Avaliando Contribuições Espécies específicas Para o Desenvolvimento Craniofacial Utilizando Quimeras Codorniz-pato

O objetivo geral deste procedimento é usar quimeras do ducto de codorna como um meio de investigar os mecanismos pelos quais as células da crosta neural geram padrões específicos de espécies durante o desenvolvimento craniano-facial. Isso é feito primeiro dissecando e removendo uma tira da dobra neural da região central e anterior do cérebro posterior de um embrião de codorna em estágio 9.5. A segunda etapa envolve a transferência da dobra neural do doador de codornas para o embrião hospedeiro do pato.

A terceira etapa envolve dissecar e remover a região equivalente de um embrião hospedeiro de pato em estágio 9.5. A etapa final é colocar a dobra neural da bobina na região do pato, mesencéfalo médio e anterior. Em última análise, os embriões quiméricos resultantes podem identificar mudanças mediadas pela crista neural na expressão gênica por meio da hibridização C dois e também podem revelar alterações morfológicas por meio de análises histológicas.

Tive a ideia desse método pela primeira vez quando estava assistindo pelicanos marrons voarem sobre Ocean Beach, em São Francisco. Percebi que as células da crista neural devem ser a fonte do padrão específico da espécie, uma vez que dão origem aos ossos e cartilagens de seu esqueleto de bico longo. Embora eu não tenha conseguido rastrear ovos de pelicano marrom, consegui encontrar pato laqueado branco.

Dado que São Francisco tem a maior Chinatown fora da Ásia Explorando as diferenças nas taxas de maturação e morfologia entre codornizes e patos. Este método pode nos ajudar a responder a questões-chave na biologia do desenvolvimento, como entender as origens do padrão específico da espécie, Realizando a cirurgia estará a Dra. Jennifer Fish, que é uma bolsista de pós-doutorado No meu laboratório, a assistência será Kate Ovitz, que é uma estudante de pós-graduação Usando um pãezinho e um queimador, aqueça a extremidade estreita de uma pipeta de pasta até que o vidro ao longo do cone comece a derreter. Retire-o da chama e puxe a ponta até que a pipeta fique selada.

Certifique-se de que uma parte da peça cônica tenha um diâmetro externo entre 0,7 e um milímetro. Em seguida, quebre a extremidade selada a cerca de quatro centímetros do cone. Em seguida, prenda cerca de sessenta centímetros de tubo de borracha na extremidade aberta do golpe da pipeta na outra extremidade.

Não deve haver ar passando pela conexão ou outra extremidade da pipeta, ao mesmo tempo em que fornece uma leve pressão soprando no tubo. Use um lápis de propano, maçarico de chama para aquecer uma área oval em um lado da pipeta logo abaixo do início do cone. Assim que o vidro começar a dobrar para fora, remova a pipeta da chama e sopre suavemente através do tubo de borracha.

Isso fará com que a parte aquecida do copo forme uma bolha em forma de salsicha. Muita pressão fará com que a bolha de vidro estoure, e isso deve ser evitado. A janela resultante na pipeta deve ter cerca de um centímetro de largura e um centímetro e meio a dois centímetros de comprimento.

Agora aponte a extremidade cônica para cima e raspe a bolha em um recipiente de resíduos de vidro enquanto sopra suavemente através do tubo para evitar que fragmentos de vidro entrem na pipeta. Em seguida, usando a chama de propano, queime cuidadosamente as bordas restantes da bolha e polir as laterais da janela aberta. Em seguida, segure o lápis de ponta diamantada na posição vertical, use um lápis de ponta diamantada para marcar a extremidade cônica da pipeta a um centímetro do início do cone.

Usando uma pinça, quebre suavemente a pipeta na linha marcada. Para remover a ponta, verifique sob um microscópio de dissecação para certificar-se de que a quebra está limpa e não irregular. Segure a pipeta como se segurasse um lápis com o dedo indicador sobre a janela aberta a aproximadamente 9,5 milímetros da ponta.

Amoleça o vidro da pipeta, segurando-o adjacente à borda da chama de um queimador de álcool. Aplique pressão na ponta com uma pinça para dobrar a extremidade estreita da pipeta em um ângulo de 60 graus sob um escopo de dissecação. Rápida e cuidadosamente, polir a ponta com o queimador de álcool.

