Name: Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Aprenda a avaliar a angiogênese induzida por fatores secretados por células tumorais usando ensaio de plug de matrigel em camundongos com ultrassom e endomicroscopia. Este método permite analisar densidade e morfologia vascular.

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O laboratório de pesquisa Satchi-Fainaro é parcialmente apoiado pela Associação Internacional de Pesquisa do Câncer (AICR), Fundação Alemão-Israel (GIF), ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (Grant No. 1309/10), Swiss Bridge Award e por doações da Iniciativa Nacional de Nanotecnologia de Israel (INNI), programa Focal Technology Area (FTA): Nanomedicina para Teranósticos Personalizados e pelo Fundo de Pesquisa em Nanotecnologia Leona M. e Harry B. Helmsley.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as normas de Tel Aviv University Sackler School of Medicine Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). 1. Preparação de meio condicionado <ol><li> Semente de 2 x 10 6 U-87 células MG em uma placa de cultura de 10 centímetros em um volume de 8 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) e solução de penicilina / estreptomicina / nistatina 1%. </li><li> Incubar as células a 37 ° C; 5% de CO 2 até alcançar a confluência completa em 48 horas. </li><li> Usando uma seringa de 10 ml, retirar todo o meio da placa e filtrar através de um filtro de 0,45 um para um tubo de 15 ml. </li><li> Sem lavagem da placa de células, adicionar 1 ml de solução de tripsina (0,25%) e incuba-se. </li><li> Quando todas as células são separadas, inactivar a tripsina usando pelo menos 5 ml de DMEM suplementado com FBS a 10% e uma contagem de células pré-molde. </li><li<html> &gt; Contar o número de células utilizando um hemocitómetro ou outro dispositivo de contagem de células e calcular o número de células de acordo com o método de contagem utilizado. NOTA: Ele vai ser usado mais tarde, a fim de normalizar a concentração CM. </li><li> Transferir o CM a um balão de fundo redondo de vidro e concentra-se sob alto vácuo evaporador rotativo. A fim de acelerar o processo, aumentar a temperatura do banho para 37 ° C, se desejado. Continue até que o CM atinge uma textura pastosa. </li><li> Ressuspender o CM a partir de cada placa de cultura de 400 ul de solução salina. Ao usar mais de uma placa, use volume equivalente. Por exemplo, para duas placas de cultura, 800 ul usar. Usar cada placa para quatro ratinhos. </li><li> A fim de comparar as linhas celulares diferentes tratamentos ou, ajustar o volume de acordo com a proporção de células recebidas no passo 1.6. Por exemplo, se uma placa de células contém mais 1,5x, adicionar 200 ul de solução salina aos 400 ul de pré-existentes. Este será o CM ajustado </li></ol>title &quot;&gt; 2. ECM-mímica Gel plug inoculação em camundongo <ol><li> Antes de inocular o gel ECM-mímica em ratos, preparar os seguintes materiais: <ol><li> -Factores de crescimento reduzida de gel de ECM-mímica livre de fenol (descongelar durante a noite, um dia antes da experiência, a 4 ° C em gelo). </li><li> Barbeador elétrico. </li><li> A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos. </li><li> Ice-frio 1.000 dicas ul estéreis. </li><li> Ice-frio seringa de 1 ml e 27 agulhas G. </li></ol></li><li> Prepare-se para cada rato de um tubo de 1,5 ml Eppendorf contendo 80 ul ajustados CM e manter em gelo. </li><li> Para cada tubo, adicionar 600 ul de crescimento-factores geladas reduzida gel de ECM-mímica livre de fenol que foi descongelada durante a noite a 4 ° C, em gelo. O gel de ECM-mímica é líquido em 4 ° C e solidifica a temperatura corporal; a fim de evitar que o gel de ECM-mímica de solidificação, usar 1000 dicas ul geladas. Misture cuidadosamente tubos sem formar bolhas e manter em gelo. </li><li> Anestesiar 6 semanas de idade BRatinhos ALB / c usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme. </li><li> Raspar a área abdominal dos ratos e desinfetar usando uma paramentação / álcool. </li><li> Usar uma solução fria de 1 ml e uma agulha de seringa de 27 G para injectar o conteúdo do tubo Eppendorf subcutaneamente. Realizar a injecção muito lentamente para evitar a formação de bolhas. Uma vez que todo o volume é administrado, não ejetar a agulha durante vários minutos, até que a solidificação ocorre. </li></ol> 3. Avaliação da ECM-mímica Gel plug vascularização com ultra-som NOTA: Esta parte do protocolo exige conhecimento prévio do funcionamento de um sistema de imagens de ultra-som, ou a assistência de um técnico autorizado. <ol><li> Antes de começar, tem a fmateriais e instrumentos imediata epois: <ol><li> Barbeador elétrico. </li><li> Creme depilatório. </li><li> A cetamina e xilazina em ordem para anestesiar os ratos. </li><li> Microbolhas não-alvo. </li><li> Dispositivo de ativação. </li><li> Sistema de imagem dos EUA, incluindo um 55 MHz 708 sonda e uma micromanipulator aquisição 3D. </li></ol></li><li> Medir vascularização dentro das velas de três semanas após a inoculação: NOTA: No modelo animal U-87 à base de MG, três semanas foi encontrado para representar o ponto de tempo ideal para a imagem latente. Sob diferentes configurações, calibre cinética vascularização a partir de alguns dias após a inoculação de plugs. <ol><li> Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). Confirme anestesia adequada de acordo com o atendimento institucional animais e comissão uso, ou seja, antes do início do experimento. Os animais têm atingido o seu bom plano de anestesia quando eles não respondem mais a uma pitada dedo do pé firme. </li><li> Raspar aárea abdominal dos ratos e tratar com creme depilatório. </li><li> Fixar os ratinhos passivamente na fase do micro-manipulador. </li><li> Usando uma agulha de 30 a G 1 ml seringa contendo soro fisiológico e, colocar a agulha no interior da veia da cauda, ​​fixar firmemente a agulha e solte a seringa. </li><li> Configurar para a sessão de contraste modo 3D de aquisição de imagem: <ol><li> Pressione &quot;3D&quot; para iniciar a fase do motor 3D e posicionar o transdutor no meio da zona de varrimento desejada. