Name: Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Aprenda a cultivar células-tronco pluripotentes humanas em monocamada usando inibidores de Rho-associated kinase e laminina 521. Este método produz grandes quantidades de células homogêneas para manipulação genética e descoberta de fármacos.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ronald D. McKay por sua discussão e comentários sobre este projeto.

Base de uma única célula não-colônia tipo monocamada (NCM) cultura de hPSCs. 1. Preparações <ol><li> Adicione 500 ml de meio de cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs): meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,1 e aminoácidos não essenciais (NEAA) mM. </li><li> Isolar fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) derivadas a partir da estirpe CF1, seguindo um protocolo de rotina 16 e MEFs cultura em 0,1% de 6 cavidades da placa de cultura de células revestidas com gelatina, em meio DMEM. Como alternativa, comprar ações do MEF na passagem 3 a partir de recursos comerciais. </li><li> Prepare placas Matrigel. <ol><li> Dilui-se 5 ml de estoque de Matrigel hESC qualificado com 5 ml de meio DMEM/F12 (arrefecida a ~ 4 ° C) e armazenar até 50% em alíquotas de um congelador de -20 ° C. Descongelar o estoque de Matrigel congelado no frigorífico (~ 4 ° C) O / N e dilui-se ainda mais o Matrigel em meio DMEM/F12 fria (para dar origem a uma concentração de trabalho de 2,5%). </li><li&gt; O revestimento 6 placas de cultura de células com 1,5 ml de 2,5% de Matrigel por poço, armazenar as placas revestidas em frigorífico S / N (Nota: utilizar a placa de Matrigel-revestido dentro de 2 semanas). </li><li> Remova a placa de Matrigel da geladeira, deixe a placa para aquecer à temperatura ambiente na capa de cultura de células de 10 a 30 min (Nota: não aquecer a placa em uma incubadora de cultura de células) e aspirado DMEM meio antes de chapeamento hPSCs. </li></ol></li><li> Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: 80% de meio de DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 0,1 mM β-mercaptoetanol, e 4 ng / ml de FGF-2. </li><li> Preparar 10 ml de meio de congelação 2x HPSC: 60% de FBS, 20% de DMSO, e 20 uM Y-27632 em meio mTeSR1, esterilizar por filtração, e de usar o meio dentro de 1 semana. </li></ol> 2. Protocolo 1 (Básico): Crescer HPSC colônias em Alimentadores <ol><li> Use números de passagem MEF a 5 ou 6 (designado como p5 e p6) para cultura HPSC, a fim de obter resul consistentets. Mitoticamente inactivar MEFs por tratamento das células com 10 ug / ml de mitomicina C, durante 3 horas a 37 ° C, lavar as células 3x com fosfato tamponado salino da 1X Dulbecco (STP-D), e, em seguida, se dissociam MEFs com 0,05% de tripsina em 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a uma dose de 8000 rads com um irradiador de raios-X. </li><li> Conte o número de células utilizando o método de exclusão com Trypan Blue mancha sob microscópio. Como alternativa, use um contador automático de células. </li><li> Placa MEFs irradiados em placas de poliestireno de 6 poços revestidos com gelatina a 0,1% a uma densidade de 1,88 x 10 5 células por poço (ou seja, 1,96 x 10 4 células / cm 2). Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Remova o meio de cultura MEF por aspiração com uma pipeta de Pasteur (Nota: não as etapas de lavagem necessárias neste momento). </li><li> Colônias Triturar HPSC da cultura anterior em pequenos pedaços, examinar os aglomerados sob microscópio para garantir que seus tamanhos que variam from 50 a 100 mM, em diâmetros, e placa aglomerados HPSC sobre o topo das camadas alimentadoras MEF num poço contendo 2 ml de meio HPSC. </li><li> Mude hESC média diária de 3 a 5 dias, a registro o crescimento da colônia por fotografia, marque qualquer colônias morfologicamente alterados ou diferenciadas (~ 5%), e remover manualmente as colônias marcadas pela suavemente aspiração com uma pipeta Pasteur. </li><li> Lavar as colónias