In Vitro Agregação ensaios utilizando hiperfosforilada Tau Protein

O objetivo geral deste procedimento é monitorar e comparar a cinética de agregação de espécies de proteína tau não modificadas e hiperfosforiladas. Isso é feito primeiro gerando proteína tau não modificada e hiperfosforilada pelo sistema catalisador assistido por zíperes. O segundo passo é configurar os ensaios de agregação para serem adequados para qualquer um dos dois instrumentos diferentes.

O processo de agregação de tau é monitorado pela fluorescência de dois tio diferentes. A flavina morre, a flavina S e a flavina T. A etapa final é traçar e comparar as curvas de agregação. Em última análise, as mudanças cinéticas da fluorescência da tioflavina da ligação às espécies agregadas de TA são usadas para mostrar o aumento dependente da hiperfosforilação da fibrilação tau in vitro.

Olá, bem-vindo ao nosso artigo JOV. Ensaios de agregação in vitro usando a proteína hiperfosfotau. Meu nome é Minko, e os experimentos serão conduzidos e demonstrados por caminho.

E para este protocolo, um buffer de agregação razoavelmente novo feito no último mês. Pouco antes de seu uso, adicione DIO três etol a um milimolar também necessário Um chá Theo Flavin filtrado ou solução estoque S. Hein stock, armazenável a menos 20 graus Celsius e proteína de toalha armazenada a menos 80 graus Celsius.

Puxe a toalha no gelo e ajuste sua concentração usando o tampão de agregação conforme necessário para consistência. Gire a toalha com tampão de agregação e 20.800 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Agora transfira o supinato para outro tubo e mantenha-o no gelo até a hora de montar a reação de agregação.

Configure a mistura de agregação em tubos microcêntricos de 1,5 mililitro. De acordo com a tabela, 100 microlitros são suficientes para uma alíquota de reagentes. Calcule o volume total com base no número de reações e aumente-o em 10% para levar em conta os erros de pipetagem.

A pimenta pode ser substituída por ácido raônico ou tampão de agregação, se necessário. Misture as reações por inversão e transfira-as para 37 graus Celsius sem vegetação. A cada 24 horas, reabasteça as reações com um milimolar suplementar de TDT para garantir um ambiente redutor para medir a fluorescência.

Aqueça o fluorímetro de espectros por cerca de 10 minutos. Isso melhorará a consistência das medições no software do computador. Selecione o modo de exibição em tempo real encontrado no centro de controle do instrumento.

Defina o comprimento de onda de excitação para 450 nanômetros com a fenda em dois nanômetros e defina o comprimento de onda de emissão para 510 nanômetros com a fenda de cinco nanômetros. Em seguida, retorne ao centro de controle do instrumento e escolha a análise de comprimento de onda constante. Pressione a tecla adicionar no quadro superior para adicionar um conjunto de comprimentos de onda.

Defina os parâmetros de aquisição do erro padrão para um e as tentativas máximas para três. Em seguida, clique em adicionar. Em seguida, clique em ir para abrir a janela de exibição de dados.

Agora, na janela de exibição de dados, clique em iniciar ato para abrir a nova caixa de diálogo de amostra e escolha desconhecido para o tipo de amostra. Em seguida, prepare as reações para fazer medições a cada 100 microlitros a 98. Microlitros de tampão de agregação e dois microlitros de três milimolares de flavina S ou T pipetam a mistura várias vezes para garantir uma boa mistura.

Transfira todos os 200 microlitros de uma mistura para um FA três qve e carregue-o na posição. Em seguida, lamba para coletar os dados de fluorescência Depois de remover a solução do veterinário, lave-a três vezes com água destilada e seque-a em uma corrente de ar. Este ensaio inclui o corante fluorescente na reação de aion, o que permite medições contínuas e é melhor feito com um leitor automático de placas de fosco.

Um parâmetro regular para também funciona é limitado pela velocidade da operação manual. Configure a mistura de agregação em uma placa preta opaca de 96 poços. Com 360 microlitros, um poço volume, 200 microlitros é suficiente para cada medição pontual.

Misture bem cada reação com pipetagem. Incube a placa de 96 poços a 37 graus Celsius e a cada 24 horas adicione um milimolar suplementar de TDT para garantir um ambiente redutor em cada ponto de tempo. Para uma medição, ligue o leitor de microplacas multimodo e o computador com pelo menos 10 minutos de antecedência no software do computador.

Defina a temperatura para 37 graus Celsius e selecione o modo de intensidade de fluorescência. Em seguida, defina o comprimento de onda de excitação para 450 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para cinco e 10 nanômetros. Insira a placa de 96 poços no sorteio e pressione a tecla de leitura.

Depois de fazer as medições, retorne imediatamente a placa à incubadora antes de analisar os dados, o ensaio de modo contínuo pode ser realizado usando um espectrofotômetro compacto para este ensaio. Configure a mistura de agregação em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Reações de 200 microlitros são suficientes para medir um ponto no tempo.

Inverta os tubos para misturar. Configure as reações a 37 graus Celsius ou à temperatura ambiente e adicione um milimolar suplementar de TDT a cada 24 horas para fazer as medições. Configure o urômetro e o software como feito para o ensaio de terminal sem matriz.

Transfira toda a mistura para um veterinário e posicione-a no porta-amostras no compartimento de amostras e feche a tampa. Clique em executar para coletar os dados de fluorescência nos intervalos de tempo apropriados. Se esse intervalo for curto, como 30 ou 60 segundos, não há problema em deixar o veterinário Q na máquina entre as medições até que o último ponto de tempo seja atingido.

Retorne a reação do vete para seu tubo de amostra e retorne o tubo para a incubadora Quando concluído. Incline o vete conforme instruído anteriormente usando tau e P tal recombinantes. Dois protocolos diferentes foram estabelecidos para comparar a cinética de agregação de tau e p tal, aproveitando a forte emissão fluorescente das flavinas t e s ao se ligarem a agregados de proteínas amilóides, incluindo tau e p tal, com ou sem o corante fluorescente.

Na reação de agregação, houve aumento consistente da agregação tau por hiperfosforilação. Normalmente, as ligas T e P tal aumentam rapidamente nos primeiros 30 minutos antes de uma desaceleração significativa, incluindo a flavina. T nas reações de agregação causam retardo significativo na taxa de agregação.

Tanto Theof Flavian s quanto t se aproximaram de um platô após reagir por 160 minutos. A bioflavina s, por outro lado, não causou uma desaceleração apreciável da agregação. Após este procedimento, sistema nervoso central adicional a isoformas ou outras proteínas propensas à agregação na neurodegeneração, como pode ser realizado usando o ensaio para entender a contribuição da proteinização na patogênese após seu desenvolvimento.

Esta técnica de preparação de uma forma de hiper fosfato top protein PA para pesquisa no campo, inúmeras doenças para explorar nossa terapêutica e desenvolvimento de medicamentos.