Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar onde um determinado gene é expresso dentro de um embrião intacto. Isso é alcançado fixando o RNA para ser localizado no local dentro do embrião como um segundo passo. Uma sonda de RNA antissenso específica para o gene de interesse é hibridizada com o RNA alvo dentro do embrião.

Esta sonda contém um epítopo, geralmente digoxigenina, que pode ser posteriormente detectado. Em seguida, um anticorpo conjugado à fosfatase alcalina é hibridizado ao epítopo na sonda de RNA, seguido pelo uso de uma coloração colorimétrica. Para visualizar onde o RNA está localizado dentro do embrião, são obtidos resultados que mostram com precisão onde o gene de interesse é expresso, com base na reação cor e no conhecimento da anatomia do embrião.

A principal vantagem do nosso protocolo em relação aos protocolos existentes é que ele é mais rápido e utiliza menos reagentes, sem perda aparente de qualidade. Este método pode responder perguntas fundamentais na embriologia, como a especificação e o padrão de formação dos tecidos. Embora este método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de opus, ele também pode ser usado para muitos outros embriões pequenos, como embriões de peixe-zebra e embriões precoces de camundongo.

Começamos a desenvolver esses métodos inicialmente porque os métodos originais demandavam muito tempo, e passamos a experimentar a omissão das etapas de Ed para aumentar a eficiência do procedimento sem comprometer a qualidade. A fixação de embriões é realizada em etapas. Primeiro, prepare os frascos de vidro que serão utilizados em todas as etapas, incluindo o armazenamento final dos embriões, para permitir o monitoramento dos embriões durante todas as fases do processo.

Utilize frascos transparentes com vedação de teflon adequada na tampa e rotule os frascos com as informações experimentais apropriadas usando uma caneta permanente. Cubra a etiqueta com fita transparente para evitar a perda da identificação ao longo do procedimento. Devido ao uso de álcoois e outros solventes, prepare a solução de fixação MFA conforme descrito no texto do protocolo.

Encha cada vial de vidro rotulado com três a quatro mililitros da solução MFA. Armazene uma solução de 100% metanol a menos 20 graus Celsius. Prepare uma pipeta de vidro cortada e use-a para transferir os embriões para os vials de vidro contendo solução Memphis para fixação.

Adicione os embriões com o mínimo de transferência de líquido proveniente do meio embrionário. Fixe não mais do que 20 a 30 embriões por frasco. Deixe os embriões em solução de Memphis por duas horas à temperatura ambiente em um agitador rotativo.

Após a conclusão da fixação com paraformaldeído, substitua a solução de Memphis por aproximadamente quatro mililitros de metanol a 100% a menos 20 graus Celsius para armazenamento dos embriões antes de montar a reação de síntese da sonda. Deixe a mistura de DNA, água, NTPs e tampão da polimerase aquecer à temperatura ambiente. Um dos passos mais críticos para o sucesso deste procedimento é montar corretamente a reação da sonda.

Monte a reação de síntese da sonda em temperatura ambiente. Adicione os seguintes componentes a um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro nesta ordem: DNA molde, água ajustada a um volume que complete o volume total da reação em 20 microlitros, mistura de NTP, inibidor de RNA, tampão de RNA polimerase e RNA polimerase. Incube a reação de transcrição por duas horas a 37 graus Celsius.

Incubações ligeiramente mais longas que duas horas não têm efeitos adversos, mas também mostram pouco aumento no rendimento; se incubado por uma hora, o rendimento será reduzido, embora ainda suficiente para produzir uma boa sonda. Quando a reação de transcrição estiver completa, retire um microlitro da mistura reacional para verificação em um gel de agarose a 1% em tampão TAE. Adicione a mistura reacional restante.

Adicione 80 microlitros de SDS 1% em tampão TE, 10 microlitros de acetato de amônio 5 M e 220 microlitros de etanol frio. Vortexe a mistura vigorosamente e deixe-a em gelo até que os resultados da verificação de qualidade do RNA sejam conhecidos. Após adicionar água e corante padrão de carga à uma microlitro de RNA removido antes da precipitação, eletroforese o RNA em um gel de agarose 1%, tampão TAE contendo brometo de AUM.

Visualize o RNA marcado com brometo de atherium no gel utilizando um transiluminador de luz UV para verificar a qualidade da sonda. Deve-se observar uma única banda, sem borramento acima ou abaixo dela. Após a confirmação da qualidade do RNA, precipite o RNA remanescente que foi reservado no gelo, centrifugando em um microcentrífuga em velocidade máxima por 10 a 15 minutos.

Remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro afilada e deixe o RNA secar brevemente. Posteriormente, a sonda é ressuspendida em tampão de hibridização de RNA e armazenada em um tubo de poliestireno com tampa de rosca de 15 mililitros a menos 20 graus Celsius. Para iniciar este procedimento, recupere os embriões que foram armazenados em metanol a menos 20 graus Celsius e deixe-os aquecer até a temperatura ambiente.

O procedimento inteiro é realizado em frascos de vidro. Se diferentes embriões de um mesmo grupo forem examinados com diferentes sondas, mantenha-os em um único frasco até pouco antes da adição das sondas. Para reduzir a variabilidade e o trabalho no primeiro dia de preparação para a adição da sonda, reidrate os embriões por meio de uma série de metanol conforme descrito nesta tabela, utilizando pipetas de vidro para remover e adicionar cada solução com cuidado, pois os embriões podem ser facilmente danificados durante esta etapa.

