Name: Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-17T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a detectar células responsivas ao estrogênio em embriões de zebrafish usando microscopia de fluorescência automatizada. Este método permite visualizar atividade tecido-específica de receptores de estrogênio em Danio rerio.

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Agradecemos Susan Farmer e os funcionários do centro de pesquisa do peixe-zebra UAB para cuidado zebrafish. O financiamento é fornecido pelos fundos de start-up do Departamento de Farmacologia e Toxicologia.

NOTA: Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Alabama em Comitê Animal Care e Use Institucional Birmingham. 1. Breeding Zebrafish e ovo Coleções <ol><li> Três dias antes do início da exposição a produtos químicos, montar tanques de criação com divisórias para machos e fêmeas separados. Encha cada metade do caminho tanque com água do sistema de aquicultura. Usando uma rede, transferir Tg (5xERE: GFP) peixe c262/c262 para tanques de criação, colocando 2 machos e 3 fêmeas em cada tanque separado por uma divisória. Coloque uma tampa em cada tanque e etiqueta com data e as tensões a serem cruzados. </li><li> Na manhã seguinte, retire todas as barreiras e inclinação defletores para criar uma área rasa em uma extremidade do tanque de criação. Permitir peixe-zebra para acasalar, a coleta de embriões em intervalos de 10 min para garantir a encenação de desenvolvimento precisa. Ovos limpos lavando através de um coador de chá usando E3B médio e lave delicadamente embriões em placas de Petri. Retornar peixes adultos para permanentetanques. </li><li> Usando um microscópio de dissecação, classificar, contar, e remover todos os embriões não fertilizados, anormais ou danificados. Coloque embriões em placas de Petri em E3B médio e casa de 28,5 ° C, com 14:10 de luz: ciclo de escuro. Densidade de embriões pode afetar o desenvolvimento. Coloque no máximo 100 embriões em um prato de 100 mm x 35 e não mais de 50 embriões em um prato mm 60 x 15. </li><li> Por 24 hpf, substituir a mídia com E3B contendo 200 mM 1-fenil-2-tiouréia (PTU). PTU evita a formação de pigmento e mantém embriões de peixes-zebra e larvas transparente para melhorar a nitidez da imagem. CUIDADO: estoque PTU concentrado é perigoso; usar luvas ao fazer solução E3B + PTU. </li><li> Em 1 º dia pós fertilização (dpf), remover manualmente o córion de cada embrião usando uma pinça fina. O córion não parece afetar a penetração de estrogênios, porém remoção aumenta a nitidez da imagem. Não há necessidade de remover córions da mídia. NOTA: Como alternativa ao dechorionation manual, lotes de embriões pode ser checamente dechorionated utilizando 1 mg / mL de pronase de tratamento, como anteriormente descrito 11. </li></ol> 2. Química Tratamento de embriões <ol><li> No dia antes do tratamento, preparam-se soluções de estoque de cada produto químico, na concentração de 1000 vezes em DMSO (ou num solvente adequado). Por exemplo, para expor os embriões a 10 uM de bisfenol A (BPA), preparar uma solução de estoque 10 mM de BPA em 100% de DMSO. Isto assegura a concentração de DMSO uniforme em cada tratamento e permite uma diluição 1:1.000 não-tóxico de DMSO para servir como um controlo do veículo. As soluções de armazenar a -20 ° C. Para este protocolo, os embriões serão expostos a 1 uM e 10 uM de BPA, 18,5 nM e 1,85 uM de genisteína, 367 nM de estradiol (controlo positivo) e veículo (DMSO a 0,1%, de controlo negativo). ATENÇÃO: Produtos químicos, como BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios sobre o feto humano. Lidar com disruptores endócrinos com cuidado e use sempre equipamento de protecção individual adequado.</li><li> No dia do tratamento, descongele preparadas soluções químicas de ações. Dilui-se 1:1000 pipetando 1 ml + E3B PTU para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e a adição de 1 ml de solução de estoque de produtos químicos. Vortex vigorosamente. Dilui-se 1:1000 em DMSO + E3B PTU como um controlo do veículo. Use 1 mL + E3B PTU num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, como um controlo não tratado. </li><li> Usando uma pipeta de transferência de plástico grande furo, embriões de transferência a partir de placas de Petri para cada poço de uma placa de 96 poços, 3 embriões por poço, 3 poços por condição. Para evitar a evaporação durante o tratamento prolongado, omitir embriões de linhas exteriores e as colunas da placa (linhas A e E, as colunas 1 e 12). Poços exteriores podem ser preenchidos com 300 ul de E3B + PTU. Rotular a tampa da placa de forma adequada. </li><li> Remova a mídia de cada poço com uma fina ponta da pipeta de transferência de plástico. Trabalhe rapidamente para evitar a secagem dos