remanescentes no MEFs duas vezes (2 min cada com D-PBS), e incuba-se as colónias, com 2 ml de 1 mg / ml de colagenase IV em meio HPSC por 10 a 30 min), e analisar o desprendimento de colónias do HPSC superfície MEF-revestido (Nota: use um raspador para ajudar o processo de desapego somente se as colônias são fortemente ligado à placa). </li><li> Adicionar 5 ml de meio HPSC a cada poço para minimizar reações enzimáticas, colônias de transferência para um tubo de 15 ml, permitir colônias HPSC para sedimentar por 3 a 5 minutos à temperatura ambiente, e garantir a sedimentação de colônias por visualização direta do cells na parte inferior do tubo (Nota: não se centrifugar o tubo nesta fase). </li><li> Retire os sobrenadantes contendo MEFs residuais e dissociado células individuais, voltar a suspender as colônias com 5 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas, e repita o passo sedimentação duas vezes. </li><li> Retire as médias, colônias HPSC triturar em pequenos pedaços, loja em 1X HPSC congelamento médio (ou CryoStore CS10 meio de congelamento) para criopreservação (1 confluente bem por frasco congelado) ou placa em uma placa de 6 poços para passaging celular. </li></ol> 3 Protocolo 2:. Converter HPSC Colônias de Alimentadores para NCM <ol><li> Lavar peletes HPSC em D-PBS, uma vez, incuba-se as peletes com 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, e examinar a reacção enzimática sob um microscópio para assegurar a dissociação de uma única célula. </li><li> Encerrar as reacções enzimáticas por ressuspensão suave das células em 5 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, seguido por centrifugação a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min(Nota, não use força excessiva de centrifugação, que causam danos às células). </li><li> Adicionar 5 ml de meio mTeSR1 ao sedimento, ressuspender o sedimento de células individuais, e filtro de células dissociadas através de um filtro de células de 40 mM (para remover quaisquer agregados celulares residuais). </li><li> Semente 1,3-2 x 10 6 para um poço hPSCs (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2) de uma placa de 6 poços revestidas com 2,5% de células estaminais embrionárias humanas qualificado Matrigel, adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml, e incluem 10 uM Y-27632 no meio (para facilitar o plaqueamento inicial de 24 horas de uma única célula). Em alternativa, utilizar os seguintes pequenas moléculas para substituir 10 mM Y-27632 para melhorar chapeamento de uma única célula: 1 PM Y-39983 (ROCK I inibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inibidor ROCHA II), 1 PM thiazovivin (um novo inibidor ROCK) , e 2 uM inibidor de JAK 1. </li><li> Substitua o meio com meio mTeSR1 livre de drogas no dia seguinte (dentro de 24 horas), dissociar as células de um adicionalbem, e contagem do número de células para determinar a eficiência de uma única célula de revestimento (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de uma única célula plaqueamento eficiência que podem ser alcançados nesta fase). </li><li> Permitir que as células a crescer como uma única formada de células em monocamada durante alguns dias com 3 ml de meio mTeSR1. Mude média diária. </li><li> Empiricamente determina o ritmo de passaging adaptado NCM, dependendo da densidade celular. Passagem, quando o crescimento celular atinge confluência no dia 3 ou dia 4, ou no ponto de tempo de 4 horas após o desaparecimento das fronteiras da célula-a-célula. Dissociar as células em 1 ml de Accutase, utilizar uma proporção de 1 a 3 desdobramento (isto é, uma bem confluente de células plaqueadas em 3 cavidades de placa de 6 poços) para passagens em células e estabilizar adaptado NCM por 5 passagens. </li><li> Congelamento celular <ol><li> Utilizar um bem confluentes (5-6 x 10 ~ 6 células) para um frasco congelado: dissociar as células confluentes de uma bem com 1 mL de Accutase durante 10 min. </li><li> Diluir wom 5 ml