configurações de filtro e excitação para dpi. Assim que a célula for identificada, mude o filtro para zi. Para visualizar os neuritos estendidos, use a função de ponto no microscópio para coletar e combinar quantas imagens forem necessárias para ver toda a estrutura.

Repita para microesferas dpi, fite e brightfield. 50 mais ou menos 14 micrômetros de diâmetro com mais de 85% de encapsulamento de proteína foram produzidos de forma consistente e eletros girados em andaimes por este protocolo. Esta imagem fluorescente mostra microesferas representativas com Rod Domine no invólucro de PLGA e ajustes de BSA encapsulados dentro.

Para avaliar o encapsulamento, as microesferas foram preenchidas com BSA e testadas quanto à liberação de proteínas por mais de 60 dias com um ensaio de proteína de Bradford. A liberação começa com uma explosão inicial e continua à medida que as microesferas se quebram após a eletrofiação. As microesferas podem ser vistas em toda a estrutura fibrosa 3D.

Nesta imagem SEM do andaime completo. As esferas podem ser vistas em várias camadas indicadas por setas. Esta imagem de alta ampliação é de uma microesfera com as nanofibras do andaime acima dela.

Os gânglios da raiz dorsal ou DRG foram usados para testar a viabilidade do fator de crescimento nervoso ou NGF nas microesferas dentro do andaime. Aqui estão os DRG sentados em um andaime contendo microesferas. Carregado com NGF é mostrado ao lado de uma microesferas sem proteína dentro do neurite mais longo As extensões que se estendem do DRG no andaime NGF indicam que o NGF é viável e pode promover o crescimento.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como encapsular proteínas em microesferas e incorporá-las em andaimes fibrosos.