Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

O objetivo geral deste procedimento é direcionar neurônios internos no cérebro em desenvolvimento de camundongos com quatro semanas de idade por meio da eletroporação intraútero. Isso é realizado primeiramente preparando as agulhas de injeção. O segundo passo é remover a cadeia embrionária do animal anestesiado.

Então, a injeção de DNA e a eletroporação são realizadas no cérebro. O passo final é permitir que o animal se recupere da cirurgia. Em última análise, a eletroporação in utero é utilizada para permitir o direcionamento seletivo de subtipos de interneurônios.

A vantagem desses métodos em relação às técnicas existentes, como a eletroporação inespecífica in utero, é que eles proporcionam os meios para realizar uma análise autônoma celular de um subconjunto de interneurônios corticais. Os altos níveis de expressão de GFP permitem a visualização e análise de interneurônios individuais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do desenvolvimento neurológico, como quais são as regras que governam a integração de interneurônios em maturação.

Para iniciar este procedimento, prepare a pipeta de microinjeção puxando uma capilar de vidro com um puxador de pipetas. Em seguida, remova cuidadosamente a capilar e colete a agulha inferior para microinjeção. Agora, posicione um camundongo grávido anestesiado com a face ventral voltada para cima sobre a placa aquecida.

Cubra suas vias aéreas com uma máscara que continuará fornecendo isoflurano durante toda a cirurgia. Em seguida, aplique lubrificante ocular em ambos os olhos. Ajuste o aquecedor a 36 graus Celsius para prevenir hipotermia posteriormente.

Verifique a ausência de reflexos nos pés e na cauda apertando as patas traseiras ou a cauda. Em seguida, limpe a pele do abdômen com etanol 70%. Use uma pinça para puxar a pele para cima.

Em seguida, faça uma pequena incisão vertical de dois centímetros ao longo da linha média, começando no ponto intermediário entre o terceiro e o quarto par de glândulas mamárias. Tenha cuidado para não danificar a parede abdominal utilizando pinças redondas. Puxe suavemente a cadeia embrionária para longe da cavidade.

Deixe a corrente repousar sobre as toalhetes umedecidos. Comece expondo uma metade do útero. Em seguida, prossiga para a eletroporação dos embriões antes de passar para a outra metade.

Neste procedimento, prepare uma solução de DNA dissolvendo o pellet obtido a partir de um protocolo padrão de purificação tipo maxi prep em água destilada. Em seguida, adicione azul de metileno à solução de DNA numa proporção de um para vinte para permitir a visualização durante a injeção. A seguir, corte a ponta de uma micropipeta previamente puxada com pinça fina, deixando seis milímetros desde o início do ombro até a extremidade da ponta.

Em seguida, carregue a micropipeta com um microlitro de solução de DNA contendo verde rápido para injeção. Segure a cabeça do embrião com pinças redondas. Insira a pipeta no cérebro em um ângulo de 45 graus, direcionando-a para o ventrículo lateral localizado próximo à linha média.

Se a agulha penetrar através do ventrículo, retire lentamente a pipeta. O ventrículo deve ficar verde quando a solução começar a preenchê-lo. Nesse momento, pare de mover a pipeta e injete um microlitro de DNA.

Em seguida, retire suavemente a pipeta. Configure o ECM 3080 para oito pulsos de 45 volts com duração de 50 milissegundos, espaçados por um intervalo inter-pulso de 950 milissegundos. Mergulhe os eletrodos em forma de pá de cinco milímetros em PBS para garantir uma transmissão eficiente da corrente.

Em seguida, posicione as pás do eletrodo ao redor da cabeça do embrião, com uma pá positiva sobre o ventrículo contendo a solução de DNA. Coloque a pá positiva ligeiramente mais baixa que a negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Isso minimizará a expressão ectópica em células parametállicas.

Agora, aplique um pulso pressionando o pedal com o pé uma vez, depois remova os eletrodos e limpe-os. Repita os passos para cada um dos embriões. Após eletroporar todos os embriões.

Despeje três mililitros de PBS na cavidade abdominal e retorne os embriões para a cavidade abdominal. Em seguida, feche a parede abdominal com uma agulha curva e sutura de seda 5-0, e depois a pele. Aplique lidocaína sobre a ferida e administre inicialmente 120 miligramas por quilograma de aspirina para analgesia.

Retire o animal do tubo de anestesia e permita a recuperação sobre uma toalha de papel no aquecedor. Após isso, devolva o animal à gaiola. Mantenha-o no aquecedor a 37 graus Celsius e monitore o estado de saúde.

Neste experimento, os interneurônios eletroporados são delimitados pela expressão de marcadores de subtipos derivados da ECG. Esta imagem mostra que os interneurônios derivados da ECG foram eletroporados com um plasmídeo DLX5/6-EGFP. Esta imagem mostra um interneurônio que expressa VIP no P8.

A expressão de EGFP delimita toda a árvore dendrítica e a arborização axonal de neurônios individuais, e aqui temos um interneurônio que expressa NPY no P8. A expressão de NPY delimita células neurogliformes. Por fim, aqui está um interneurônio que expressa NPY no P15.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em 20 minutos, se executada corretamente. Ao combinar o uso de plasmídeos específicos e linhagens de camundongos geneticamente modificados, é possível obter controle temporal e espacial na expressão de genes de interesse. Em alguns experimentos, utilizamos o plasmídeo A-D-L-X-T-T-A para induzir a expressão de transgenes dependentes de AU.

Nestes experimentos, silenciamos a expressão do transgene administrando doxiciclina.