Name: Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprenda a eletroporação in utero para expressão seletiva de genes em interneurônios corticais do desenvolvimento em camundongos. Este método permite análise autônoma de subtipos neuronais específicos.

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Somos gratos a Lihong Yin para assistência técnica. NVD é um destinatário de um NARSAD Young Investigator Award e também é apoiada por doações da NIH (5 K99 MH095825-02). Pesquisa no laboratório Fishell é apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) e da Fundação Simons.

Todos os animais foram tratados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso da NYU School of Medicine animal Institucional. Rato Cepas Swiss Webster ratinhos fêmeas fornecidos por TACONIC Foram utilizados para estas experiências. A fim de orientar especificamente interneurônios camada superficial, foram utilizados embriões E15.5. Nota: O plasmídeo utilizado no presente trabalho (Dlx5 / 6.eGFP plasmídeo 3 mg / mL) foi gerado utilizando técnicas de clonagem convencionais. O eGFP cDNA foi clonado num Dlx5 / 6-Pmin-poliA plasmídeo. Este plasmídeo está disponível mediante solicitação (demarn02@nyumc.org). 1 Preparação de microinjeção pipetas <ol><li> Defina o extrator de calor # 2-860. </li><li> Colocar e fixar o capilar de vidro perto do filamento. Verificar que o diâmetro externo (OD) da pipeta é cerca de 30 um. </li><li> Pressione o botão &quot;puxar&quot;. </li><li> Retire cuidadosamente o capilar. A parte inferior é a agulha. Descartar a parte superior. </li></ol> 2 Anestesia Procedimento <ol><li> Prepare uma câmara contendo isoflurano. Nota: O isoflurano é o anestésico preferido devido a sua ação rápida e baixa incidência de efeitos colaterais. Pentobarbital é outra opção; No entanto, a tolerância deste fármaco é variável e pode levar a uma taxa de mortalidade maior do que o isoflurano. </li><li> Definir o fluxo de isoflurano a 4-5% em 0,5-1 L / min O 2. </li><li> Certifique-se de que a válvula para a câmara é aberta enquanto que a válvula para a placa de cabeça está fechado. </li><li> Posicione o mouse grávida na câmara. </li><li> Deixe o mouse para ir sob o efeito da anestesia. Isso levará cerca de 2-3 min. Verifique a taxa de respiração. Se o rato começa a hiperventilar, reduzir a dose de isoflurano. </li><li> Após o mouse está anestesiado, imediatamente removê-lo da câmara. Coloque-o lado ventral em cima da almofada de aquecimento e iNSERT a cabeça na máscara que continuará a fornecer isoflurano durante toda a cirurgia. Certifique-se de mudar o fluxo de isoflurano da câmara para a mangueira que liga a peça adaptador cabeça. Coloque uma gota de lubrificante ocular em cada olho e fechar os olhos. </li><li> Ajuste a almofada de aquecimento a 36 ° C graus para minimizar hipotermia. </li><li> Verificar a ausência de pé e cauda reflexos, beliscar as patas traseiras ea cauda. </li></ol> 3. Cirurgia <ol><li> Limpe a pele que cobre o abdômen com etanol 70%. </li><li> Use uma pinça para puxar a pele para cima. Após as cirurgias, lavar todos os instrumentos com detergente e água, e esterilizou-se a 72 ° CO / N. </li><li> Fazer uma pequena incisão vertical (cerca de 2 cm) ao longo da linha média de partida a meio caminho entre o terceiro e quarto pares de glândulas mamarias. Use a tesoura cirurgia finas. Tome cuidado para não danificar a parede abdominal. </li><li> Separe cuidadosamente a pele do peritônio. </li><li> Visualize as artériase nervuras na parede abdominal. Adicione outro dois centímetros incisão vertical através do peritoneu (evitando os vasos) para expor a cavidade abdominal. </li><li> Prenda a pele ea parede abdominal de cada lado evitando pinçamento das artérias. Nota: Se as artérias são acidentalmente perfurada, sacrificar o animal imediatamente