de células em meio de centrifugação e mTeSR1 como descritos acima. </li><li> Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio mTeSR1 e, em seguida, adiciona-se lentamente 500 ul de 2X HPSC meio de congelação (contendo 20 ^ M Y-27632) em um frasco de criopreservação. Alternativamente, ressuspender as células em 1X HPSC meio de congelamento contendo inibidor 2 uM JAK 1 ou meio 1X CryoStor CS10, na presença de 10 uM ou Y-27632 ou 2 fiM inibidor de JAK 1. </li><li> Colocar os frascos congelados em um cryocontainer gelo-refrigeradas (inferior preenchido com isopranol) e transferir o cryocontainer para um congelador de -80 ° C imediatamente. </li><li> Transferência de células do freezer -80 ° C para um tanque de nitrogênio líquido (no dia seguinte) para a criopreservação de longo prazo. </li></ol></li><li> Descongelamento celular <ol><li> Utilize um frasco de criopreservação para chapeamento um poço de uma placa de 6 poços. </li><li> Meio de pré-aquecer mTeSR1 em um banho de água a 37 ° C durante 10 min, as células descongelamento no mesmo banho de água durante 2 minutos,gota a gota para adicionar as células 5 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido contendo 10 uM Y-27632, e centrifuga-se como descrito acima. </li><li> Suavemente ressuspender as pelotas de células com 2 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632 e lentamente transferir células de um poço de pré-revestidas com Matrigel (Nota: evitar a produção de bolhas de ar). </li><li> Mude médio diário e esperam que o crescimento HPSC para alcançar confluência no dia 3 ou 4. </li></ol></li></ol> 4 Protocolo 3:. Converter HPSC colônias em Matrigel a NCM Cultura <ol><li> Retirar uma placa revestida de Matrigel do frigorífico, colocar a placa na cultura capa de tecido, durante 10 a 30 minutos, remover o meio de cada poço da placa, e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido a cada poço. </li><li> Transferência triturado aglomerados HPSC da cultura alimentador (Passo 2.10 do protocolo de base) para a placa de Matrigel acima. Adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml de volume final em cada poço. </li><li> Alterar média diária durante 3 a 4 diass até colónias atingir 80 a 90% de confluência. </li><li> Para passagens em células: enxaguar as colónias com D-PBS, duas vezes, o tratamento de células com 1 ml de 2 mg / ml de dispase a 37 ° C durante 15 a 20 min, e de sedimento e de passagem de células como aglomerados. </li><li> Para a cultura NCM: repita os passos 3,1-3,9 definido no protocolo 2. </li></ol> 5 Protocolo 4:. NCM Cultura da hPSCs no LN-521 <ol><li> Descongelar o recombinante LN-521 solução, a 4 ° C, antes do dia da utilização e fazer a solução de revestimento de laminina (LCS), diluindo a laminina descongelado com 1X D-PBS (contendo Ca 2 + / Mg 2 +) para uma concentração final de 10 ug / ml. </li><li> Adicionar 1 ml da LCS a um bem em 6 bem-placa (nota: evitar a seco durante o processo de revestimento). </li><li> Selar a placa revestida com Parafilm para evitar a evaporação e armazenar o prato na geladeira (4 ° C) O / N (nota: use a placa dentro de 1 semana). </li><li> Remova cuidadosamente os LCS com uma pipeta de Pasteur, sem auching a superfície revestida e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 para um poço. </li><li> Aquecer todas as soluções de cultura (incluindo D-PBS) em um banho de água a 37 ° C durante 25 min. </li><li> Converta colônias HPSC para NCM <ol><li> Dissociar agregados celulares de células individuais com Accutase conforme descrito no protocolo 2. </li><li> Semente 1,3-2 x 10 6 hPSCs em um LN-521-revestido bem (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2), sem a presença de inibidores de rock. </li><li> Alterar média diária durante 3 a 4 dias. </li><li> Dissociar as células em 1 ml de Accutase no dia 3 ou 4 para a próxima passagem em células usando um 1 a 3 razão de divisão. </li></ol></li></ol> . 