Name: NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Aprenda a manipular moléculas individuais de RNA usando pinças ópticas para estudar o dobramento em níveis estruturais secundário e terciário. Esta técnica permite avaliar interações moleculares com resolução de piconewtons.

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Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da NSF (MCB-1054449) e um prêmio colaborativo do Programa de Pesquisa Piloto interdisciplinar do Instituto de RNA da Universidade de Albany para PTXL.

1 Preparação de RNA Moléculas por uma única molécula Arrancar <ol><li> A clonagem da sequência de interesse. Clonar a sequência de ADN correspondente à estrutura de ARN em um vector. </li><li> Síntese e purificação de molde a transcrição. Sintetizar um molde por PCR de transcrição. [Tabela 1 aqui lugar] Em seguida, purificar os produtos de PCR, utilizando um kit de purificação de PCR, e concentrar a amostra para&gt; 200 ng / mL. Uma vez que o ADN purificado é usado para a transcrição, de RNase isenta de água deve ser utilizada nos passos de eluição e de concentração. </li><li> Transcrição in vitro. Sintetizar ARN por transcrição in vitro a 37 ° C durante a noite para maximizar o rendimento de ARN. [Lugar tabela 2 aqui] Após a transcrição, adicionar 1 ml de DNase I para digerir o ADN molde durante 15 minutos a 37 ° C. Purifica-se o ARN, utilizando uma coluna de sílica de centrifugação. </li><li> Síntese da pega biotinilado A. Em primeiro lugar, produzir o punho não modificado A por PCR utilizando iniciadores e Af Ar e concentrate o DNA amplificado a&gt; 200 ng / mL. Em seguida, incorporar modificações biotina no produto de PCR utilizando uma reacção de extensão do iniciador. [Tabela 3 aqui lugar] NOTA: O identificador biotinilada (biotina-HA) pode ser utilizado directamente no recozimento sem purificação. Como a biotina-HA é para ser recozido com ARN, é crítica a utilização de RNase isenta de água em ambos os passos. </li><li> Síntese da pega modificada com digoxigenina B. sintetizam digoxigenina modificado pega B (dig-HB) por PCR utilizando o iniciador oligo Bf e modificado com digoxigenina Dig-Br (Figura 3). Em seguida, purificar o produto de PCR e concentrar a amostra para&gt; 200 ng / mL. </li><li> RNA Annealing para as alças. Recozimento a RNA com alças. [local tabelas 4 e 5 aqui] </li><li> Purificar amostra recozido. Adicionar 3 volumes de etanol a amostra tratada termicamente e misturar bem. Armazenar a mistura a -70 ° C durante pelo menos 1 hr. Girar a 15.800 xg e elimine o sobrenadante. Seca-se o sedimento utilizando um liofilizador. Dissolve-se o sedimento em100 RNase água livre l. NOTA: A amostra está pronta para ser utilizada e pode ser armazenada a -20 ° C. </li></ol> 2. Calibração e Operação das Pinças ópticas <ol><li> Calibrar Tamanho do Pixel do Monitor de Vídeo <ol><li> Use a armadilha óptica para prender um cordão com diâmetro conhecido (tamanho padrão). </li><li> Capturar imagens de um cordão preso usando software de imagem (Figura 4). </li><li> Determinar o diâmetro do grânulo utilizando o software de imagem com base no método do centróide. </li><li> Repita este procedimento para determinar diâmetros de gotas de tamanho diferente. </li><li> Montar os diâmetros medidos e conhecidos dos grânulos por uma regressão linear para se obter o tamanho físico de um pixel. </li></ol></li><li> Verifique Calibração Distância <ol><li> Use a armadilha óptica para prender um cordão. </li><li> Determinar a posição do pixel de seu centróide pelo software de captura de imagem e gravar a sua posição utilizando as Minitweezers. </li><li> Orientar o talão de dife<html> alugar posições e repita a determinação da posição. </li><li> Converter as posições X e Y do cordão de pixels para m unidade usando o tamanho do pixel calibrado. </li><li> Comparar o X e Y entre as posições medidas pelo vídeo e pelas Minitweezers. Os dois conjuntos de valores devem concordar. Como a resolução da imagem é&gt; 0,1 mícron, mova o talão sobre 1 mícron entre as medidas para garantir a precisão. Se a calibração de distância não é comparável com a armazenada nas Minitweezers, recalibrar o instrumento. </li></ol></li><li> Calibração Rigidez Armadilha <ol><li> Capturar um talão usando a armadilha óptica e segurá-la ainda. </li><li> Grave a força da armadilha usando um bypass aquisição rápida de dados a uma taxa&gt; 5 kHz por 3 seg. </li><li> Gerar um espectro de energia a partir da gravação do movimento talão usando software. Monte o espectro de potência de um Lorentz (Figura 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Eq. 1) em que a S (f) é a potência à frequência de f, f c é a frequência de corte, e S é 0 a poder assintótica. A freqüência de canto, f c, é a freqüência em que o poder do movimento térmico diminuiu para metade do valor assintótico. Como f c varia com a potência do laser e o tamanho do grânulo, calibrar cada talão prendido individualmente. </li><li> Calcula-se a constante de mola da armadilha, κ, a partir de f c: <img alt="Equação 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Equação 2.) em que γ é o coeficiente de arrasto do talão (Equação 3.). Use a constante da mola para determinar as mudanças de extensão de um RNA de mudança vigor. </li></ol></li><li> Stokes Lei teste <ol><li> Capturar um talão usando a armadilha óptica. Mova o talão de vai-e-força em velocidade diferente. </li><li> Gravar o movimento do cordão de forçar e usando as Minitweezers. </li><li> Calcula-se o raio da pérola. NOTA: A força de atrito, F d, gerada pelo movimento de uma partícula esférica num fluido pode ser descrito pela Lei de Stokes: <img alt="Equação 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (Equação 3.) em que r é o raio da esfera, v é a velocidade, e h é a viscosidade dinâmica do fluido, o que pode ser visto na tabela de referência. Usando a força medidos como F d, o raio da esfera pode ser calculado usando a Equação. 