embriões. </li><li> Adicionar 200 ul de solução de tratamento em cavidade correspondente. Coloque a tampa underneath a placa como um guia para assegurar a adição de tratamentos para os poços apropriados. Vortex cada tubo antes da pipetagem para distribuir o produto químico em solução. Confirmar visualmente cada embrião é na solução de tratamento. Se os embriões estão do lado do poço, utilizar uma pipeta de transferência limpa para lavá-los para dentro do poço, com a solução de tratamento. </li><li> Colocar a placa na incubadora a 28,5 ° C. Embriões serão analisados ​​quanto à fluorescência no 72 hpf. </li></ol> 3. Automated imagem de embriões em placas de 96 poços <ol><li> Anestesiar os embriões por adição de 10 uL de 4 mg / ml tricaina a cada poço. NOTA: Anestesie embriões antes da imagem. Na 24-96 hpf, peixe-zebra exibem movimento espontâneo e uma resposta de sobressalto para a fonte de luz mudando durante a captura da imagem. Anestesiar embriões reduz o movimento durante o exame. </li><li> Colocar a placa de 96 poços na plataforma motorizada e calibrar o palco. Usando 2011 software para microscopia automatica Zeiss Zen Azulon e controle, selecione a opção transportadora amostra e selecione multiwell 96. Selecione Calibrar. Siga as instruções passo a passo para calibrar o palco. NOTA: Não desmarque o botão azulejos após esta etapa. Se o botão de telhas é desmarcada, as configurações de calibragem podem ser perdidos ea placa de 96 poços terão de ser recalibrado. </li><li> Usando uma objetiva de 10x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição adequadamente para BF e canais de GFP, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. Concentre-se em um único embrião e programar o microscópio para adquirir 3 total de Z-seções, uma imagem 50 mm acima e outra 50 mm abaixo do plano focal atual. NOTA: Uma vez que os tecidos diferentes ocupam diferentes planos focais, o que irá garantir que para cada peixe-zebra imagens são capturadas com o coração eo fígado em foco. </li><li> Defina os parâmetros de software para adquirir uma imagem em mosaico usando GFP e BF channels. Sob a guia de aquisição, selecionar a configuração avançada. Selecionar as regiões de azulejos, então telhas. Escolha a opção de círculo bem. NOTA: ladrilhos é usada para criar uma imagem composta de cada poço. Um campo de visão-single captura apenas uma pequena parte de cada poço. A função de azulejos pode capturar automaticamente várias adjacente campos de visão de cada poço, criando uma imagem composta de todo o bem. Por conseguinte, é possível captar automaticamente 96 imagens compostas por placa, em que cada imagem composta contém várias dezenas de imagens individuais a partir de um único poço. </li><li> Escolha operadora e preencher fator de 90%. A seleção de um fator de preenchimento de 90% irá capturar várias imagens dos poços selecionados de tal forma que 90% da área de cada poço será visível na imagem composta. NOTA: Ao selecionar o fator de preenchimento, um diagrama será exibido representando a área a ser trabalhada. Selecione uma porcentagem que vai incluir a área do poçoque é apropriado para a experiência. </li><li> Em Opções, selecione a quantidade de sobreposição desejado. NOTA: Quando costurando telhas para uma única imagem representativa, uma sobreposição de 5-10% permite uma costura suave entre imagens. No entanto, se a imagem de costura é necessário, utilizando uma sobreposição 0% irá reduzir o tempo de imagiologia. Utilização de factor de enchimento de 90% e 5% de sobreposição, uma imagem composta de um único poço consiste de 59 imagens individuais. </li><li> Comece imagem. O microscópio irá adquirir automaticamente as imagens. </li><li> Inspeccionar manualmente imagens compostas de cada poço para fluorescência específica de tecido (Figura 1). </li><li> NOTA: É melhor começar com o controle positivo para confirmar que a exposição a substâncias químicas trabalhou antes de observar poços de tratamento experimental. </li></ol> 4. Manual de captura de imagem de Embriões em placa de 96 poços NOTA: Para confirmar os resultados, use uma objetiva de 20x distância de trabalho longa para acquire imagens mais detalhadas manualmente (Figura 2). <ol><li> Usando uma objetiva de 20x eo campo claro (BF) definir, identificar um embrião controle positivo e definir as configurações de exposição para os canais de BF e GFP adequadamente, certificando-se que o sinal de fluorescência não está saturando a câmera. </li><li> Identificar embriões individuais e capturar imagens manualmente. NOTA: Uma vez que as configurações de exposição foram selecionados para o embrião controle positivo, não alteram as configurações. Esta permite uma comparação da intensidade de fluorescência para cada imagem é capturada em condições uniformes. </li></ol>