6 Protocolo 5: NCM Cultura para plasmídeo DNA transfecção <ol><li> Adaptar colónias HPSC a cultura NCM tal como descrito em Protocolos 2 e 4. </li><li> Placa dissociado hPSCs em 12 poços da placa com uma densidade de células de 7,5 x 10 5 células / poço em meio mTeSR1 na presença de 10 uM Y-27632. </li><li> Substituir médio mTeSR1 com meio mTeSR1 livre de drogas entre 4-8 horas após o plaqueamento das células. </li><li> Para cada transfecção, diluir 2,5 ug de plasmídeos de expressão (por exemplo, pmaxGFP) e 5 ul de Lipofectamina 2000 em tubos Eppendorf separados em 125 ul de cada um de Opti-MEM. </li><li> Após 5 min, misturar os reagentes e incubar diluídos durante 20 min a temperatura ambiente (de modo a formar complexos de transfecção). </li><li> Adicionar os complexos de transfecção 250 ul a cada poço contendo hPSCs em 1 ml de meio mTeSR1 e incuba-se as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 horas. </li><li> Examinar a eficácia de transfecção com um microscópio de fluorescência e fotografia aleatoriamente para o cálculo da eficiência de transfecção real. </li></ol> . 7 Protocolo 6: NCM Cultura para transfecção de MicroRNAs <ol><li> Dissociar hPSCs semi-confluentes no dia 2, em condições NCM, adicionando 1 ml de Accutase por poço em 6<html> Bem-placa. </li><li> Adicionar 10 ml de meio mTeSR1 para diluir as reacções enzimáticas e centrifugar a 200 xg durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento de células com meio mTeSR1, semear as células a uma densidade de 7,5 x 10 5 células por poço numa placa de 12 poços em meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, e permitir que as células aderir durante 4 h. </li><li> Substitua o meio com meio Y27632-livre mTeSR1. </li><li> Use comercialmente disponível microRNAs (por exemplo, um miRIDIAN miRNA transfecção de controle não-alvo marcado com Dy547). Titula-se concentrações na gama 0-160 nM usando os reagentes fornecidos e seguir as instruções dos fabricantes. </li><li> Optimizar a eficiência de transfecção para cada concentração em linhas HPSC pela imagem da fluorescência Dy547 das células vivas em um microscópio às 24 h após a transfecção. </li><li> Calcular as eficiências de transfecção com base no percentual de células positivas Dy547 sobre todas as células com imagens. </li></ol>. tle &quot;&gt; 8 Protocolo 7: Cultura NCM para a transdução de Lentivirus Vector <ol><li> Repita os passos 7.1 a 7.4 do Protocolo 6. </li><li> Calcular as quantidades de partículas virais a serem utilizadas para a transdução de: usar o seguinte fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, enquanto TU indica o número total de unidades de transformação, MOI é igual à multiplicidade desejada de infecção no poço (ou MOI TU / célula), CN especifica o número de células em cada poço, e VT indica os títulos virais de estoque (TU / mL). Por exemplo, uma vez que os títulos virais de imagens SMART-shRNA vector é igual a 1 x 10 9 TU / ml (unidades de transformação por ml), 7,5 x 10 5 células por poço, no tempo de transdução, e esperada uma MOI de 20: 15 de usar mL das partículas virais de ações para cada poço (nota: esta condição é recomendado para indução lentiviral transitória). </li><li> Pré-quentes de 300 ul de meio mTeSR1 com 10 mg / ml de polibreno durante 30 min. </li><li> Adicionar 15 mL de partículas virais de ações emo meio mTeSR1 pré-aquecido contendo polibrene e misture delicadamente a solução. </li><li> Substituir o meio de cultura de células com 300 ul de meio pré-aquecido contendo as partículas virais. </li><li> Após 4 horas de incubação, examinar turboGFP fluorescência (um fabricante de expressão shRNA) para determinar a eficiência de transdução. </li><li> Adicionar 300 mL de meio mTeSR1 adicional para a transdução bem quando as células começam a expressar turboGFP. </li><li> Após 12-16 horas de incubação, reexaminar expressão turbo-GFP. </li><li> Realizar experimentos de acompanhamento desejados com essas células transduzidas dentro de 72 horas. </li></ol>