ao realizar deslocamento cervical ou overdose isoflurano. </li><li> Pré aqueça o PBS estéril a 37 ° C. Cubra os grampos com PBS úmidos Kim toalhetes. </li><li> Hidratar a cavidade abdominal exposta com PBS. Repita este passo várias vezes durante a realização da cirurgia. </li><li> Utilizando uma pinça redondas, puxe a cadeia embrionárias (E15.5) fora da cavidade. Deixe o resto da cadeia sobre os lenços umedecidos. Iniciar expondo metade do útero primeiro. Uma vez que os embriões em que são electroporados, trazê-lo de volta para dentro, em seguida, trabalhar no segundo semestre. </li></ol> 4. Eletroporação <ol><li> Continue a usar fórceps redondas para manipular os embriões. </li><li> Visualize os ventrículos laterais. Os ventrículos laterais correm ao longo da linha média (Figura 1b). </li><li> Adicionar Verde Rápido (Banco: 10% w / v) à solução de DNA de uma mistura 01:20 de visualizar que durante a injecção. Preparar a solução de DNA através da dissolução do sedimento obtido a partir de um protocolo padrão de purificação de maxi-prep em água destilada. </li><li> Utilize micropipetas pré puxados com um êmbolo para injetar 1 ml da solução de DNA (Dlx5 / 6-EGFP, 3 mg / mL) com Fast Green. Cortar a ponta da micropipeta com uma pinça fina # 5 (Dumont) para deixar 6 mm de comprimento a partir do início do ombro até ao final da ponta da agulha antes de colocar a pipeta. Segure a cabeça do embrião com uma pinça redondas. Entram no cérebro com a pipeta com um ângulo de 45 ° com vista para o ventrículo lateral, localizado perto da linha média. Se a agulha penetra através do ventrículo, retirar lentamente a pipeta como você usa o êmbolo para injetar DNA. O ventrículo deve ficar verde quando osolução começa a preenchê-lo. Neste ponto, param de se mover a pipeta e injectar 1 ml de ADN. Delicadamente, retire a pipeta. </li><li> Defina o electroporator CUY21 cinco 45V pulsos de 50 ms espaçadas de 950 ms. </li><li> Use 5 milímetros eletrodos de remo para os embriões E15.5. Mergulhe os eletrodos em PBS para garantir a transmissão de corrente eficiente. </li><li> Coloque as pás de eléctrodos em volta da cabeça do embrião com a pá positivo sobre o ventrículo contendo a solução de ADN. Ligeiramente inferior a pá positiva com relação à negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Esta manipulação irá minimizar a expressão ectópica de células piramidais. </li><li> Após a colocação dos eletrodos, entregar um pulso, pressionando o pedal uma vez. </li><li> Retirar os eletrodos e limpe-os. Repita os passos de 4,6-4,9 com cada embrião. </li><li> Após electroporating todos os embriões, derrame 3 ml de PBS para dentro da cavidade abdominal e devolvê-las para a cavidade abdominal. </li><li>Primeiro sutura da parede abdominal com uma agulha curva e sutura de seda 5-0 e, em seguida, a pele. Aplicar lidocaína (4%) na ferida. Administrar 120 mg / kg de aspirina peritônio intra para analgesia. Nota: O procedimento completo deve ser realizado em 20 minutos ou menos. É aconselhável que os novatos só electroporate alguns embriões para manter o tempo de funcionamento curto. Cirurgias prolongadas vai diminuir a taxa de sobrevivência dos embriões. </li><li> Remover o animal da tubulação de anestesia e permitir a recuperação da almofada de aquecimento em um papel wipe. </li><li> Voltar animais para a jaula, mantê-lo no bloco de aquecimento a 37 ° C e monitorar o estado de saúde. Os animais geralmente toleram bem a cirurgia e começam a mover-se lentamente, logo depois de terem sido removidos do tubo anestesia. Se o sangramento ou letargia excessiva é observada, sacrificar o animal imediatamente realizando IACUC aprovado procedimentos de eutanásia, como a luxação cervical ou anestesia overdose. </li><li> Voltar gaiola para o vivarium. As fêmeas dão à luz naturalmente. </li></ol>