<ol><li>Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+FGF+reporter+transgenic+zebrafish+and+their+utility+in+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens.</a> BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).</li>
<li>Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-mediated+gene+expression+in+transgenic+reporter+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish.</a> Developmental Biology. , 89-101 (2001).</li>
<li>Gorelick, D. A., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Estrogen+Receptor+Transcriptional+Activation+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish.</a> Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).</li>
<li>Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+tool+for+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+C%3A+Embryo+Today%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A tool for chemical screens.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).</li>
<li>Peravali, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+feature+detection+and+imaging+for+high-resolution+screening+of+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos.</a> Biotechniques. 50, 319-324 (2011).</li>
<li>Walker, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+reporter+quantification+in+vivo%3A+high-throughput+screening+method+for+reporter-based+assays+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Vogt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image-based+phenotypic+analysis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos.</a> Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).</li>
<li>Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+automated+imaging+and+analysis+for+zebrafish+chemical+screens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.</a> J. Vis. Exp. , (2010).</li>
<li>Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+estrogen+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the estrogen response element.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).</li>
<li>Rovira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screen+identifies+FDA-approved+drugs+and+target+pathways+that+induce+precocious+pancreatic+endocrine+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Este protocolo descreve um método simples para automaticamente a imagem de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra. O protocolo foi desenvolvido utilizando uma Zeiss Axio Observer. Z1 com software Zen azul 2011, no entanto, a técnica pode ser adaptada usando qualquer microscópio invertido com uma platina motorizada e software de controlo do microscópio que possa realizar a telha para criar imagens compostas. Equipar um microscópio invertido com um palco motorizado pode fornecer uma alternativa prát...

Paulistinha transgênico foram desenvolvidos que permitem a visualização direta de atividade em vias de sinalização, como fatores de crescimento de fibroblastos 1, o ácido retinóico 2 e 3 estrógenos, em embriões vivos. Estas ferramentas permitem o rastreio de produtos químicos que perturbam as vias de sinalização (ensaiado como uma mudança na intensidade de fluorescência) ou por produtos químicos que modulam a sinalização de um modo específico do tecido (alteração na fluorescência de localização) 4. Captura de imagem automatizado aumenta a taxa de transferência de telas químicas dramaticamente 5,6. Telas que fluorescência automaticamente ensaio no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados. O chamado de triagem de alto teor fornece o benefício de alta resolução, imagens quantitativas, mas ao custo de usar leitores de placas especializadas equipadas para microscopia confocal 7,8. O objectivo deste método é a fluorescência específica de tecido automaticamente ensaio em embriões de peixe-zebraem uma placa de 96 poços, utilizando um microscópio de epifluorescência padrão. Fluorescência de tecidos específicos podem ser distinguidos utilizando esta técnica e pode ser uma abordagem razoável para laboratórios que não têm acesso a leitores de placas especializadas ou equipamentos de alta teor de triagem. Neste protocolo, usamos de imagens automatizado para detectar receptor de estrogênio tecido específico (ER) agonistas em peixe-zebra ao vivo em três dias após a fertilização (dpf). A linhagem transgênica Tg (5xERE: GFP) c262/c262 contém 5 seqüências em tandem de resposta de estrogênio elementos de DNA (ERE) a montante da proteína verde fluorescente (GFP) 3. Na ausência de ligando, ERs são normalmente inactivos. Ligação do ligante desencadeia uma mudança conformacional, permitindo que os receptores para ligar DNA ERE e regulam a transcrição 9. 5xERE: peixe GFP pode ser utilizado para pesquisar bibliotecas químicas para moduladores de ER e pode ser utilizado para rastrear as amostras de água do meio ambiente para os contaminantes estrogênicos.

<table><tbody><tr><td>Pipetas de transferência de plástico; furo largo</td><td>Fisher</td><td>13-711-23</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência de plástico; ponta fina</td><td>Fisher</td><td>13-711-26</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços, redondas, de fundo plano</td><td>Fisher</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 100 x 35 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 35 x 60 mm</td><td>Fisher</td><td>08-757-100B</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina Dumont #5</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>11254-20</td><td>dimensões da ponta 0,05 x 0,01 mm, para remover manualmente córions de embriões</td></tr><tr><td>Tricaine metanossulfonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>veja o Livro do Zebrafish para receita (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)&nbsp;</td></tr><tr><td>1-fenil 2-tioureia (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Prepare estoque de 20 mM (100x) e use a 200 &mu; M em E3B&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1</td><td>O protocolo Carl Zeiss</td><td></td><td>requer um microscópio de fluorescência invertida com uma platina motorizada</td></tr><tr><td>Objetiva de longa distância de trabalho de 20x</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Usamos uma objetiva com 0,4 NA e 8,4 mm de distância de trabalho</td></tr><tr><td>Câmera digital Axiocam HRm</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZenBlue 2011 software de controle de microscópio</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>O protocolo requer software de automação e controle de microscopia para permitir a captura de imagens lado a lado usando um estágio motorizado</td></tr><tr><td>Azul de Metileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MB-1; 25 gramas</td><td>fazem solução a 2% em água RO para uso em E3B (abaixo)</td></tr> <tr><td>E3B</td><td></td><td></td><td>60X E3 SOLUÇÃO: NaCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 17,2 gramas KCl&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 0,76 gramas CaCl2-2H2O&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; - 2,9 gramas MgSO4-7H2O&nbsp; - 4,9 gramas ou MgSO4 - 2,39 gramas Dissolver em 1 litro de água Milli-Q; armazenar em frasco estéril de 1 litro. 1X E3B SOLUÇÃO PARA PEIXE-ZEBRA: 60X E3&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 150 ml 2% azul de metileno &nbsp; &nbsp; &nbsp; 100 &mu; l&nbsp; Leve para 9 litros com água Milli-Q &nbsp;</td></tr></tbody></table>

imagem semi-automatizada de fluorescência de tecidos específicos em embriões zebrafish

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Embriões de peixe-zebra são uma poderosa ferramenta para a triagem em larga escala de pequenas moléculas. Zebrafish transgênicos que expressam proteínas repórter fluorescentes são freqüentemente usados ​​para identificar os produtos químicos que modulam a expressão do gene. Telas químicas que ensaio de fluorescência no peixe-zebra ao vivo muitas vezes dependem de caros, equipamentos especializados para rastreio de alto conteúdo. Nós descrevemos um procedimento usando um microscópio de epifluorescência padrão com um palco motorizado a imagem automaticamente embriões de peixes-zebra e detectar a fluorescência de tecido específico. Usando zebrafish transgênicos que relatam a atividade do receptor de estrogênio via expressão de GFP, foi desenvolvido um processo semi-automatizado para triagem de ligantes do receptor de estrogênio que ativam o repórter de uma forma específica de tecido. Neste vídeo, descrevemos os procedimentos para arraying embriões de peixe-zebra em 24-48 horas pós fertilização (hpf) em uma placa de 96 poços e adicionando pequenas moléculas que se ligam receptores de estrogênio. Em 72-96 hpf, imagens de cada poço a partir detoda a placa são coletados automaticamente e inspecionados manualmente para fluorescência de tecido específico. Este protocolo demonstra a capacidade para detectar os estrogénios que activam os receptores de válvulas cardíacas, mas não no fígado.

A Figura 1 mostra imagens compósitas a partir de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem composta é composta de 59 imagens individuais com 5% de imagem de sobreposição. Note-se que o peixe-zebra vivos são orientadas aleatoriamente dentro de cada poço, ainda que são capazes de distinguir da fluorescência no coração a partir do fígado. Imagens de campo claro, são úteis como referências para avaliar a orientação peixe-zebra e visualizar anormalidades morfológicas (Figuras 1A e 1C).<...

Descrito aqui é um protocolo para a imagem semi-automatizada de fluorescência de tecido específico em embriões de peixe-zebra.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

O objetivo geral deste procedimento é detectar automaticamente células responsivas ao estrogênio em larvas vivas de peixe-zebra. Isso é realizado primeiramente cruzando cinco peixes adultos X-E-R-E-G-F-P para gerar embriões de peixe-zebra com repórter de estrogênio. Em seguida, os embriões são colocados em poços individuais de uma placa de 96 poços.Em seguida, os estrógenos são adicionados à placa de embriões. Por fim, a placa é escaneada quanto à fluorescência utilizando um microscópio epifluorescente com estágio motorizado. Em última análise, a microscopia de fluorescência é usada para demonstrar a atividade tecido-específica dos receptores de estrógeno.Portanto, a principal vantagem do uso dessa técnica em comparação com outras técnicas tradicionais, como triagem de alto rendimento ou triagem com alto conteúdo, é que a fluorescência específica de tecidos em larvas de peixe-zebra pode ser visualizada apenas com um microscópio epi-fluorescente padrão, equipado com uma platina motorizada, não sendo necessário nenhum leitor de placas especializado. Produtos químicos como BPA e estradiol são perigosos e podem ter efeitos deletérios sobre o feto humano.Manipule os disruptores endócrinos com cuidado e utilize sempre equipamentos de proteção individual adequados. Nesta demonstração, peixes-zebra serão expostos aos estrogênios 17 beta-estradiol, bisfenol A e genisteína em diversas doses, começando 48 horas após a fertilização, após o acasalamento dos peixes-zebra e a coleta e equalização dos ovos. De acordo com o texto, no dia do tratamento, dilua as soluções estoque descongeladas, na proporção de um para 1000, em um mililitro de E3B mais PTU, e vortexie vigorosamente.Como controle de veículo. Utilize uma diluição de um para 1000 de DMSO em E três B e PTU, usando uma pipeta plástica de grande diâmetro. Transfira com pipeta três embriões por poço em uma placa de 96 poços, preparando três poços por condição.Evite colocar embriões em poços periféricos para prevenir a evaporação do meio durante tratamentos prolongados. Trabalhando rapidamente para evitar o ressecamento dos embriões, remova o meio de cada poço e adicione 200 microlitros de solução de tratamento bem misturada. Verifique visualmente se todos os embriões estão submersos na solução e não estão aderidos à parede do poço.Incube os embriões a 28,5 graus Celsius por 72 horas. Após a fecundação, anestesie os embriões adicionando 10 microlitros de quatro miligramas por mililitro de trica. Em cada poço, coloque a placa de 96 poços sobre uma platina motorizada e utilize o software Zeiss Zen Blue 2011.Calibre o estágio selecionando a opção de porta-amostras e escolhendo a placa de 96 poços. Em seguida, selecione calibrar e siga as instruções passo a passo, utilizando uma objetiva de 10x e o modo de campo claro ou BF. Identifique um embrião controle positivo e ajuste adequadamente as configurações de exposição para os canais BF e GFP, garantindo que o sinal de fluorescência não sature a câmera. Foque em um único embrião e programe o microscópio para adquirir um total de três seções Z, incluindo uma imagem a 50 micrômetros acima e outra a 50 micrômetros abaixo do plano focal atual.Em seguida, defina os parâmetros do software para adquirir uma imagem em mosaico utilizando os canais GFP e BF. Na guia de aquisição, selecione configuração avançada, selecione regiões em mosaico e depois mosaicos. Escolha o círculo.Selecione a opção de poço do portador e fator de preenchimento de 90% para capturar múltiplas imagens dos poços selecionados, de modo que 90% da área de cada poço seja visível na imagem composta. Nas opções, selecione a quantidade de sobreposição desejada, como cinco a 10%, o que permite uma junção suave entre as imagens. Em seguida, inicie a aquisição de imagens para capturar manualmente as imagens usando uma objetiva de 20 x e a configuração BF, identificando um embrião controle positivo.Configure as configurações de BF e GFP como antes e capture as imagens. Esta figura mostra imagens compostas de poços individuais de uma placa de 96 poços. Cada imagem é composta por 59 imagens individuais com 5% de sobreposição entre as imagens.Observe que os peixes-zebra vivos estão orientados aleatoriamente dentro de cada poço. Ainda assim, somos capazes de distinguir a fluorescência no coração da fluorescência no fígado. As imagens em contraste de fase são úteis como referência para avaliar a orientação dos peixes-zebra e visualizar anomalias morfológicas.As imagens mostradas aqui foram capturadas com uma objetiva de 20 x de longa distância de trabalho para uma análise mais detalhada e foram obtidas imediatamente após a varredura automatizada mostrada anteriormente, sem remover a placa da platina do microscópio. Usando uma objetiva de 20 x, a fluorescência no coração pode ser precisamente localizada nas válvulas atrioventriculares indicadas pelas setas e nas válvulas aórticas, conforme indicado pela ponta de seta. Uma vez dominada esta técnica, é possível capturar imagens de 3 placas de 96 poços por dia.Não se esqueça de que trabalhar com compostos disruptores endócrinos pode ser perigoso; portanto, tome sempre as precauções adequadas, como o uso de equipamentos de proteção individual apropriados durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método é descrito para photoactivate células individuais contendo uma proteína fluorescente enjaulado usando absorção de dois fótons de uma Ti: Sapphire oscilador laser de femtossegundos. Para mapear o destino da célula fotoativados, imuno-histoquímica é usada. Esta técnica pode ser aplicada a qualquer tipo de célula.