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e insira a distância e passo tamanho da digitalização, clique no botão &quot;Scan&quot;. </li><li> Certifique-se de que toda a ficha foi feita a varredura nos dados de imagem em 3D exibidos. Se não, ajuste o transdutor de modo que toda a ficha é visível na digitalização e repita o passo 3.5.2. </li><li> Pressione &quot;Contraste&quot; e empurre a compensação de ganho de tempo (TGC) controles para a esquerda para escurecer a imagem. </li></ol></li><li> Ative as microbolhas usando um mixer frasco que é designated para a activação de microbolhas durante 45 seg. </li><li> Misturar em uma seringa de 1 mL 50 uL de microbolhas com 50 ul de solução salina. </li><li> Substituir a seringa afrouxada contendo solução salina com uma seringa contendo microbolhas activados. Injectar as microbolhas diluído na veia da cauda dos camundongos, aguarde alguns segundos para que as bolhas de atingir um estado de equilíbrio, e, em seguida, adquirir laço cine 3D com contraste do plugue, usando o motor de aquisição em 3D: <ol><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e selecione &quot;Scan&quot; para adquirir imagens de realce 3D e, em seguida, pressione &quot;Cine Store&quot; para salvar os dados de imagem. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; e clique em &quot;Destruir 3D&quot; para destruir as microbolhas. </li><li> Pressione o botão &quot;3D&quot; novamente e selecione &quot;Scan&quot; para adquirir um loop de cine pós-destruição, em seguida, pressione &quot;Cine Store&quot;. </li></ol></li><li> Gerar a sobreposição de quadros de imagem pré e pós-destruição das microbolhas: <ol><li> No &amp;# 8220; Configurações de referência &quot;no lado esquerdo da tela, clique em&quot; Criar de Referência &quot;. </li><li> Pressione &quot;Gestão de Estudo&quot; para abrir o ciclo cine pré-destruição adquirido. </li><li> Clique em &quot;Cine Processo&quot; para gerar a sobreposição contraste verde, em seguida, clique em &quot;carregar em 3D&quot;. </li></ol></li><li> Use o software de imagem dos EUA, a fim de quantificar a imagem 3D, resultando em volume de sangue dentro dos plugues: <ol><li> Pressione &quot;Scan / Freeze&quot; e pressione &quot;Configurações de modo&quot;. </li><li> Clique em &quot;Volume&quot; e selecione &quot;paralelo&quot;. </li><li> Criar um volume 3D do tecido alvo através da segmentação de uma série de contornos. </li><li> Clique em &quot;Finish&quot; para concluir a segmentação. NOTA: O volume do agente de contraste será exibido no lado inferior esquerdo da tela. </li></ol></li><li> No final do procedimento, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe deoutros animais. Fornecer o calor usando uma almofada disponível comercialmente cirúrgico aquecimento ou uma lâmpada incandescente (50-75 watt), colocado 12-14 centímetros de distância do roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente. </li></ol></li></ol> 4. Avaliação de ECM-mímica Gel plug Vasculature Morfologia Usando Fibered confocal Endomicroscopy NOTA: esta parte do protocolo é realizada imediatamente após imaging US e que exige conhecimento prévio de operar o sistema de imagem endomicroscopy confocal desfibrado, ou a assistência de um técnico autorizado. <ol><li> Antes de começar, tem os seguintes materiais e instrumentos prontos: <ol><li> Equipamentos para a cirurgia, como pinças, tesouras e linhas de costura absorvíveis. </li><li> Dextrano FITC-conjugada (70 KDa). </li><li> Soluções de calibração (três tubos, cada um contendo peróxido de hidrogênio, água ou solução fluorescente). </li><li> O sistema de imagem e umasonda adequada para geração de imagens de vasos sanguíneos acordo com o fabricante. </li></ol></li><li> Anestesiar ratos usando cetamina (100 mg / kg) e xilazina (12 mg / kg). </li><li> Administrar iv, através da veia da cauda, ​​a 200 ul de 10 mg / mL de dextrano marcado com FITC. </li><li> Desinfectar a área abdominal usando uma paramentação / álcool e aplique uma pequena incisão de aproximadamente 1 cm da ficha. </li><li> Coloque a sonda endomicroscopy no topo do tampão suavemente, mantendo o bujão intacta. </li><li> Aquisição: <ol><li> Uma vez que a sonda está definido na ficha, pressione &quot;Iniciar a laser&quot;, usando o pedal. A fluorescência deve ser mostrado na tela. </li><li> Adquirir filmes curtos (até 30 segundos) pressionando &#39;Record&#39; no ecrã ou &#39;Select&#39; usando o pedal. </li><li> Entre os filmes, lavar a sonda colocando a ponta em um tubo contendo água. </li><li> Quando terminar, retire a sonda e limpe a ponta com uma ponta de algodão. </li></ol></li><li> Para analisar média vediâmetro SSEL: <ol><li> Clique no ícone &quot;Detectar microvasos&quot; no painel superior para abrir a janela do módulo de detecção de navios. </li><li> Clique em &quot;Preferências&quot; e marcar &quot;o diâmetro dos vasos Mean&quot; na &quot;estatística de interesse&quot; e &quot;Mostrar barras do histograma&quot; no &quot;Modo de exibição&quot;. </li><li> Clique em &quot;Detectar&quot; para exibir as medições selecionadas. </li></ol></li><li> Para analisar a intensidade do sinal fluorescente em áreas adjacentes aos vasos sanguíneos: <ol><li> Clique em &quot;Criar círculo ROI&quot; no painel esquerdo e criar um círculo na área de interesse. </li><li> Clique em &quot;histograma Compute dentro ROI&quot; para calcular os valores relativos a esta região. </li></ol></li></ol> 5. O tratamento pós-procedimento de Ratos <ol><li> No final de cada procedimento de imagem, coloque camundongos em um ambiente acolhedor, limpo, seco e tranquila, longe de outros animais. Fornecer o calor usando um comercialmente-available almofada de aquecimento cirúrgica ou uma lâmpada incandescente (50-75 W), colocado em 12-14 longe de roedor. Monitorar ratos continuamente até manter a postura ereta e andando normalmente. </li><li> Para uma análise mais aprofundada da vascularização &quot;plugs em pontos de tempo adicional, aplicam-se as seguintes condições de recuperação: <ol><li> Suturar a incisão pequena com fios absorvíveis. </li><li> Proporcionar analgesia ratos, tais como buprenorfina (1 mg / kg), por via subcutânea, e de regresso para gaiolas individuais. </li><li> Respeite todos os animais para determinar se a continuação do tratamento analgésico é necessário e re-avaliar diariamente para monitorar e avaliar para a aflição. </li></ol></li><li> No ponto final da experiência, os ratinhos eutanásia por primeiro aplicar isoflurano, seguido por deslocação cervical. </li><li> Se imagens adicionais serão realizadas nas semanas seguintes os passos iniciais de imagem, todos os procedimentos devem ser mantidos tão estéril quanto possível. A paramentação pele deve ser realizada, wa estériltro e algodão estéril pontas devem ser utilizados para limpar a sonda endomicroscopy, e a sonda deve ser desinfectado entre cada animal utilizando água estéril. </li></ol>