<ol><li>Fishell, G., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+inhibition+within+the+telencephalon%3A+%26%2334%3Bwhere+the+wild+things+are%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of inhibition within the telencephalon: &#34;where the wild things are&#34;.</a> Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).</li>
<li>Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+progenitor+populations+in+the+lateral+ganglionic+eminence%3A+implications+for+striatal+and+olfactory+bulb+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis.</a> J Neurosci. 23, 167-174 (2003).</li>
<li>Eisenstat, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DLX-1%2C+DLX-2%2C+and+DLX-5+expression+define+distinct+stages+of+basal+forebrain+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation.</a> J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).</li>
<li>Batista-Brito, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+integration+of+cortical+interneurons+into+a+functional+network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental integration of cortical interneurons into a functional network.</a> Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).</li>
<li>Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologically+distinct+temporal+cohorts+of+cortical+interneurons+arise+from+telencephalic+Olig2-expressing+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors.</a> J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).</li>
<li>Miyoshi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+fate+mapping+reveals+that+the+caudal+ganglionic+eminence+produces+a+large+and+diverse+population+of+superficial+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons.</a> J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Dlx-2+%28Tes-1%29+gene+is+expressed+in+spatially+restricted+domains+of+the+forebrain%2C+face+and+limbs+in+midgestation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+development%22%5BJournal%5D)">The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos.</a> Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).</li>
<li>Bulfone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+Dlx-1%2C+Dlx-2+%28Tes-1%29%2C+Gbx-2%2C+and+Wnt-3+in+the+embryonic+day+12.5+mouse+forebrain+defines+potential+transverse+and+longitudinal+segmental+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries.</a> J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).</li>
<li>Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+restricted+expression+of+a+member+of+a+new+family+of+murine+Distal-less+homeobox+genes+in+the+developing+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+biologist%22%5BJournal%5D)">Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain.</a> The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).</li>
<li>Close, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satb1+is+an+activity-modulated+transcription+factor+required+for+the+terminal+differentiation+and+connectivity+of+medial+ganglionic+eminence-derived+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons.</a> J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+is+required+for+the+development+of+specific+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes.</a> Nature. 472, 351-355 (2011).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+electroporation+for+gene+expression+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239(2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Limitações da técnica Embora esta técnica permite a célula de análise autônoma de processos celulares, não é adequado para análise da população. Os electroporations são muito escassos com menos de mil células eletroporados por cérebro. Como consequência, a técnica não pode ser utilizada para avaliar as consequências comportamentais resultantes da manipulação genética de interneurónios CGE-derivados. Enquanto electroporações realizadas em subtipos alvo E13.5 E14.5...