Mapeamento Destino única célula em Zebrafish

Fonte: Zhang, X., et al. Um modelo de embrião de peixe-zebra para visualização in vivo e análise intravital da infecção por Staphylococcus aureus associada a biomateriais. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra imagens de fluorescência de embriões de peixe-zebra injetados com Staphylococcus aureus, permitindo a quantificação da progressão da infecção e distribuição bacteriana para avaliar o impacto das microesferas de biomateriais nas interações patógeno-hospedeiro in vivo.

 Imagem de fluorescência de infecção bacteriana associada a biomateriais em embriões de peixe-zebra

O desenvolvimento do peixe-zebra pode ser seguido ao longo de dias com microscopia folha de luz quando os embriões estão embutidos em tubos de polímero opticamente clara com agarose de baixa concentração.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

A imagem do comportamento dinâmico de organelas e outras estruturas subcelulares in vivo pode lançar luz sobre sua função em condições fisiológicas e de doença. Aqui, apresentamos métodos para marcar geneticamente duas organelas, centrossomas e mitocôndrias, e imagens de sua dinâmica em embriões vivos de peixe-zebra usando microscopia de campo amplo e confocal.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Este protocolo demonstra a imunofluorescência seqüencial e immunohistochemistry em Cryosections dos embriões do zebrafish do cedo-estágio permitindo análises precisas da colocalização em populações específicas da pilha.

Imunofluorescência sequencial e imuno-histoquímica em embriões de zebrafish Crioseccionados

Este protocolo descreve uma abordagem para rotulagem e imagem multidimensional de zebrafish desenvolvimento precoce dos olhos. Descrevemos rotulagem, incorporação e imagens quadridimensionais (4D) usando microscopia confocal de varredura a laser, e considerações para otimizar a aquisição de conjuntos de dados para dissecção de mecanismos de morfogênese de copo óptico.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Este protocolo utiliza imagens de lâminas de luz para investigar a função contrátil cardíaca em larvas de peixe-zebra e obter informações sobre mecânica cardíaca por meio de rastreamento celular e análise interativa.

Imagem de folha de luz 4D da contração cardíaca do peixe-zebra

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a detectar células responsivas ao estrogênio em embriões de zebrafish usando microscopia de fluorescência automatizada. Este método permite visualizar atividade tecido-específica de receptores de estrogênio em Danio rerio.

Imagem semi-automatizada de Fluorescência de tecidos específicos em embriões Zebrafish

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