<ol><li>Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+SIKVAV+site+of+laminin+in+promotion+of+angiogenesis+and+tumor+growth%3A+an+in+vivo+Matrigel+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model.</a> J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).</li>
<li>Passaniti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+quantitative+method+for+assessing+angiogenesis+and+antiangiogenic+agents+using+reconstituted+basement+membrane%2C+heparin%2C+and+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor.</a> Lab Invest. 67, 519-528 (1992).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+assays%3A+a+critical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis assays: a critical overview.</a> Clin Chem. 49, 32-40 (2003).</li>
<li>Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+estrogen+receptor+gene+prevents+17+beta+estradiol-induced+angiogenesis+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice.</a> Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).</li>
<li>Adini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel+cytometry%3A+a+novel+method+for+quantifying+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo.</a> J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).</li>
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<li>Kuliszewski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+of+endothelial+progenitor+cell+engraftment+using+contrast-enhanced+ultrasound+and+targeted+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles.</a> Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).</li>
<li>Stieger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+assessment+of+angiogenesis+in+a+matrigel+model+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats.</a> Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Manner.+Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent.</a> Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Segal, E., Satchi-Fainaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+development+of+polymer+conjugates+as+anti-angiogenic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).</li>
<li>Satchi-Fainaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+glioblastoma+cells+generating+dormant+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors.</a> PLoS One. 7, 44395(2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Combinando métodos de imagens complementares permite a obtenção de informações sobre os diferentes componentes da angiogênese &#39;microvasos densidade, funcionalidade e morfologia. Carregando CM em tampões de gel ECM-mímica gera um microambiente tumoral, que está separado de outras populações de células, como as células endoteliais, que são recrutados e extravasar para a ficha. Ao realizar, em paralelo, microbolhas de imagem dos EUA com contraste e fibered imaging endomicroscopy confocal, p...