A maior parte dos interneurônios GABAérgicos corticais originam de duas estruturas embrionárias transitórias nomeadas as eminências ganglionares média e caudal (MGE e CGE respectivamente) 4. Parvalbumin e somatostatina expressar interneurônios origem no MGE enquanto Calretinina (Cr), Vasointestinal peptídeo (VIP) e Reelin (Re) expressando interneurônios originam do CGE. Estes subtipos Interneuron podem ser distinguidos pelas suas datas de nascimento. MGE subtipos derivados nascem entre o dia embrionário 9.5 (E9.5) e E16.5 5,6. Em contraste, interneurônios CGE derivados nascem E12.5 através E18.5 com sua produção atingindo um máximo de 6 E15.5. A orientação genética dessa população tarde nascido, no entanto, permanece indefinida. Os (Dlx) genes distal-less murino são exclusivamente expressos no cérebro anterior ventral desenvolvimento 3. Interneurônios GABAérgicos e neurônios de projeção do estriado, mas não células piramidais corticais expressar Dlx1, 2,5, e 6 genes em estágios iniciais de desenvolvimento 3. De facto, os genes são expressos Dlx na zona MGE e CGE subventricular (SVZ), em todas as células progenitoras GABAérgicos. Expressão desses genes se torna restrita a seleccionar subtipos em fases pós-mitóticas 7-9. Evidências experimentais anteriores mostraram que o elemento potenciador Dlx5 / 6 permite o direcionamento seletivo de linhagens GABAérgicas em modelos de camundongos transgênicos 2. Foi testada a utilização de um destes elementos potenciadores no contexto da expressão episómico no cérebro do rato em desenvolvimento. Nós sub clonado o elemento potenciador Dlx5 / 6 em conjunto com um promotor mínimo e a proteína verde fluorescente melhorada (EGFP) no Bluescript (BS) plasmídeo de esqueleto (Figura 1). Nós introduzimos o plasmídeo por meio de in utero eletroporação em E15.5 para alvejar seletivamente Cr-, VIP e Re subtipos 3,8,10. A nossa técnica permite electroporação escasso, o que facilitaa reconstrução das características morfológicas de células singe. Além disso, os níveis excepcionalmente elevados de expressão de genes em neurónios GABAérgicos corticais permite estudos funcionais. Realizou-se a perda eo ganho de estudos da função utilizando vários tipo selvagem e genes dominantes negativos 11.

<table><tbody><tr><td>Eletroporador com pedal</td><td>Eletrodos de pá Protech International</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>5 mm</td><td>Protech International</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Almofada de aquecimento&nbsp;</td><td>Extrator</td> de instrumentos Sutter <td>P30 DCT-15</td><td></td>da Kent</tr><tr><td>Scientific&nbsp;</td><td>Instrumentos Sutter 3282322</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de Anestesia Fluovac</td><td>Aparelho Harvard</td><td>726425</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Operação Delicada 4.75" Reta Afiada/Afiada</td><td>Roboz</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Trança de Seda Preta 18" C-1 Caixa 36&nbsp;</td><td>Roboz</td><td>SUT-1073-21</td><td></td></tr><tr><td>Micro Clip Aplicando Fórceps 5.5"</td><td>Roboz</td><td>RS-5410</td><td></td></tr><tr><td>2 Tesouras de Grampo</td><td>Roboz</td><td>RC-4894</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de Fixação&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11031-15</td><td></td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidro&nbsp;</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Estéril PBS</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr></tbody></table>

subtipo seletivo eletroporação de cortical interneurônios

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

O estudo do sistema nervoso (CNS) central de maturação depende de orientação genética de populações neuronais. No entanto, a tarefa de restringir a expressão de genes de interesse para os subtipos neuronais específicos provou extremamente difícil devido à escassez relativa de elementos promotores específicos. Interneurônios GABAérgicos constituem uma população neuronal com ampla diversidade genética e morfológica. De facto, mais de 11 subtipos diferentes de interneurónios sensíveis a GABA têm sido caracterizadas no córtex do rato 1. Aqui apresentamos um protocolo adaptado para direcionamento seletivo das populações GABAérgicos. Conseguimos subtipo direccionamento selectivo de interneurónios sensíveis a GABA, utilizando o elemento potenciador da transcrição homeobox factores Dlx5 e DLX6, os homólogos da distal inferior (Dll) do gene de Drosophila 2,3, para dirigir a expressão de genes específicos dentro do útero por meio de electroporação.

Nós adaptamos a técnica de eletroporação in utero para atingir alvos específicos tipo de célula de neurônios vencimento. Para dirigir a expressão de GFP em interneurônios CGE derivados, foi utilizado o elemento potenciador Dlx5 / 6 e restrito nossas injeções para E15.5, a fase em que a maioria dos interneurônios CGE derivados são gerados. Realizou-se a análise em P8 e P15 11 (Figuras 1 e 2). Foi confirmada a origem ventral de neurônios eletroporados por co e...

