Monitoramento Funcionalidade e Morfologia da vasculatura Recrutado por fatores secretados por geradores de Células Tumorais de crescimento rápido

O objetivo geral do experimento a seguir é usar ultrassom e microscopia endogênica para ilustrar o potencial angiogênico de um conjunto de fatores secretados por células cancerígenas. Isso é conseguido implantando primeiro um plugue para gerar um ambiente semelhante a um tumor no camundongo na ausência de células tumorais. Em seguida, a densidade dos vasos sanguíneos e a porcentagem dos vasos sanguíneos funcionais dentro do tampão são avaliados.

Na etapa final, a morfologia dos vasos sanguíneos é visualizada. Em última análise, o equilíbrio entre os fatores pró e antiangiogênicos secretados pelas células e seus efeitos na angiogênese pode ser avaliado em, vitalmente e em vários momentos pelas duas modalidades complementares de imagem. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio convencional de tampão matrigel, é que ela permite a análise de um conjunto de fatores secretados pelas células, utilizando modalidades complementares de imagem intravital.

Demonstrando este procedimento será ela correu F Andra alunos de doutorado do meu laboratório Para usar o ultrassom para avaliar a matriz extracelular ou a vascularização do plugue de gel imitador da MEC, comece colocando um tubo einor de 1,5 mililitro contendo 80 microlitros de meio condicionado recém-preparado no gelo. A parte mais complicada do procedimento é injetar o gel sem bolhas usando pontas geladas. A mistura suave e uma injeção lenta garantirão uma administração ideal do gel.

Em seguida, usando pontas geladas de 1000 microlitros, misture 600 microlitros de gelada a quatro graus Celsius durante a noite. ECM descongelado imita gel na mídia tomando cuidado para não formar bolhas. Depois de confirmar a sedação por pinça do dedo do pé, raspe o abdômen de cada camundongo e use uma seringa gelada de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 27 para lentamente por via subcutânea.

Injete o conteúdo de um tubo EEND DPH por animal. Uma vez que todo o volume é administrado, segure a agulha no lugar por vários minutos até que ocorra a solidificação. Três semanas depois, raspe a área abdominal dos camundongos novamente, removendo qualquer pêlo extra com creme depilatório e, em seguida, fixe os camundongos em decúbito dorsal no estágio do micromanipulador.

Em seguida, encha uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 30 com solução salina. Em seguida, coloque a agulha dentro da veia da cauda. Fixe a agulha com firmeza e solte a seringa.

Agora coloque o transdutor no meio da área de varredura desejada e clique em 3D para inicializar o motor 3D stage. Clique em 3D. Novamente, insira a distância de varredura e o tamanho do passo e pressione digitalizar.

Confirme se todo o plugue foi digitalizado nos dados da imagem 3D exibidos. Caso contrário, ajuste o transdutor para que todo o plugue fique visível e escaneie a área novamente conforme demonstrado. Em seguida, selecione o contraste e ajuste a compensação de ganho de tempo ou os controles tgc para escurecer a imagem, use um misturador de frascos para ativar as microbolhas por 45 segundos.

Em seguida, misture 50 microlitros das microbolhas com 50 microlitros de solução salina em uma seringa de um mililitro. Substitua a solução salina contendo a seringa solta pela seringa contendo as microbolhas ativadas e injete as microbolhas diluídas na veia da cauda de cada camundongo. Aguarde alguns segundos para que as bolhas atinjam um estado estacionário e, em seguida, clique em 3D e selecione digitalizar para adquirir 3D.

Imagens com contraste aprimorado. Clique em visto uma loja para salvar os dados da imagem e, em seguida, selecione 3D e destrua 3D. Para destruir as microbolhas, clique em 3D novamente e selecione digitalizar para adquirir um loop de cena pós-destruição.

Em seguida, clique em ver uma loja novamente. Em seguida, nas configurações de referência, clique em criar referência e selecione gerenciamento de estudo. Para abrir o loop de cena pré-destruição.

Agora clique na cena do processo para gerar uma sobreposição de contraste verde. Em seguida, selecione carregar em 3D no software de imagem de ultrassom. Em seguida, clique em configurações de modo, clique em volume e selecione paralelo.

Em seguida, segmente uma série de contornos para criar um volume 3D do tecido alvo e clique em concluir para concluir a segmentação. Para usar a microscopia endo confocal com fibras para avaliar a morfologia da vasculatura do tampão de gel imitador de ECM, injete 200 microlitros de 10 miligramas por mililitro, ajustes de dextrano marcado com C na veia da cauda de cada animal experimental. Em seguida, aplique uma pequena incisão a aproximadamente um centímetro do plugue e coloque a sonda de microscopia endo suavemente em cima do plugue, mantendo o plugue intacto.

Quando a sonda estiver no lugar, use o pedal para pressionar o laser de partida. Assim que a fluorescência aparecer no ecrã, prima selecionar com o pedal para obter filmes curtos até 32 longos entre filmes, lave a ponta da sonda num tubo com água. Quando a filmagem terminar, limpe a ponta com um cotonete para analisar o diâmetro médio do vaso.

Em seguida, clique em detectar micro vasos para abrir a janela do módulo de detecção de vasos e clique em preferências. Certifique-se de que o diâmetro médio do vaso na estatística de interesse. As barras de histograma de janela e exibição no modo de exibição são marcadas.

Clique em detectar para exibir as medidas selecionadas. Para analisar a intensidade do sinal fluorescente nas áreas adjacentes aos vasos sanguíneos, selecione criar ROI do círculo e criar um círculo na área de interesse. Por fim, selecione calcular histograma no ROI para calcular os valores relacionados à região circulada.

Aqui, o extenso recrutamento de vasos sanguíneos funcionais dentro de tampões de carga média condicionados com U 87 mg é revelado por imagens de ultrassom aprimoradas com contraste de microbolhas. Por outro lado, dentro dos plugues contendo meio condicionado de células geradoras de tumor dormentes, o fluxo sanguíneo é quase indetectável. A morfologia desses vasos sanguíneos recém-formados é ainda mais enfatizada pela microscopia endo confocal fibrosa dos vasos após a administração de dextrano fit c, conforme demonstrado nessas imagens representativas, observe como os vasos sanguíneos dentro dos tampões carregados com o meio condicionado com U 87 mg exibem uma morfologia típica de vaso aumentado com vazamento e extremidade.

Os vasos sanguíneos aumentados e altamente emaranhados também demonstram um fluxo não contínuo e lento e o vazamento de sangue é observado na área circundante, bem como evidenciado pelo alto sinal fluorescente evidente fora dos vasos sanguíneos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em horas em vários momentos para otimizar a cinética da angiogênese.