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<li>Domogatskaya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).</li>
<li>Liew, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells+in+serum+and+feeder-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media.</a> Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).</li>
<li>Braam, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+genetic+manipulation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 5, 389-392 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Há duas formas principais de se hPSCs cultura in vitro: cultura convencional do tipo colônia (de células em alimentadores ou matrizes extracelulares) e cultura de suspensão de hPSCs como agregados sem alimentadores 6. As limitações de ambos do tipo colônia e suspensão métodos de cultura incluem heterogeneidade acumulada e mudanças epigenéticas herdadas. Cultura NCM, com base em ambos passaging de uma única célula e plaqueamento de células de alta densidade, representa um novo método para a cultura HP...

A capacidade de se diferenciar em direção hPSCs tecidos adultos multilinhagem abriu novos caminhos para o tratamento de pacientes que sofrem de doenças graves que envolvem cardiovascular, hepática, pâncreas, e sistemas neurológicos 1-4. Vários tipos de células derivadas de hPSCs também fornecem plataformas celulares robustos para modelagem de doenças, a engenharia genética, a seleção da droga, e 1,4 testes toxicológicos. A questão-chave que garante suas aplicações clínicas e farmacológicas futuras é a geração de um grande número de hPSCs clínica de grau através de cultura in vitro de células. No entanto, sistemas de cultivo atuais são insuficientes ou inerentemente variável, envolvendo várias culturas alimentadoras e sem alimentador de hPSCs como colônias 5,6. Crescimento do tipo colônia de ações hPSCs muitas características estruturais da massa celular interna (ICM) de embriões de mamíferos adiantados. A ICM é propenso a diferenciar-se em três camadas germinativasnum ambiente multicelular, devido à existência de gradientes de sinalização heterogéneos. Assim, a aquisição de heterogeneidade no desenvolvimento embrionário precoce é considerado como um processo necessário para a diferenciação, mas uma característica indesejável de cultura HPSC. A heterogeneidade na cultura HPSC é muitas vezes induzida por sinais apoptóticos excessivas e diferenciação espontânea devido a condições de crescimento abaixo do ideal. Assim, no tipo de colónia de cultura, as células heterogéneas são frequentemente observados na periferia das colónias 7,8. Foi também mostrado que as células em células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) colónias respostas diferenciais exposição a moléculas de sinalização, tais como BMP-4 9. Além disso, métodos de cultura colônia produzir colheitas de células baixas, bem como as taxas de recuperação muito baixo de células de criopreservação, devido às taxas de crescimento incontrolável e sinalização apoptótica vias 6,9. Nos últimos anos, várias culturas de suspensão têm sido desenvolvidos para hPSCs de cultura, particulArly para a expansão de grandes quantidades de hPSCs dentro e alimentadoras condições livres de matriz 6,10-13. Obviamente, os diferentes sistemas de cultura tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Em geral, a natureza heterogénea de hPSCs representa um dos principais inconvenientes da colónia de tipo e de cultura de agregados, que são métodos para a entrega de materiais de sub-óptima de DNA e de RNA em hPSCs por engenharia genética 6. Claramente, há uma necessidade imperiosa de desenvolver novos sistemas que evitam algumas deficiências dos métodos de cultura atual. As descobertas de inibidores de pequenas moléculas (como o inibidor ROCHA Y-27632 e JAK inibidor 1) que melhoram a sobrevivência de uma única célula pavimentar o caminho para a cultura dissociada-HPSC 14,15. Com a utilização destas moléculas pequenas, que desenvolveram recentemente um método de cultura de tipo não-colónia (NCM) crescimento de dissociar-hPSCs 9. Este método de cultura novela combina passaging de uma única célula e de alta densidadechapeamento de métodos, o que nos permite produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneas sob ciclos de crescimento consistente, sem grandes anormalidades cromossômicas 9. Alternativamente, a cultura NCM pode ser implementado com diferentes moléculas pequenas e matrizes definidas (como as lamininas), a fim de optimizar o processo de cultura de amplas aplicações. Aqui, apresentamos vários protocolos detalhados com base na cultura NCM e delinear procedimentos detalhados para a engenharia genética. Para demonstrar a versatilidade de protocolos NCM, também testamos cultura NCM com inibidores ROCHA diversas e com a única isoforma laminina 521 (ou seja, LN-521).