3 (Figura 6), e deve de acordo com o determinado pelo software de aquisição de imagem. Teste lei de Stokes testa efetivamente as calibrações eo desempenho geral do instrumento. </li></ol></li></ol> 3. NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas <ol><li> Fazendo fluídica. <ol><li> Perfurar seis furos (2 mm de diâmetro cada) em uma tampa de vidro No. 2 (Figura 7a) e cortou três fendas (largura 2 mm) em poliimida fita dupla face (Figura 7b), utilizando um gravador laser. </li><li> Faça uma câmara de fluxo imprensando dois tampa de vidro com duas camadas de fita dupla face Kapton. Insira uma micropipeta e dois tubos de desvio entre a fita (Figura 7c). </li><li> Montar a câmara de fluxo para uma estrutura de metal, combinando furos fluídicos (Figura 7d). </li><li> Ligue os canais fluídicos da câmara de 10 ml cheias com tampão de escolha através de tubos de polietileno (Figura 7e). </li><li> Monte a câmara inteiro para as pinças ópticas entre os dois objetivos. Assegurar que o lado frontal da câmara, com os canais fluídicos enfrenta à direita. Recolha o objetivo certo e ligue os pinos de metal do quadro (Figura 7e) para furos de montagem na tele pinça. Aperte os parafusos para fixar a posição da câmara. </li></ol></li><li> Misturar a amostra e os grânulos recozido. Misturar a amostra recozida com contas de anti-digoxigenina-revestidos (DIG-esferas), e deixe a mistura ficar em temperatura ambiente por 5-10 min. Tipicamente, 1 mL de amostra recozida é misturada com 5 ul DIG-pérolas em 1 ml de tampão. NOTA: A quantidade de pérolas a ser carregado para dentro da câmara de fluxo deve ser escolhido para assegurar uma razoável quantidade de pérolas a ser entregue a partir do tubo de bypass. A razão entre a amostra recozida a os grânulos não podem ser facilmente quantificadas. Num caso ideal, a maioria dos grânulos não têm ARN de tal modo que apenas uma pequena fracção dos grânulos pode ter apenas uma molécula de ARN por pérola. À medida que as amostras tratadas e da suspensão de esferas são difíceis de quantificar, o melhor e única forma actualmente é variar a razão de mistura e de testar a mistura sobre as pinças. </li><li> Entregar grânulos para o local de reacção na câmara de fluxo (isto é, alguns micrômetros no topo da miponta cropipette, Figura 7c). <ol><li> Carregar uma suspensão de grânulos revestidos com estreptavidina (strep-esferas) para uma seringa de 1 ml. </li><li> Ligar a seringa para a tubagem que conduz fluídica com o canal inferior da câmara de fluxo (Figura 7a). </li><li> Empurre a seringa para escoar a strep-grânulos para a câmara. </li><li> Mover toda a câmara através de software de controlo do motor para colocar a armadilha óptica perto da abertura do tubo de derivação de fundo (Figura 7b). Em seguida, operar a armadilha óptica por um trackball para capturar um strep-pérola. </li><li> Mover o grânulo perto da ponta da micropipeta, utilizando o software de controlo do motor. </li><li> Puxar a seringa ligada à micropipeta para sugar o grânulo em micropipeta. </li><li> Aplicar fluxo suavemente pressionando a seringa no canal do meio para expulsar strep-contas extras. </li><li> Da mesma forma, entregar a mistura de amostra e os DIG-contas (veja o passo 3.2) para o topo do canal da câmara. </li><li> Capture uma dig-pérola e trazê-lo perto do strep-talão usando a armadilha óptica. </li><li> Limpar o canal por meio da aplicação do fluxo. NOTA: O Streptomyces e DIG-grânulos são escolhidos para ter tamanhos diferentes, de modo que eles podem ser distinguidos visualmente sob o ponto de vista microscópico (Figura 4). </li></ol></li><li> Pesca &quot;uma única molécula de amarrar entre um par de esferas. <ol><li> Coloque a escavação talão verticalmente na parte superior do grânulo-strep (Figura 4). </li><li> Mova o dig-talão para baixo para o strep-pérola, orientando a armadilha. Abra uma janela de plotagem força-distância no computador para visualizar as alterações de força. </li><li> Em contacto das duas esferas, mova a dig-talão verticalmente longe do strep-pérola. </li><li> Se nenhum contato específico é feito, a força permanece quase zero. Se as duas esferas estão ligados por moléculas, a força aumenta significativamente quando as duas esferas de separar. Este procedimento, comumente referido como &quot;fishing&quot;, é muitas vezes perfvárias vezes ORMED em cada par de esferas para encontrar uma solução eficaz única molécula de tirante. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

<html> Modificação e solução de problemas em Preparação de Amostras de pinça Escolha da Vector Clonagem. