Caracterização de escamas de peixe multi-camadas (

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura, a composição química e as propriedades mecânicas de escamas de peixe mineralizadas e multilamelares realizando tomografia computadorizada por raios X, nanoindentação, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier e microscopia eletrônica de varredura acoplada à espectroscopia de raios X por dispersão de energia. Isso é realizado primeiramente preparando as escamas individuais para análise, removendo o tecido mole das escamas, montando e seccionando-as, seguido de polimento progressivo. O segundo passo consiste em realizar nanoindentação espacialmente correlacionada ao longo da seção transversal da escama, utilizando uma ponteira de diamante do tipo Berkovich, para determinar as propriedades nanomecânicas locais.

Em seguida, as camadas interna e externa da escama de peixe são examinadas com um microscópio FTIR para identificar os principais grupos funcionais nas respectivas camadas. O passo final consiste em utilizar o detector EDX no microscópio eletrônico de varredura para correlacionar a composição química local às nanoindentações realizadas nas escamas de peixe e para capturar imagens das indentações nas diferentes camadas e superfícies de fratura. Em última análise, combinando essas diversas técnicas experimentais, os princípios naturais de projeto das escamas de peixe mineralizadas são elucidados por meio da compreensão das relações entre estrutura e propriedades.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos de ensaio existentes, como a nanoindentação estatística em massa, é que ela realmente fornece uma correlação direta entre a composição química, a estrutura e as propriedades mecânicas locais. Em regiões de interesse, aplicamos este método para estudar a distribuição espacial, a estrutura da composição química e as propriedades mecânicas em biomateriais estruturais. Também possui diversas aplicações, incluindo materiais à base de cimento, compósitos multifásicos e realmente qualquer tipo de material heterogêneo que apresente essa heterogeneidade em escalas de comprimento micrométricas e nanométricas.

Para examinar uma seção transversal do eixo curto de uma escama de peixe, segure a escama em um molde de amostra com diâmetro de 32 milímetros, utilizando um suporte de amostra plástico comercialmente disponível para manter a amostra corretamente orientada durante a inclusão na resina epóxi. Uma vez que a amostra esteja fixada no molde, despeje uma resina epóxi não curada sobre a amostra. Após permitir que a resina epóxi cure de acordo com as instruções do fabricante, corte a amostra incluída utilizando uma serra de corte de precisão com lâmina de diamante na linha média da amostra.

Uma vez que a amostra tenha sido carregada no nano e os indentes inseridos, use os controles do software para mover o espécime até a posição do primeiro indente, realizando quatro linhas paralelas de indentes espaçados 15 micrômetros um do outro para obter um conjunto de dados estatisticamente significativo a partir dessa localização. Em seguida, configure o nanoindente para uma carga máxima de cinco milinewtons, com taxas de carregamento e descarregamento de 0,1 milinewton por segundo, um tempo de permanência de 30 segundos e um espaçamento mínimo entre indentes de cinco micrômetros para cada linha. Quando o lote for concluído, o nanoindente criará indentes fiduciais com uma carga máxima de 100 milinewtons no primeiro e no último indente, os quais devem estar localizados no epóxi antes da camada de anoe e após a camada óssea, respectivamente.

Após a nanoindentação, coloque a amostra de volta na solução de PBS para evitar desidratação adicional. Fixe rigidamente a amostra de modo que a dimensão mais longa fique paralela ao detector. Após configurar o scanner, prenda a amostra montada na platina do scanner utilizando materiais transparentes aos raios X, como isopor e parafina.

Posicione a amostra de modo que ela fique no centro de rotação. Durante toda a varredura, selecione a resolução mais alta que permita que toda a escala esteja no campo de visão, que neste caso é de 7,5 micrômetros. Após a aquisição dos dados, reconstrua as imagens de projeção de raios X para criar um conjunto de dados contendo imagens em corte transversal.

Em seguida, utilize o software para obter a imagem final em escala de cinza 3D. Ajuste a faixa de cinza a um nível apropriado para remover os artefatos provenientes do isopor e do paraform. Para a microscopia eletrônica de varredura (MEV) ou obtenção de imagens de microindentações na amostra polida, fixe a amostra em um suporte para MEV utilizando fita de carbono dupla-face, com a superfície indentada voltada para cima. Em seguida, coloque o espécime na câmara do MEV e bombeie a câmara para o modo de baixo vácuo.