<table><tbody><tr><td>Contador de celular automatizado Countess</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Contagem automática de células</td></tr><tr><td>Faxitron Gabinete Sistema de raios-X</td><td>Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL&nbsp;</td><td>Modelo RX-650</td><td>Irradiação de raios-X de MEFs</td></tr><tr><td>MULTIWELL Placas de 6 poços</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>353046</td><td>Placas de poliestireno</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11965&ndash; 092</td><td>Para o meio MEF</td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>107409</td><td>inibidor mitótico</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>25300-054</td><td>Para dissociação MEF</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11330&ndash; 032</td><td>Para hPSC medium</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium&nbsp;</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>31985-062</td><td>Para transfecção de hPSC</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen Inc.</td> inativado por calor.<td>16000&ndash; 044</td><td>Componente do meio MEF</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>10828&ndash; 028</td><td>KSR, Componente do meio hPSC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>14190-144</td><td>D-PBS, livre de Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140- 050</td><td>NEAA, componente do meio hPSC</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>25030&ndash; 081</td><td>Componente do meio hPSC</td></tr><tr><td>mTeSR1 & Suplementos</td><td>StemCell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>TeSR2 sem proteína animal e Suplementos</td><td>StemCell Technologies</td><td>5860</td><td>Meio livre de Xeno</td></tr><tr><td>--mercaptoetanol</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>M7522</td><td>Componente do meio hPSC</td></tr><tr><td> MEF (CF-1) ATCC</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)&nbsp;</td><td>SCRC-1040</td><td>Para cultura alimentadora de hPSCs</td></tr><tr><td>qualificada por hESC Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354277</td><td>Para cultura sem alimentador de hPSCs</td></tr><tr><td>Laminina-521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td>Proteína recombinante humana</td></tr><tr><td>FGF-2 (FGF recombinante, básico)</td> <td>R & D Systems, MN</td><td>223-FB Fator de</td><td>crescimento em meio hPSC</td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>1X solução enzimática mista</td></tr><tr><td>Inibidor de JAK I</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>420099</td><td>Um inibidor de Janus quinase</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>EMD4 Biosciences</td><td>688000</td><td>Inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Stemgent</td><td>04-0012</td><td>Inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Y-39983</td><td>Stemgent</td><td>04-0029</td><td>Inibidor de ROCK I</td></tr><tr><td>Fenilbenzodioxano</td><td>Stemgent</td><td>04-0030</td><td>Inibidor de ROCK II</td></tr><tr><td>Tiazovivina</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>Um novo inibidor de ROCK</td></tr><tr><td>BD Falcon Cell Strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352340</td><td>40 &micro; filtro de células m</td></tr><tr><td>Nalgene 5100-0001 Cryo 1 &deg; C</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C6516F-1</td> <td>"Sr. Gelado" Recipiente de congelamento</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>11668-027</td><td>Reagentes de transfecção</td></tr><tr><td>DharmaFECT Duo</td><td>Thermo Scientific</td><td>T-2010-02</td><td>Reagente de transfecção</td></tr><tr><td>MiRIDIANO não direcionado Controle de transfecção de miRNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>IP-004500-01-05</td><td>Marcado com Dy547, para monitorar a entrega de microRNAs&nbsp;</td></tr><tr><td>SMART-shRNA</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>A ser determinado</td><td>Vetor lentiviral</td></tr><tr><td>pmaxGFP</td><td>amaxa Inc (Lonza)</td><td>Incluído em cada kit de transfecção</td><td>Plasmídeo de expressão para controle de transfecção</td></tr><tr><td>Oct-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5279</td><td>Mouse IgG2b, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>SSEA-1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21702</td><td>Mouse IgM, marcador de diferenciação</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21704</td><td>Mouse IgG3, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21705&nbsp;</td><td>IgM de camundongo, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-21706</td><td>Mouse IgM, marcador pluripotente</td></tr><tr><td>CK8 (C51)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8020</td><td>Mouse IgG1, contra citoqueratina 8</td></tr><tr><td>&alfa;-fetoproteína</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8399</td><td>AFP, camundongo IgG2a</td></tr><tr><td>HNF-3&beta; (Pág. 19)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-9187</td><td>FOXA2, anticorpo policlonal de cabra</td></tr><tr><td>Troponina T (Av-1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-295-P0</td><td>Camundongo IgG1</td></tr><tr><td>Desmin</td><td>Thermo Scientific</td><td>RB-9014-P1</td><td>Coelho IgG</td></tr><tr><td>Anti-NANOG</td><td>ReproCELL Inc, Japão</td><td>RCAB0004P-F</td><td>Anticorpo policlonal&nbsp;</td></tr><tr>Proteína <td>ácida fibrilar glial</td> <td>anti-GFAP Zymed</td><td></td><td>13-0300</td></tr><tr><td>Albumina (clone HSA1/25.1.3)</td><td>Cedarlane Laboratories Ltd.</td><td>CL2513A</td><td>Camundongo IgG1</td></tr><tr><td>Actina de músculo liso (clone 1A4)</td><td>DakoCytomation Inc</td><td>IR611/IS611</td><td>Camundongo IgG2a</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon International</td><td>MAB5326</td><td>Coelho anticorpo policlonal</td></tr><tr><td>TUBB3</td><td>Convance Inc</td><td>MMS-435P</td><td>Tuj1, camundongo IgG2a</td></tr><tr><td>HNF4&alfa; (C11F12)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3113</td><td>Anticorpo monoclonal de coelho</td></tr><tr><td>Paraformaldeído (solução)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>PFA, fixador, diluído em D-PBS</td></tr></tbody></table>

culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, manutenção e análise genética

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são uma grande promessa para medicina regenerativa e aplicações biofarmacêuticas. Atualmente, a cultura ideal e a expansão eficiente de grandes quantidades de hPSCs de grau clínico são questões críticas nas terapias baseadas em hPSC. Convencionalmente, as hPSCs são propagadas como colônias em sistemas de cultura alimentadores e livres de alimentadores. No entanto, esses métodos têm várias limitações importantes, incluindo baixos rendimentos celulares e geração de células heterogeneamente diferenciadas. Para melhorar os métodos atuais de cultura de hPSC, desenvolvemos recentemente um novo método, que se baseia na cultura de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Aqui, apresentamos protocolos NCM detalhados baseados no inibidor de quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632. Também fornecemos novas informações sobre a cultura de NCM com diferentes moléculas pequenas, como Y-39983 (inibidor de ROCK I), fenilbenzodioxano (inibidor de ROCK II) e tiazovivina (um novo inibidor de ROCK). Estendemos ainda mais nosso protocolo básico para cultivar hPSCs em proteínas extracelulares definidas, como a isoforma de laminina 521 (LN-521), sem o uso de inibidores de ROCK. Além disso, com base no NCM, demonstramos a transfecção ou transdução eficiente de DNAs de plasmídeo, partículas lentivirais e microRNAs baseados em oligonucleotídeos em hPSCs, a fim de modificar geneticamente essas células para análises moleculares e descoberta de medicamentos. Os métodos baseados em NCM superam as principais deficiências da cultura do tipo colônia e, portanto, podem ser adequados para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneas para futuras terapias clínicas, pesquisa com células-tronco e descoberta de medicamentos.