O ensaio de angiogénese bujão matrigel foi descrita pela primeira vez por Kibbey et al., Em 1992, em que foi utilizado para avaliar a estimulação de angiogénese pelo SIKVAV péptido (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. Em contraste com outros ensaios in vivo da angiogénese, como o rato da angiogénese da córnea ou de bico ensaios corioalantóicas de membrana, este ensaio é relativamente fácil de realizar 2. O gel de ECM-mímica injectada pode conter células, pró-angiogénico ou um compostos e / ou factores anti-angiogénicos. Ao avaliar a actividade de um composto anti-angiogénico, o plug normalmente contém uma mistura de factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), e a substância anti-angiogénica pode ser administrada directamente na ficha ou sistemicamente 3, 4. O gel ECM-mímica é injetado por via subcutânea, onde ela se solidifica em poucos minutos. Avaliação do recrutamento dos vasos sanguíneos no tampão resultante é typically realizada por medição dos níveis de hemoglobina dentro do bujão, através da medição do sinal de fluorescência após a injecção de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com dextrano, por imunocoloração dos cortes histológicos para marcadores específicos de endoteliais ou por células activadas por fluorescência (FACS) 2,5, 6. No entanto, essa avaliação só permite a análise de ponto final e não tem informações sobre a funcionalidade e morfologia dos vasos sanguíneos. Além disso, as medições de volume de plasma, ou por níveis de hemoglobina ou utilizando dextrano-FITC como um indicador, uma vez que pode ser enganadora teor de sangue é afectada pelo tamanho dos vasos sanguíneos e a extensão de poças de sangue. Isto é especialmente importante quando a vasculatura recrutados é caracterizada pela permeabilidade aumentada e retenção (EPR) efeito 7. Nós aqui propor um novo, mais preciso, método de visualização dos vasos sanguíneos recrutados pela combinação de duas modalidades de imagem complementares. Higmicrobolhas h resolução com contraste ultra-som (US), combinados com intravital fibred-confocal endomicroscopy podem fornecer informações não só sobre a densidade dos vasos sanguíneos, mas também na sua morfologia e funcionalidade. Além disso, esta análise pode ser realizada em vários pontos de tempo, permitindo assim a monitorização da cinética da angiogénese. EU é uma modalidade de imagiologia largamente usada, que possui uma elevada resolução espacial para imagiologia de vasos sanguíneos, após administração intravenosa (iv) de injecção de microbolhas que permanecem exclusivamente no compartimento vascular 8-11. As microbolhas são microbolhas cheias de gás que produzem um sinal ecogénico forte quando excitado com um impulso dos Estados Unidos e, portanto, servir como um bom agente de contraste. Imagens 3D do plugue são adquiridos usando o software sistema de imagem dos EUA após a destruição microbolhas. As imagens resultantes são compostos a partir de quadros de imagem de pré e pós-destruição das microbolhas e reflecte a diferença em intensidade da cor no vídeo. Estes overlayedas imagens são exibidas automaticamente pelo software. Por conseguinte, a percentagem de vasos funcionais dentro do bujão pode ser quantificada. Alta resolução fibered endomicroscopy confocal serve como uma modalidade de imagem complementares através de relatórios sobre a morfologia dos vasos sanguíneos. Neste método minimamente invasivo, as imagens são adquiridas após a administração iv de dextrano conjugado com FITC 12. O polímero corantes fluorescentes na corrente sanguínea e, portanto, serve como um &quot;agente de contraste&quot; para os vasos sanguíneos morfologia e fluxo sanguíneo. Além disso, uma vez que o polímero é injectado a uma dimensão de 70 kDa, que pode somente cruzar vasos gotejantes como encontrado na vasculatura tumoral. Isto irá resultar em fundo elevado do dextrano marcado com FITC fora dos vasos sanguíneos. Consequentemente, endomicroscopy confocal fibered pode ser usado para visualizar características típicas do efeito EPR em tumor neovasculature- ampliados, de evacuação, os navios altamente emaranhados, com extremidades cegas. Este modelo de sistema foi descricama na comparação do potencial angiogénico de U-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone 13 dormente. Vascularização dentro dos tampões foram avaliados três semanas após a inoculação de gel de ECM-mímica. Foi mostrado que a vascularização dentro tampões contendo CM a partir de U-87 MG de crescimento rápido de células geradoras de tumores foi significativamente aumentada em termos de número, densidade e funcionalidade, quando comparada com a vascularização no interior tampões contendo CM a partir das células geradoras de tumores latentes. Assim, os autores foram capazes de concluir que CM isolado a partir de U-87 MG rápido crescimento células geradoras de tumor contém níveis mais elevados de fatores pró-angiogênicos, em comparação com o CM a partir de células geradoras tumorais inativas. Estes factores de estimular a formação de vasos sanguíneos funcionais que afectam positivamente por todos os passos da cascata angiogénica (ou seja, proliferação, brotamento, migração e finalmente, formação de estruturas tubulares de células endoteliais).