Este procedimento mostra como direcionar interneurônios no prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Essa técnica foi particularmente eficiente para alcançar a expressão gênica seletiva em subtipos de interneurônios destinados às camadas superficiais do córtex.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

O objetivo geral deste procedimento é direcionar neurônios internos no cérebro em desenvolvimento de camundongos com quatro semanas de idade por meio da eletroporação intraútero. Isso é realizado primeiramente preparando as agulhas de injeção. O segundo passo é remover a cadeia embrionária do animal anestesiado.Então, a injeção de DNA e a eletroporação são realizadas no cérebro. O passo final é permitir que o animal se recupere da cirurgia. Em última análise, a eletroporação in utero é utilizada para permitir o direcionamento seletivo de subtipos de interneurônios.A vantagem desses métodos em relação às técnicas existentes, como a eletroporação inespecífica in utero, é que eles proporcionam os meios para realizar uma análise autônoma celular de um subconjunto de interneurônios corticais. Os altos níveis de expressão de GFP permitem a visualização e análise de interneurônios individuais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do desenvolvimento neurológico, como quais são as regras que governam a integração de interneurônios em maturação.Para iniciar este procedimento, prepare a pipeta de microinjeção puxando uma capilar de vidro com um puxador de pipetas. Em seguida, remova cuidadosamente a capilar e colete a agulha inferior para microinjeção. Agora, posicione um camundongo grávido anestesiado com a face ventral voltada para cima sobre a placa aquecida.Cubra suas vias aéreas com uma máscara que continuará fornecendo isoflurano durante toda a cirurgia. Em seguida, aplique lubrificante ocular em ambos os olhos. Ajuste o aquecedor a 36 graus Celsius para prevenir hipotermia posteriormente.Verifique a ausência de reflexos nos pés e na cauda apertando as patas traseiras ou a cauda. Em seguida, limpe a pele do abdômen com etanol 70%. Use uma pinça para puxar a pele para cima.Em seguida, faça uma pequena incisão vertical de dois centímetros ao longo da linha média, começando no ponto intermediário entre o terceiro e o quarto par de glândulas mamárias. Tenha cuidado para não danificar a parede abdominal utilizando pinças redondas. Puxe suavemente a cadeia embrionária para longe da cavidade.Deixe a corrente repousar sobre as toalhetes umedecidos. Comece expondo uma metade do útero. Em seguida, prossiga para a eletroporação dos embriões antes de passar para a outra metade.Neste procedimento, prepare uma solução de DNA dissolvendo o pellet obtido a partir de um protocolo padrão de purificação tipo maxi prep em água destilada. Em seguida, adicione azul de metileno à solução de DNA numa proporção de um para vinte para permitir a visualização durante a injeção. A seguir, corte a ponta de uma micropipeta previamente puxada com pinça fina, deixando seis milímetros desde o início do ombro até a extremidade da ponta.Em seguida, carregue a micropipeta com um microlitro de solução de DNA contendo verde rápido para injeção. Segure a cabeça do embrião com pinças redondas. Insira a pipeta no cérebro em um ângulo de 45 graus, direcionando-a para o ventrículo lateral localizado próximo à linha média.Se a agulha penetrar através do ventrículo, retire lentamente a pipeta. O ventrículo deve ficar verde quando a solução começar a preenchê-lo. Nesse momento, pare de mover a pipeta e injete um microlitro de DNA.Em seguida, retire suavemente a pipeta. Configure o ECM 3080 para oito pulsos de 45 volts com duração de 50 milissegundos, espaçados por um intervalo inter-pulso de 950 milissegundos. Mergulhe os eletrodos em forma de pá de cinco milímetros em PBS para garantir uma transmissão eficiente da corrente.Em seguida, posicione as pás do eletrodo ao redor da cabeça do embrião, com uma pá positiva sobre o ventrículo contendo a solução de DNA. Coloque a pá positiva ligeiramente mais baixa que a negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Isso minimizará a expressão ectópica em células parametállicas.Agora, aplique um pulso pressionando o pedal com o pé uma vez, depois remova os eletrodos e limpe-os. Repita os passos para cada um dos embriões. Após eletroporar todos os embriões.Despeje três mililitros de PBS na cavidade abdominal e retorne os embriões para a cavidade abdominal. Em seguida, feche a parede abdominal com uma agulha curva e sutura de seda 5-0, e depois a pele. Aplique lidocaína sobre a ferida e administre inicialmente 120 miligramas por quilograma de aspirina para analgesia.Retire o animal do tubo de anestesia e permita a recuperação sobre uma toalha de papel no aquecedor. Após isso, devolva o animal à gaiola. Mantenha-o no aquecedor a 37 graus Celsius e monitore o estado de saúde.Neste experimento, os interneurônios eletroporados são delimitados pela expressão de marcadores de subtipos derivados da ECG. Esta imagem mostra que os interneurônios derivados da ECG foram eletroporados com um plasmídeo DLX5/6-EGFP. Esta imagem mostra um interneurônio que expressa VIP no P8.A expressão de EGFP delimita toda a árvore dendrítica e a arborização axonal de neurônios individuais, e aqui temos um interneurônio que expressa NPY no P8. A expressão de NPY delimita células neurogliformes. Por fim, aqui está um interneurônio que expressa NPY no P15.Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 20 minutos, se executada corretamente. Ao combinar o uso de plasmídeos específicos e linhagens de camundongos geneticamente modificados, é possível obter controle temporal e espacial na expressão de genes de interesse. Em alguns experimentos, utilizamos o plasmídeo A-D-L-X-T-T-A para induzir a expressão de transgenes dependentes de AU.Nestes experimentos, silenciamos a expressão do transgene administrando doxiciclina.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Na eletroporação utero é um método valioso para transfecting células progenitoras neuronal in vivo. Dependendo da colocação dos eletrodos e do ponto no tempo de desenvolvimento de eletroporação, certos subgrupos de células corticais podem ser alvo. Células-alvo podem então ser analisados ​​in vivo ou in vitro para efeitos da alteração genética.