Um esquema geral da cultura NCM A Figura 1 representa um esquema de cultura NCM típico mostrando as alterações dinâmicas de hPSCs depois de alta densidade de revestimento de uma única célula, na presença do inibidor ROCHA Y-27632. Estas alterações morfológicas incluem ligações intercelulares após o plaqueamento, a formação de agregados celulares e crescimento celular exponencial, seguido por condensação de células (Figura 1A). Uma experiênci...

Aqui, apresentamos protocolos de cultura de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), com base no crescimento de monocamada do tipo não colônia (NCM) de células individuais dissociadas. Este novo método, utilizando inibidores de quinase associados a Rho ou a isoforma de laminina 521 (LN-521), é adequado para produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneos, manipulação genética e descoberta de medicamentos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

alternative-cultures-for-human-pluripotent-stem-cell-production

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo demonstra como manter saudável, indiferenciada-tronco embrionárias humanas (ES) células.

Cultura e Manutenção de células estaminais embrionárias humanas

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Os protocolos descritos permitem que os laboratórios realizem cultura de células-tronco escaláveis e aderentes em alto rendimento com mão de obra, experiência e custo mínimo de investimento em equipamentos usando um robô programável de manuseio de líquidos e placas de 96 poços.  As iPSCs passadas mais de 20 vezes neste sistema mantiveram a pluripotência, cariótipos normais e se diferenciaram em cardiomiócitos.

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Este protocolo fornece uma maneira simples e eficiente de propagar células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando apenas meios condicionados derivados da placenta humana em um prato revestido de gelatina sem suplementação exógena adicional ou substratos sintéticos específicos para hPSC.

A Cultura Modelo Novel para pluripotentes estaminais humanas Propagação celular em gelatina no Media Placenta condicionado

Aqui está um protocolo para cultivar células-tronco pluripotentes (PSC) e células-tronco neurais (NSC) em um sistema de cultura de células fechado que permite máxima esterilidade e reprodutibilidade, substituindo o tradicional gabinete de biossegurança e incubadora. Este equipamento atende às diretrizes de boas práticas clínicas de fabricação (cGMP) e boas práticas clínicas de laboratório (cGLP).

Cultura pluripotentes humanas e células-tronco neurais em um sistema de cultura celular fechado de Pesquisa Básica e pré-clínica

A caracterização regular de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), para verificar a manutenção de seu estado pluripotente, é um passo importante antes que essas células sejam usadas para outras aplicações. Aqui descrevemos um método para a propagação em pequena escala de iPSCs humanas especificamente projetado para permitir sua caracterização fácil e rotineira via imunocitoquímica.

Propagação em pequena escala de iPSCs humano em condições sem soro para a caracterização imunocitoquímica de rotina

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Apresentamos um protocolo para a reversão química, em massa, rápida e eficiente de células-tronco pluripotentes de humana linhagem-aprontadas convencional (hPSC) em um estado de pré-implantação epiblasto como pluripotentes epigenomically-stable ingênuo. Esse método resulta em diminuição da expressao linhagem-aprontadas e melhora acentuada na diferenciação de multilineage direcionada através de um amplo repertório de linhas hPSC convencional.

Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

Para evitar as limitações associadas à passagem enzimática ou mecânica de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) cultivadas em células alimentadoras, estabelecemos um método rápido, eficaz, econômico e de alto rendimento para a colheita de colônias hESC ou hiPSC mantidas em uma camada de células alimentadoras de fibroblastos de prepúcio humano usando desadesão mediada por EDTA.

Passagem rápida, econômica e livre de enzimas de células-tronco pluripotentes humanas em células alimentadoras por adesão mediada pelo ácido etilenodiaminotetracético

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Aprenda a cultivar células-tronco pluripotentes humanas em monocamada usando inibidores de Rho-associated kinase e laminina 521. Este método produz grandes quantidades de células homogêneas para manipulação genética e descoberta de fármacos.

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

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