<table><tbody><tr><td>Evaporador rotativo a vácuo</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-Fatores de crescimento reduzidos Matrigel livre de fenol BD</td><td>Bioscience</td><td>FAL356231</td><td>descongelamento durante a noite, a 4 &deg; C no gelo</td></tr><tr><td>Creme depilatório</td> <td>-</td><td>--</td><td></td></tr> <tr><td>Vevo2100 Sistema de imagem dos EUA</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>Requer conhecimento prévio em operação ou a assistência de um técnico autorizado</td></tr><tr><td>55 MHz 708 sonda</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Software de imagem Vevo2100</td><td>VisualSonics Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>VialMix</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>VMIX-DEFINITY</td><td></td></tr> <tr><td>microbubbles</td><td>DEFINITY Imaging</td><td>DE4</td><td>Ative por 45 segundos usando VialMix antes de usar</td></tr><tr><td>CellVizio (endomicroscópio confocal de fibra)</td> <td>Mauna Kea Technologies</td> <td>-</td> <td>Requer conhecimento prévio na operação ou a assistência de um técnico autorizado</td></tr><tr><td>Sonda ProFlex MiniO/30 Mauna</td><td>Kea Tecnologias</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>70 kD dextran marcado com FITC</td> Software <td>Sigma-Aldrich</td><td>46945-ImageCell</td><td></td></tr> <tr><td>Mauna</td><td>Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Kit de calibração</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s medium (DMEM)</td><td>Gibco Life Tecchnologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina/estreptomicina/nistatina</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoramento funcionalidade e morfologia da vasculatura recrutado por fatores secretados por geradores de células tumorais de crescimento rápido

