Cuidados básicos e manutenção de galinhas

Basic Chick Care and Maintenance
JoVE Science Education
Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
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JoVE Science Education Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick
Basic Chick Care and Maintenance

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06:42 min
April 30, 2023

Overview

Os pintinhos (Gallus gallus domesticus) são uma valiosa ferramenta de pesquisa, não apenas para estudar conceitos importantes no desenvolvimento de vertebrados, neurociência e biologia tumoral, mas também como um sistema eficiente para propagar vírus. Embora os ovos possam ser adquiridos de fornecedores externos e trabalhar com filhotes requer muito pouco equipamento especializado, é necessário um entendimento dos procedimentos adequados de manuseio para o desenvolvimento normal de embriões.

Este vídeo fornecerá uma visão geral dos princípios de manuseio de ovos, incluindo uma explicação dos parâmetros de incubação que podem impactar profundamente o desenvolvimento: temperatura, umidade e rotação de ovos. A maioria dos experimentos que usam ovos de galinha requer acesso ao embrião dentro da casca, que é conseguido cortando um pequeno buraco selável, ou “janela”. Esse processo é descrito em detalhes passo a passo, juntamente com várias outras técnicas essenciais para trabalhar com filhotes, como candling e injeção de tinta na Índia. Finalmente, o vídeo revisará algumas aplicações práticas dessas técnicas básicas em pesquisas científicas avançadas.

Procedure

Os embriões de frango são um ótimo modelo para estudar o desenvolvimento precoce de vertebrados, em parte porque são fáceis e baratos de manter. Ao contrário da maioria dos organismos modelo, que são criados em laboratório, ovos de galinha fertilizados são comprados de um fornecedor externo. Além disso, manter e trabalhar com os ovos requer muito pouco equipamento especializado. Este vídeo fornecerá um background geral sobre a aquisição e manutenção de ovos de pintinhos, técnicas essenciais para o desenvolvimento de embriões e algumas aplicações práticas desses métodos.

Antes de discutirmos trabalhar com filhotes no laboratório, vamos rever como as galinhas cuidam de seus ovos em casa. Embora os ovos já sejam fertilizados quando colocados, o desenvolvimento de filhotes pára quando os ovos são expostos a temperaturas externas mais frias. Depois de colocar cerca de 12 ovos, a galinha se senta no ninho para retomar o desenvolvimento de embriões. Durante sua incubação, a galinha irá girar os ovos para aquecê-los uniformemente e evitar que o embrião grude na casca. Se tudo correr bem, 21 dias depois, a mãe tem uma ninhada de garotas.

Então, como os cientistas coletam ovos suficientes para seus experimentos? Micrômetro… que poderia levar um tempo. Como as galinhas são amplamente domesticadas, os ovos fertilizados podem ser facilmente obtidos de um incubatório ou fazenda de criação. Os ovos podem até ser encomendados em estágios específicos de desenvolvimento.

Uma vez que os ovos tenham chegado ao laboratório, eles podem ser armazenados a 13 – 16 °C por até 5 dias. Quando estiver pronto para que eles se desenvolvam, deixe os ovos aquecerem à temperatura ambiente, depois transfira-os para uma incubadora de balanço a 37 °C com 60% de umidade até chegarem ao estágio desejado.

A maioria dos experimentos realizados em filhotes requer alguns passos preparatórios, como verificar se os óvulos que você recebeu foram fertilizados em primeiro lugar. Uma abordagem fácil é usar uma fonte de luz brilhante ou caixa de velas para iluminar o ovo. Utilizando essa técnica, conhecida como candling, estruturas internas como vasos sanguíneos podem ser visualizadas para confirmar que um embrião está presente.

Deixar o ovo intacto melhora a sobrevivência dos filhotes, mas a casca impede o acesso ao embrião. Para resolver esse problema, os pesquisadores usam uma técnica chamada janelas.

Comece colocando os ovos de lado e marcando a parte superior para identificar o lado para o qual o embrião irá subir. Para evitar danos à gema durante o corte de uma janela, uma pequena quantidade de albumina, ou clara de ovo, é removida para baixar o embrião para longe da casca. Para isso, esterilize primeiro a casca limpando-a com 70% de etanol. Depois que a casca secar, suavize um pedaço de fita sobre a extremidade cega do ovo. Em seguida, use uma agulha estéril para perfurar a fita e a casca. Insira a agulha para baixo para evitar danificar a gema e remova 5 ml de albumina. Por fim, para evitar o vazamento de albumina, sele o orifício com outro pedaço de fita.

Para cortar a casca, coloque um pedaço de fita sobre a área que você planeja janela. Usando uma tesoura, faça um pequeno buraco na casca e comece a cortar uma abertura circular. Durante esse processo, a fita evitará que fragmentos de concha caiam sobre o embrião.

Mesmo após a janela, embriões em estágio inicial podem ser difíceis de visualizar devido ao seu pequeno tamanho e transparência. Para melhorar o contraste entre o embrião e a gema, pode-se usar tinta não tóxica da Índia diluída. A tinta é injetada na gema sob o embrião e permitida a difusão. O embrião agora pode ser visto em maior contraste contra o fundo escuro. Após manipulações experimentais, a janela deve ser recados com fita adesiva e o ovo colocado de volta na incubadora.

Agora que você está familiarizado com técnicas básicas para trabalhar com ovos, vamos ver como esses métodos são usados para realizar experimentos em embriões de frango.