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

Entrega Gene eficiente em múltiplos territórios CNS Usando In Utero Eletroporação

Este vídeo demonstra o protocolo para eletroporação de genes de célula única em neurônios excitatórios e inibitórios em uma variedade de culturas de fatias de hipocampo in vitro. A técnica é útil para examinar funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações de proteínas transsinápticas.

Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

Fonte: Denaxa, M., el al., Transplante de progenitores de interneurônios corticais quimiogeneticamente modificados em cérebros de camundongos pós-natais precoces. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para injetar um vetor de plasmídeo carregando o gene de interesse em progenitores interneurônios em uma fatia de cérebro embrionário, seguido de eletroporação para entrada de plasmídeo e expressão gênica. Esses progenitores modificados podem ser usados posteriormente para o...

Transferência de genes assistida por eletroporação incorporada em agarose em progenitores de interneurônios corticais de camundongos

A superfície pial é uma zona de progenitor original no SNC, que está a receber cada vez mais atenção. Aqui, detalhamos um método para manipulação genética rápida desta zona progenitor usando um método de eletroporação modificado. Este procedimento pode ser usado para investigações celulares e moleculares de linhagens celulares e vias de sinalização envolvidas na diferenciação celular e para esclarecer o destino e as propriedades das células-filhas.

Neonatal Pial Superfície Eletroporação

Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.

In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula

Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.

Transplantação dos progenitors corticais Quimiogenetically projetados do interneuron em cérebros Postnatal adiantados do rato

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

Aqui apresentamos um protocolo descrevendo a transdução viral de regiões cerebrais discretas com construtos optogenéticos para permitir a caracterização eletrofisiológica específica da sinapse em cortes cerebrais agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogação Optogenética da Transmissão Sináptica de Longo Alcance e Plasticidade do Córtex Pré-frontal Medial para o Córtex Entorrinal Lateral

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Aprenda a eletroporação in utero para expressão seletiva de genes em interneurônios corticais do desenvolvimento em camundongos. Este método permite análise autônoma de subtipos neuronais específicos.

Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

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