Monitoring Functionality and Morphology of Vasculature Recruited by Factors Secreted by Fast-growing Tumor-generating Cells

O ensaio de tampão de Matrigel subcutânea em ratinhos é um método de escolha para a avaliação in vivo dos factores de pro- e anti-angiogénicos. Neste método, os factores desejados são introduzidos em gel de ECM que imitam a frio de líquido que, após a injecção subcutânea, solidifica para formar um ambiente que imita o meio cancro. Esta matriz permite a penetração das células hospedeiras, tais como células endoteliais, e portanto, a formação de vasculatura. Aqui propomos um novo ensaio de tampão de Matrigel modificado, que pode ser explorada para ilustrar o potencial angiogénico de um conjunto de factores segregados pelas células cancerosas, por oposição a um factor específico (por exemplo, o bFGF e VEGF) ou agente. A ficha contendo gel ECM-mímica é utilizado para introduzir o host (ou seja, mouse) com um pool de fatores secretados para a CM de células de glioblastoma geradoras de tumor de crescimento rápido. Descrevemos previamente uma extensa comparação do potencial angiogénicoU-87 MG de glioblastoma humano e o seu clone de dormente-derivada, neste sistema modelo, que mostra a angiogénese induzida em células U-87 MG parentais. O CM é preparado pela filtragem media recolhidos a partir de placas de cultura de tecido confluente de qualquer linha celular seguintes 48 horas de incubação. Assim, ele contém apenas factores segregados pelas células, sem as próprias células. Aqui descrita é a combinação de duas modalidades de imagiologia, microbolhas de imagiologia de ultra-sons com contraste e intravital endomicroscopy desfibrado-confocal, para, um em tempo real caracterização precisa da extensão, a morfologia e funcionalidade dos vasos sanguíneos recentemente formados dentro das buchas.

Implantar plugs gel ECM-mímica com CM de rápido crescimento linha de células geradoras de tumor angiogênico U-87 MG, resulta em grande angiogênese. Este vasculatura pode ser amplamente explorado utilizando dois métodos de imagem complementares. Microbubbles imaging US contrastado revela grande recrutamento de vasos sanguíneos funcionais no plugue, ilustrando grande fluxo de sangue dentro de U-87 MG CM plugs carregados, em oposição ao fluxo de sangue indetectável dentro fichas contendo CM a p...

Descrevemos um ensaio de tampão matrigel para ilustrar o potencial angiogênico de um conjunto de fatores secretados por células cancerígenas usando duas modalidades de imagem complementares, ultrassom e endomicroscopia. O matrigel, um gel imitador de matriz extracelular (MEC), é utilizado para introduzir o hospedeiro (camundongo) com fatores angiogênicos secretados para o meio condicionado (CM).

Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

The subcutaneous matrigel plug assay in mice is a method of choice for the in vivo evaluation of pro- and anti-angiogenic factors. In this method, desired ...