Para começar, o candling pode ser usado para identificar a localização de estruturas embrionárias em ovos intactos. Por exemplo, as membranas extraembriônicas do embrião de frango são comumente usadas para a propagação de vírus. Para infectar a membrana, o candling é realizado para localizar a interface entre a cavidade allantóica e o saco de ar, a fim de injetar vírus diretamente na cavidade allantónica sem danificar o embrião. Após alguns dias de incubação, um grande número de partículas virais pode ser colhido do fluido allantóico.

A janela de ovos é uma prática extremamente útil, pois permite o acesso ao embrião para experimentação. Muitos experimentos começam com a entrega de DNA em tecidos específicos via microinjeção. Os eletrodos são então colocados ao redor do tecido de interesse e um campo elétrico é aplicado para permeabiliizar temporariamente a membrana celular e conduzir os ácidos nucleicos para dentro da célula.

Ao realizar experimentos em embriões precoces, a injeção de tinta da Índia é especialmente útil para visualizar tecidos transparentes. Aqui, o contraste melhorado permite que os pesquisadores microinjetem uma solução de DNA em domínios de tecidos refinados. Em última análise, essa técnica pode produzir células rotuladas individualmente, que podem ser monitoradas ao longo do tempo para rastrear divisões celulares.

Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a manutenção de garotas. Esta apresentação abordou o manuseio básico e a manutenção de ovos de galinha, técnicas comuns para trabalhar com filhotes e alguns exemplos de como esses métodos são aplicados em pesquisas biológicas. Obrigado por assistir!

Transcript

Chicken embryos are a great model for studying early vertebrate development, in part because they are easy and inexpensive to maintain. Unlike most model organisms, which are bred in the lab, fertilized chicken eggs are purchased from an external supplier. Additionally, maintaining and working with the eggs requires very little specialized equipment. This video will provide general background on the acquisition and maintenance of chick eggs, techniques essential to working with developing embryos, and some practical applications of these methods.

Before we discuss working with chicks in the lab, lets review how hens care for their eggs at home. Although eggs are already fertilized when they are laid, chick development stops when the eggs are exposed to colder external temperatures. After laying about 12 eggs the hen sits on the nest to resume embryo development. During their incubation, the hen will rotate the eggs to warm them evenly and prevent the embryo from sticking to the shell. If all goes well, 21 days later, mom has herself a brood of chicks.

So how do scientists collect enough eggs for their experiments? Um… that could take a while. Because chickens are widely domesticated, fertilized eggs can be easily obtained from a hatchery or breeding farm. Eggs can even be ordered at specific developmental stages.

Once eggs have arrived in the lab, they can be stored at 13 – 16 °C for up to 5 days. When you’re ready for them to develop, allow the eggs to warm to room temperature, then transfer them to a rocking incubator at 37 °C with 60% humidity until they’ve reached the desired stage.

Most experiments performed on chicks require a few preparatory steps, like checking if the eggs you received were fertilized in the first place. An easy approach is to use a bright light source or candler box to illuminate the egg. Using this technique, known as candling, internal structures such as blood vessels can be visualized to confirm that an embryo is present.

Leaving the egg intact improves chick survival, but the shell prevents access to the embryo. To crack this problem, researchers use a technique called windowing.

Begin by laying the eggs on their side and marking the top to identify the side to which the embryo will rise. To prevent damage to the yolk while cutting a window, a small amount of albumin, or egg white, is removed to lower the embryo away from the shell. To do this, first sterilize the shell by wiping it down with 70% ethanol. After the shell has dried, smooth a piece of tape over the blunt end of the egg. Then, use a sterile needle to pierce the tape and shell. Insert the needle downwards to avoid damaging the yolk and remove 5 ml of albumin. Lastly, to prevent leakage of albumin, seal the hole with another piece of tape.

To cut the shell, place a piece of tape over the area you plan to window. Using a pair of scissors, make a small hole in the shell and begin to cut a circular opening. During this process, the tape will prevent fragments of shell from falling onto the embryo.

Even after windowing, early stage embryos can be hard to visualize due to their small size and transparency. To improve contrast between the embryo and yolk, diluted, non-toxic India ink can be used. The ink is injected into the yolk under the embryo and allowed to diffuse. The embryo can now be seen in higher contrast against the dark background. Following experimental manipulations, the window should be resealed with tape and the egg placed back into the incubator.

Now that you’re familiar with basic techniques for working with eggs, lets see how these methods are used to conduct experiments on chicken embryos.

To start, candling can be used to identify the location of embryonic structures in intact eggs. For example, the extraembryonic membranes of the chicken embryo are commonly used for the propagation of viruses. To infect the membrane, candling is performed to locate the interface between the allantoic cavity and the air sac, in order to inject virus directly into the allantoic cavity without damaging the embryo. After a few days of incubation, large numbers of viral particles can be harvested from the allantoic fluid.

Egg windowing is an extremely useful practice as it permits access to the embryo for experimentation. Many experiments begin with the delivery of DNA into specific tissues via microinjection. Electrodes are then placed around the tissue of interest and an electric field is applied to temporarily permeabilize the cell membrane and drive the nucleic acids into the cell.

When conducting experiments on early embryos, India ink injection is especially useful for visualizing transparent tissues. Here, the improved contrast allows researchers to microinject a DNA solution into refined tissue domains. Ultimately, this technique can produce individually labeled cells, which can be monitored over time to track cell divisions.

You’ve just watched JoVE’s video on chick maintenance. This presentation has covered basic handling and maintenance of chicken eggs, common techniques for working with chicks and some examples of how these methods are applied in biological research. Thanks for watching!