Ao transferir os líquidos, verifique o interior das tampas para garantir que os embriões não tenham ficado retidos ali. Agite suavemente os embriões após cada troca para assegurar que eles não estejam aderidos às paredes ou uns aos outros. E agite os embriões colocando os frascos em um agitador rotativo antes de usar; o tampão de hibridização de RNA e a sonda devem ser pré-aquecidos a 65 graus Celsius.

Hibridize os embriões na solução de sonda durante a noite com agitação a 65 graus Celsius no dia seguinte. Remova a solução de sonda e guarde-a em um tubo de poliestireno com tampa de rosca de 15 mililitros marcado com a data e o número de vezes que a sonda foi utilizada. Armazene a solução de sonda a menos 20 graus Celsius.

Uma vez removida a sonda, prepare os embriões para coloração com anticorpo contra a sonda por meio de uma série de lavagens conforme descrito aqui, alterando a temperatura conforme necessário ao mover o mutador com os frascos de embriões diretamente para estufas de hibridização ajustadas à temperatura apropriada. Durante o tempo em que os embriões estiverem em incubação na solução bloqueadora, prepare o volume apropriado da solução bloqueadora mais anticorpo anti-DIG para que o anticorpo seja bloqueado antes de sua adição aos embriões. Incube os embriões na solução de anticorpo durante a noite com agitação a quatro graus Celsius no dia seguinte.

Remova a solução de anticorpo e lave com mab, uma solução que contém ácido maleico e cloreto de sódio. Realize pelo menos 12 lavagens de 30 minutos à temperatura ambiente com agitação. Substitua a última solução de lavagem pelo substrato de fosfatase alcalina.

Realize a reação de coloração à temperatura ambiente com agitação durante a noite no dia seguinte. Interrompa a reação de coloração e prepare os embriões para armazenamento e análise de imagem trocando os líquidos conforme descrito nesta tabela. Após a reidratação dos embriões, fixe a coloração com MFA por 30 minutos.

Uma vez fixados, remova o MFA e lave os embriões com metanol a 25%. Se for necessário remover o pigmento endógeno, remova o metanol a 25% e adicione a solução clareadora. Observe atentamente o clareamento, pois ele ocorre relativamente rápido, e o grau de clareamento pode ser variado para obter diferentes efeitos.

Para armazenamento de longo prazo, desidrate os embriões por meio de uma série de metanol até 100% de metanol após o branqueamento para armazenamento de curto prazo e posterior imagem. Transfira os embriões para PBS. Embriões não clareados são melhor visualizados e fotografados sobre um fundo de aros a 1%. Para preparar a solução de aros, adicione aros à água e aqueça até ferver, até que o aros esteja em solução. Após o aros ter esfriado até 50 graus Celsius, despeje-o em uma placa de Petri até uma profundidade de cerca de dois milímetros.

Quando a placa aros estiver pronta, coloque os embriões não clarificados na placa e prossiga com a aquisição de imagens. A aros fornece um fundo cinza-azulado que contrasta bem com o embrião e com a cor azul da reação de coloração. Além disso, ajuda a difundir sombras e reflexos indesejados que desviam a atenção do embrião, permitindo imagens alternativas, como a partir do lado ventral.

Use pinças finas para fazer cortes nos aros a fim de acomodar o embrião. Coloque os embriões nesses canais para orientação. Tenha cuidado ao manipular os embriões, pois eles são facilmente danificados.

Utilize a fonte de luz de fibra óptica para iluminar o embrião com um ângulo raso, criando sombras no embrião que proporcionam profundidade à imagem e ajudam a discernir estruturas superficiais, pois o clareamento pode eliminar o pigmento que fornece referências úteis. Use o efeito de sombreamento para embriões fortemente clareados. Embriões clarificados são utilizados para imagens de marcação localizada profundamente no embrião, como na notocorda, pulmão ou regiões do cérebro.

Neste protocolo, diferentes níveis de descoloração são utilizados para visualizar a coloração no embrião. Se a coloração for intensa, uma descoloração mais leve que mantém alguma pigmentação permite um melhor estadiamento e orientação do embrião. No entanto, se a coloração estiver em uma região com altos níveis de pigmentação, como o rim, uma descoloração mais acentuada proporciona um resultado melhor.

A manipulação da base de ARO pode auxiliar na orientação do embrião. Por exemplo, ao cortar um canal fino nos aros, um embrião em estágio de náiade que está deitado de lado pode ser visualizado pela face ventral com estabilidade suficiente para capturar uma boa imagem. Esse embrião foi colocado em um pequeno orifício que estabilizou sua posição com a face ventral voltada para cima, permitindo a visualização completa do padrão de expressão do gene de interesse.

Órgãos internos podem ser visualizados tanto em embriões não transparentizados quanto em embriões transparentizados, a partir de um embrião opaco não transparentizado corado para PAX dois. No estágio 34, o pedúnculo óptico bem como o tubo neural podem ser visualizados. No entanto, os detalhes não são nítidos. Ao transparentizar o embrião, os limites dos locais de expressão, incluindo o pedúnculo óptico, tornam-se mais nítidos.

O grau de clareamento é indicado pela capacidade de visualizar ambos os olhos neste embrião. No entanto, um problema comum em embriões clareados é o acúmulo de coloração nas cavidades internas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar rapidamente um hibridização in situ em montagem inteira com menos reagentes e obter imagens de alta qualidade.