Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é detectar automaticamente células responsivas ao estrogênio em larvas vivas de peixe-zebra. Isso é feito primeiro cruzando cinco peixes adultos X-E-R-E-G-F-P para gerar embriões de peixe-zebra repórter de estrogênio. Em seguida, os embriões são colocados em poços individuais de uma placa de 96 poços.

Em seguida, os estrogênios são adicionados à placa de embriões. Finalmente, a placa é escaneada quanto à fluorescência usando um microscópio epifluorescente com platina motorizada. Em última análise, a microscopia fluorescente é usada para mostrar a atividade específica do tecido dos receptores de estrogênio.

Portanto, a principal vantagem de usar essa técnica em relação a outras técnicas tradicionais, como alto rendimento ou triagem de alto conteúdo, é que a fluorescência específica do tecido em larvas de peixe-zebra pode ser visualizada usando apenas um microscópio epifluorescente padrão. Equipado com uma platina motorizada, não é necessário nenhum leitor de placas especializado. Cuidado: produtos químicos com BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios no feto humano.

Manuseie os desreguladores endócrinos com cuidado e sempre use equipamentos de proteção individual adequados. Nesta demonstração, o peixe-zebra será exposto aos estrogênios 17 beta estradiol, bisfenol A e genine em várias doses, começando 48 horas após a fertilização após a reprodução do peixe-zebra e coletando e equiparando ovos. De acordo com o texto no dia do tratamento, dilua vigorosamente as soluções químicas de estoque descongeladas, um a 1000 em um mililitro de E três B mais PTU em vórtice.

Como um controle de veículo. Use uma diluição de um a 1000 de DMSO em E, três, B e PTU usando uma transferência de plástico de grande diâmetro. Pipeta: transfira três embriões por poço para uma placa de 96 poços, preparando três poços por condição.

Evite colocar embriões em poços externos para evitar a evaporação do meio durante o tratamento prolongado. Trabalhando rapidamente para evitar o ressecamento dos embriões, remova o meio de cada poço e adicione 200 microlitros de solução de tratamento bem misturada. Confirme visualmente se todos os embriões estão submersos na solução e não estão presos ao lado do poço.

Incubar os embriões a 28,5 graus Celsius em 72 horas. Pós-fertilização anestesiar embriões adicionando 10 microlitros de quatro miligramas por mililitro de trica. Para cada um, coloque a placa de 96 poços em um palco motorizado e usando o software Zeiss Zen Blue 2011.

Calibre a platina selecionando a opção de suporte de amostra e escolhendo multi poço 96. Em seguida, selecione calibrar antes de seguir as instruções passo a passo, usando uma objetiva de 10 x e a configuração de campo claro ou BF, identifique um embrião de controle positivo e defina as configurações de exposição adequadamente para os canais BF e GFP, certificando-se de que o sinal de fluorescência não esteja saturando a câmera. Concentre-se em um único embrião e programe o microscópio para adquirir um total de três seções Z que incluem uma imagem 50 micrômetros acima e outra 50 micrômetros abaixo do plano focal atual.

Em seguida, para definir os parâmetros de software para adquirir uma imagem lado a lado usando os canais GFP e BF. Na guia de aquisição, selecione configuração avançada, selecione regiões de bloco e, em seguida, blocos. Escolha o círculo.

Opção de poço selecione portadora e fator de preenchimento 90%para capturar várias imagens dos poços selecionados, de modo que 90% da área de cada poço seja visível na imagem composta. Em opções, selecione a quantidade de sobreposição desejada, como cinco a 10%, o que permite uma costura suave entre as imagens. Em seguida, inicie a imagem para capturar imagens manualmente usando uma objetiva de 20 x e a configuração BF, identifique um embrião de controle positivo.

Defina as configurações BF e GFP como antes e tire fotos. Esta figura mostra imagens compostas de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem é composta por 59 imagens individuais com 5% de sobreposição de imagens.

Observe que os peixes-zebra vivos são orientados aleatoriamente dentro de cada poço. No entanto, somos capazes de distinguir a fluorescência no coração da fluorescência no fígado. Imagens de campo claro são úteis como referências para avaliar a orientação do peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas.

As imagens mostradas aqui foram capturadas com uma objetiva de distância de trabalho de 20 x mais longa para uma análise mais detalhada e foram tiradas diretamente após a varredura automatizada mostrada sem remover a placa da platina do microscópio. Usando uma objetiva de 20 x, a fluorescência no coração pode ser localizada com precisão nas válvulas ventriculares atriais apontadas pelas setas e nas válvulas aórticas, conforme indicado pela cabeça da seta. Uma vez que essa técnica é dominada, imagens de 3 96 placas de parede podem ser capturadas por dia.

Não se esqueça de que trabalhar com compostos desreguladores endócrinos pode ser perigoso, portanto, sempre tome as devidas precauções, como usar o equipamento de proteção individual adequado ao realizar este procedimento.