A abertura acabada deve ser arredondada e desobstruída. Observe que a ponta ficará contraída e inutilizável se mantida na chama por muito tempo. Agora lubrifique um tubo de borracha de 2,5 centímetros de comprimento com 70% de etanol.

Deslize-o sobre o eixo da pipeta de baixo para cima para cobrir a janela aberta. Em seguida, coloque um bulbo de látex de dois mililitros na extremidade aberta da pipeta. Para manter a pressão do ar interno, primeiro prepare o ovo hospedeiro.

Corte a membrana Vitale usando uma agulha de tungstênio afiada por chama e puxe a membrana sobre o embrião. Em seguida, feche novamente o ovo com fita adesiva, como feito para o óvulo doador. Remova a fita da janela do óvulo doador para cortar a dobra neural do embrião doador.

Faça fendas em ambos os lados do tubo neural usando uma agulha de tungstênio afiada por chama. Em seguida, corte o tubo neural nos níveis anterior e posterior desejados do enxerto e separe o enxerto do resto do tubo neural. Preste atenção a quaisquer detalhes anatômicos específicos, como a forma anterior versus posterior do enxerto, que fará com que o tecido doador seja orientado adequadamente.

Quando colocado no hospedeiro, Certifique-se de que a agulha de tungstênio seja extremamente afiada. Use movimentos rápidos e deliberados para remover o tecido completamente e inteiro, remova a dobra neural do embrião doador usando uma pipeta xamã. Aspire o mínimo de líquido possível ou o tecido pode flutuar durante a transferência.

Agora remova a fita da janela do óvulo hospedeiro e use a pipeta xamã para colocar a dobra neural do doador ao lado do embrião hospedeiro adjacente à região do tubo neural que receberá o transplante. Agora separe a dobra neural do tubo neural do embrião hospedeiro, como feito com o doador. Tome cuidado para remover um enxerto de tamanho igual ao tecido doador.

Empurre suavemente este tecido hospedeiro para longe do embrião. Em seguida, com uma agulha de tungstênio romba ou a ponta arredondada de uma micropipeta, mova suavemente a dobra neural do doador para o tubo neural do hospedeiro, mantendo as orientações posteriores e ventrais dorsais adequadas. Certifique-se de que o enxerto esteja dobrado nas laterais, mas certifique-se de não cutucar ou danificar os tecidos subjacentes.

A solução salina estéril deve ser aplicada com cuidado e suavidade sobre o embrião hospedeiro. Se houver algum sinal de dessecação, agora feche e rotule cuidadosamente o ovo e devolva-o suavemente a uma incubadora de alta umidade, onde o embrião quimérico pode se desenvolver até o estágio desejado. Para análise.

Para análise, colete os embriões quiméricos em um fixador frio de Sarah recém-feito. Em seguida, coloque-os imediatamente em uma cadeira de balanço a quatro graus Celsius para uma fixação durante a noite. Isso permitirá uma detecção mais sensível de ovos de codorna com o anticorpo anti-codorna.

Outro passo importante para as análises de expressão gênica por PCR quantitativo em tempo real é congelar os embriões e o nitrogênio líquido antes do RNA. Bobinas de extração e patos mostram diferenças consideráveis em tamanho e forma e, portanto, seus embriões são ideais para fazer um sistema quimérico. Estudar o desenvolvimento craniofacial C.

Especificamente, o sistema é útil para investigar o papel das células da crista neural. Ao padronizar o esqueleto facial no quimérico qua embrião doador de codorna células da crista neural migram para o arco mandibular do pato hospedeiro. Em um padrão semelhante a um pato, as células doadoras de codornas em verde são vistas com um anticorpo anti-codorna da visão ventral.

Em um embrião quimérico de estágio 12, a crista neural do doador gera um esqueleto mandibular que é semelhante a codornas em tamanho e forma. Uma vez dominado, cada transplante pode ser feito em aproximadamente cinco minutos. Se feito corretamente por mais tempo, coloca o embrião em risco de dessecação e a taxa de sobrevivência diminuirá.

Ao realizar este procedimento, é importante estar ciente de sua postura, relaxar os ombros e manter uma boa posição das mãos. Além disso, desenvolva uma rotina e coloque suas ferramentas cirúrgicas e reagentes no mesmo lugar todas as vezes para que você possa manter os olhos no microscópio e mover as mãos de maneira automatizada.