Subtipo seletivo Eletroporação de Cortical Interneurônios

O objetivo geral deste procedimento é atingir neurônios internos no cérebro de camundongos em desenvolvimento por meio de eletroporação in utero. Isso é feito preparando primeiro as agulhas de injeção. O segundo passo é remover a cadeia embrionária do animal anestesiado.

Em seguida, a injeção de DNA e a eletroporação são realizadas no cérebro. A etapa final é permitir que o animal se recupere da cirurgia. Em última análise, no útero, a eletroporação é usada para permitir o direcionamento seletivo de subtipos de neurônios interneurais.

A vantagem desses métodos de nossas técnicas existentes, é como operação eletro inespecífica no útero, é que ele fornece os meios para realizar a análise autônoma celular de um subconjunto de neurônios intercorticais. Os altos níveis de expressão de GFP permitem a visualização e análise de inter. Este método pode ajudar a responder a questões fundamentais no campo do neurodesenvolvimento, como quais são as regras que regem a integração do amadurecimento inter.

Para iniciar este procedimento, prepare a pipeta de microinjeção puxando um capilar de vidro com um extrator de pipeta. Em seguida, remova cuidadosamente o capilar e colete a agulha inferior para microinjeção. Agora, coloque um camundongo grávida anestesiado com o lado ventral para cima na almofada de aquecimento.

Cubra seus destinos com uma máscara que continuará a fornecer éde flúor durante toda a cirurgia. Em seguida, aplique lubrificante ocular em ambos os olhos. Defina a almofada de aquecimento para 36 graus Celsius para evitar hipotermia depois.

Verifique a ausência de reflexos nos pés e na cauda beliscando as patas traseiras ou a cauda. Em seguida, limpe a pele do abdômen com etanol 70%. Use uma pinça para puxar a pele para cima.

Em seguida, faça uma pequena incisão vertical de dois centímetros ao longo da linha média, começando no meio do caminho entre o terceiro e o quarto pares de glândulas mamárias. Tenha cuidado para não danificar a parede abdominal usando uma pinça redonda. Puxe suavemente a cadeia embrionária para longe da cavidade.

Deixe a corrente descansar sobre os lenços umedecidos. Comece expondo metade do útero. Em seguida, continue para a eletroporação dos embriões antes de passar para a outra metade.

Neste procedimento, prepare a solução de DNA dissolvendo o pellet obtido de um protocolo padrão de purificação maxi prep em água destilada. Em seguida, adicione verde rápido à solução de DNA na proporção de um para 20 para permitir a visualização durante a injeção. Em seguida, corte a ponta de uma micropipeta pré-puxada com uma pinça fina para deixar seis milímetros do início do ombro até o final da ponta.

Em seguida, carregue a micropipeta com um microlitro de solução de DNA com verde rápido para injeção. Segure a cabeça do embrião com uma pinça redonda. Insira a pipeta no cérebro a 45 graus, visando o ventrículo lateral localizado próximo à linha média.

Se a agulha penetrar no ventrículo, retraia lentamente a pipeta. O ventrículo deve ficar verde quando a solução começar a preenchê-lo. Neste ponto, pare de mover a pipeta e injete um microlitro de DNA.

Em seguida, retire a pipeta com cuidado. Defina o ECM oito 30 ator para 5 pulsos de 45 volts de 50 milissegundos espaçados com um intervalo entre pulsos de 950 milissegundos. Mergulhe os eletrodos de pá de cinco milímetros em PBS para garantir uma transmissão de corrente eficiente.

Em seguida, coloque as pás do eletrodo ao redor da cabeça do embrião com uma pá positiva no ventrículo contendo a solução de DNA. Coloque a pá positiva ligeiramente abaixo da negativa para criar uma corrente ventral através das eminências ganglionares. Isso minimizará a expressão ectópica em células parametálicas.

Agora forneça um pulso pressionando o pedal uma vez, remova os eletrodos e limpe-os. Repita as etapas para cada um dos embriões. Depois de eletroperar todos os embriões.

Despeje três mililitros de PBS na cavidade abdominal e devolva os embriões à cavidade abdominal. Em seguida, suture a parede abdominal com uma agulha curva e cinco pontos de seda e, em seguida, a pele. Aplique lidocaína na ferida e administre 120 miligramas por quilograma de aspirina inicialmente para analgesia.

Remova o animal do tubo de anestesia e permita a recuperação na almofada de aquecimento em um lenço de papel. Depois disso, devolva o animal à gaiola. Mantenha-o na almofada de aquecimento a 37 graus Celsius e monitore o estado de saúde.

Neste experimento, os neurônios inter eletroporados são delineados pela expressão de marcadores de subtipo derivados de CGE E. Esta imagem mostra que os neurônios inter derivados de CGE são eletroporados com um plasmídeo DLX cinco seis EGFP. Esta imagem mostra um VIP expressando interneurônio em P oito.

A expressão de EGFP delineia toda a árvore dendrítica e a árvore axonal de neurônios individuais, e aqui está um NPY expressando interneurônio em P oito. A expressão NP y delineia as células da forma da neuroglia. Por último, aqui está um NPY expressando interneurônio em P 15.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 20 minutos se executada corretamente. Ao combinar o uso de plasmídeos específicos e linhagens de camundongos geneticamente modificados, é possível obter controle temporal e especial na expressão de genes de interesse. Em alguns experimentos, usamos o plasmídeo ADL XTA para induzir a expressão de transgenes dependentes de AU.

Nesses experimentos, silenciamos a expressão do transgene administrando doxiciclina.