Ajuste a distância de trabalho entre 3,0 e 5,0 milímetros. Ative a alta tensão e navegue até as regiões de interesse no espécime, que neste caso são as estruturas presentes nas camadas de anoe e osso. Em seguida, obtenha imagens com alta tensão entre cinco quilovolts e 15 quilovolts e uma corrente de feixe mais baixa de 3,9 nanoampères.

Para melhorar a resolução, capture imagens de pelo menos três regiões de interesse com aumentos entre 250 x e 10.000 x, utilizando o detector de elétrons retroespalhados BSE em vácuo baixo para auxiliar na identificação de alterações no conteúdo e na densidade de biominerais. Em seguida, navegue até uma região de interesse no espécime polido que inclua uma grade de nanoindentação indicada por marcas fiduciais no final de cada linha de indentações. Certifique-se de que a tensão alta esteja de pelo menos 15 quilovolts.

A corrente do feixe é de pelo menos 3,9 nanoampères, e a distância de trabalho é maior que 5,0 milímetros. Em seguida, capture a imagem de elétrons retroespalhados da região a ser analisada utilizando EDX. Utilizando o software de análise por EDX.

Capture a mesma imagem para auxiliar na localização das áreas onde será realizada a análise química ao longo da linha de reentrâncias. Em seguida, utilizando a técnica de análise em linha, posicione uma linha para realizar a análise química ao longo da linha de interesse das reentrâncias, começando na primeira reentrância e terminando na última. Especifique o número de pontos de análise a serem colocados ao longo da linha, utilizando o mesmo número de reentrâncias presentes, a fim de proporcionar uma correlação espacial direta entre a composição química e as propriedades mecânicas.

Quando a linha estiver posicionada e os pontos forem especificados corretamente, inicie a análise da linha utilizando o software EDX. Após a conclusão da análise da linha, identifique os elementos de interesse a serem quantificados a partir dos espectros pontuais obtidos ao longo da linha especificada na superfície polida do espécime.

Uma vez identificados os elementos de interesse, realize uma calibração de fundo para levar em conta a radiação de bremsstrahlung e outros efeitos. Escolha a opção de análise de desconvolução do software para obter uma análise quantitativa em cada ponto ao longo da linha especificada, a fim de quantificar a composição química em cada ponto. Por fim, salve os resultados da análise química quantitativa juntamente com a imagem da linha especificada que foi analisada, para auxiliar na correlação espacial com as propriedades mecânicas medidas por nanoindentação na camada anoe; a nanoindentação calculou um módulo médio de 69,0 giga pascals e dureza de 3,3 giga pascals.

A nanoindentação determinou um módulo médio de 14,3 gigapascals e dureza de 0,5 gigapascals para a camada óssea. A camada de anoe e a camada óssea apresentam diferenças quantificáveis na composição química. O pico de carbono na camada óssea pode ser atribuído à baixa mineralização, o que resulta em aumento de carbono e diminuição do brilho na imagem BSE. Os espectros FTIR das camadas óssea e ENE mostram assinaturas de hidroxiapatita na camada externa de gwe e assinaturas de colágeno na camada óssea interna.

A tomografia computadorizada por raios X mostra que a camada de gwe não cobre a camada óssea nas regiões onde as escamas se sobrepõem. As camadas de gwe em tons mais claros de cinza são mais densas, mais duras e mais rígidas, enquanto as camadas ósseas em tons mais escuros de cinza são menos densas e menos rígidas. São observados poros evidentes próximo ao centro da camada ging, o que demonstra sua não uniformidade.

A imagem de MEV de menor aumento da superfície de fratura gravada revelou nanoestruturas organizadas em um padrão estratificado para a camada de gengiva, o que se correlaciona com o FTIR. As imagens de MEV de maior aumento da superfície de fratura gravada mostram nanobastões orientados na camada de gengiva, enquanto uma nanoestrutura semelhante a fibras é observada na camada óssea após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisas adicionais sobre biomateriais e materiais compósitos, para estudar a distribuição espacial da composição química, estrutura e propriedades mecânicas, além de analisar as interfaces em materiais compósitos multifásicos. Pronto, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar espécimes e realizar análises para correlacionar espacialmente a composição química com a estrutura e as propriedades mecânicas em biomateriais estruturais.

Essas técnicas também são aplicáveis e adaptáveis para o estudo de outros tipos de materiais multifásicos heterogêneos.