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar ultrassom e microscopia endoscópica para ilustrar o potencial angiogênico de um conjunto de fatores secretados por células cancerígenas. Isso é alcançado primeiramente implantando-se um plugue para gerar um ambiente semelhante ao tumoral no camundongo, na ausência de células tumorais. Em seguida, avalia-se a densidade de vasos sanguíneos e a porcentagem de vasos sanguíneos funcionais dentro do plugue.No passo final, a morfologia dos vasos sanguíneos é visualizada. Em última instância, o equilíbrio entre os fatores pró e antiangiogênicos secretados pelas células e seus efeitos sobre a angiogênese pode ser avaliado in vitro e in vivo, em diversos pontos temporais, por meio de duas modalidades complementares de imagem. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o ensaio convencional de tampão de matrigel, é que ela permite a análise de um conjunto de fatores secretados pelas células, utilizando simultaneamente modalidades complementares de imagem intravital.Para demonstrar este procedimento, ela será conduzida por F. Andra, estudante de doutorado do meu laboratório. Para utilizar ultrassom na avaliação da vascularização de um gel que mimetiza a matriz extracelular ou ECM, comece colocando um tubo de 1,5 mililitro contendo 80 microlitros de meio condicionado recém-preparado sobre gelo. A parte mais delicada do procedimento é injetar o gel sem bolhas, utilizando ponteiras geladas. Uma mistura suave e uma injeção lenta garantirão uma administração ideal do gel.Em seguida, utilizando ponteiras de 1000 microlitros geladas, misture 600 microlitros de gel de matriz extracelular descongelado mantido a quatro graus Celsius durante a noite no meio, tomando cuidado para não formar bolhas. Após confirmar a sedação por meio do aperto dos dedos dos pés, depile o abdômen de cada camundongo e utilize uma seringa de um mililitro gelada, equipada com uma agulha de 27 graus, para administrar lentamente por via subcutânea.Injete o conteúdo de um tubo de DPH EEND por animal. Após a administração de todo o volume, mantenha a agulha no lugar por vários minutos até que ocorra a solidificação. Três semanas depois, depile novamente a região abdominal dos camundongos, removendo os pelos residuais com creme depilatório, e então posicione os camundongos em posição supina sobre a plataforma do micromanipulador.Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de 30 graus com soro fisiológico. Depois, insira a agulha na veia da cauda. Fixe firmemente a agulha e solte a seringa.Agora coloque o transdutor no centro da área de varredura desejada e clique em 3D para inicializar o estágio motor 3D. Clique em 3D. Novamente, insira a distância de varredura e o tamanho do passo e pressione varredura.Confirme que toda a amostra foi escaneada nos dados de imagem 3D exibidos. Caso contrário, ajuste o transdutor para que toda a amostra fique visível e escaneie a área novamente conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, selecione o contraste e ajuste os controles de compensação de ganho no tempo ou tgc para escurecer a imagem; use um agitador de frascos para ativar as microbolhas durante 45 segundos.Em seguida, misture 50 microlitros das microbolhas com 50 microlitros de solução salina em uma seringa de um mililitro. Substitua a seringa com solução salina solta pela seringa contendo as microbolhas ativadas e injete as microbolhas diluídas na veia da cauda de cada camundongo. Aguarde alguns segundos para que as bolhas alcancem um estado estável e, então, clique em 3D e selecione escanear para adquirir a imagem 3D.Imagens com contraste realçado. Clique em um armazenamento para salvar os dados da imagem e, em seguida, selecione 3D e destrua o 3D. Para destruir as microbolhas, clique em 3D novamente e selecione varredura para adquirir um loop pós-destruição da cena.Em seguida, clique em uma loja vista novamente. Depois, nas configurações de referência, clique em criar referência e, em seguida, selecione gerenciamento de estudo. Para abrir o loop de cena pré-destruição.Agora clique em processar cena para gerar uma sobreposição com contraste verde. Em seguida, selecione carregar em 3D no software de imagem ultrassonográfica. Depois, clique em configurações de modo, clique em volume e selecione paralelo.Em seguida, segmente uma série de contornos para criar um volume tridimensional do tecido-alvo e clique em finalizar para concluir a segmentação. Para utilizar a microscopia endoscópica confocal com fibra óptica no avaliar a morfologia da vasculatura do tampão de gel que mimetiza a MEC, injete 200 microlitros de dextrano marcado com fits C a 10 miligramas por mililitro na veia caudal de cada animal experimental. Em seguida, faça uma pequena incisão aproximadamente um centímetro distante do tampão e posicione suavemente a sonda de microscopia endoscópica sobre o tampão, mantendo-o intacto.Uma vez que a sonda esteja no lugar, use o pedal para pressionar o botão de início do laser. Quando a fluorescência aparecer na tela, pressione selecionar com o pedal para adquirir filmes curtos até 32 segundos de duração. Entre os filmes, lave a ponta da sonda em um tubo contendo água. Quando a filmagem for concluída, limpe a ponta com um cotonete para analisar o diâmetro médio dos vasos.Em seguida, clique em detectar microvasos para abrir a janela do módulo de detecção de vasos e clique em preferências. Certifique-se de que o diâmetro médio dos vasos na estatística de interesse e barras do histograma na janela e no modo de exibição estejam marcados.Clique em detectar para exibir as medições selecionadas. Para analisar a intensidade do sinal fluorescente nas áreas adjacentes aos vasos sanguíneos, selecione criar ROI circular e crie um círculo na área de interesse. Por fim, selecione calcular histograma dentro do ROI para obter os valores relacionados à região circundada.Aqui, o recrutamento extensivo de vasos sanguíneos funcionais dentro de plugs carregados com meio condicionado de U 87 mg é revelado por imagem de ultrassom com contraste baseado em microbolhas. Em contrapartida, nos plugs contendo meio condicionado de células geradoras de tumores dormentes, o fluxo sanguíneo é quase indetectável. A morfologia desses vasos sanguíneos recém-formados é ainda enfatizada pela microscopia endoscópica confocal com fibra óptica dos vasos após a administração de dextrana marcada com fitc, conforme demonstrado nestas imagens representativas; observe como os vasos sanguíneos nos plugs carregados com meio condicionado de U 87 mg exibem uma morfologia típica de vasos dilatados, com extremidades rombas e com vazamento.Os vasos sanguíneos aumentados e altamente emaranhados também demonstram um fluxo não contínuo e lento, e observa-se vazamento de sangue na área circundante, evidenciado pelo alto sinal fluorescente visível fora dos vasos sanguíneos. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em horas em diversos pontos temporais para otimizar a cinética da angiogênese.

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JoVE Journal

Biology

Biologia

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A Matrigel-Based Assay formação do tubo para avaliar a atividade vasculogênica de células tumorais

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

Neste artigo, apresentamos um método para analisar microvasos tumorais in vivo utilizando dinâmica com contraste de fluorescência videomicroscopia. Dois parâmetros quantitativos foram adquiridos: densidade capilar funcional refletindo a vascularização do tumor, e perdas de índice que reflete o vazamento de parede endotelial.

Imagem in vivo da angiogênese tumoral utilizando fluorescência confocal Videomicroscopia

A Novel de alta resolução<em&gt; In vivo</em&gt; Técnica de Imagem para estudar a resposta dinâmica de estruturas intracranianas ao crescimento do tumor e Terapêutica

Usando camundongos repórteres transgênicos e marcadores fluorescentes injetáveis, a microscopia confocal de disco giratório intravital de longo prazo permite a visualização direta do comportamento das células mielóides no adenoma intestinal no modelo de câncer colorretal ApcMin / +.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics Apc Min / + Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Os monócitos são importantes mediadores de arteriogenesis no contexto da doença arterial periférica. Usando uma membrana basal, como matriz e microscopia intravital, este protocolo investiga monócito homing e relacionados ao tumor angiogênese após injeção de monócitos no modelo murino de ligadura de artéria femoral.

Microscopia intravital de monócitos Homing e angiogênese relacionados ao Tumor em um modelo murino de Doença Arterial periférica

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.

Estabelecimento simples de um nicho osteogênico vascularizado da medula óssea usando hidrogéis pré-moldados de poli(etilenoglicol) (PEG) em uma microplaca de imagem

Este protocolo apresenta um modelo tumor-on-a-chip fisiologicamente relevante para realizar pesquisa básica e translacional de câncer humano de alto rendimento, rastreamento avançado de drogas, modelagem de doenças e abordagens de medicina personalizada com uma descrição de procedimentos de carregamento, manutenção e avaliação.

Estabelecendo um Modelo Fisiológico de Microtumor Vascularizado Humano para Pesquisa em Câncer

Aprenda a avaliar a angiogênese induzida por fatores secretados por células tumorais usando ensaio de plug de matrigel em camundongos com ultrassom e endomicroscopia. Este método permite analisar densidade e morfologia vascular.

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Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

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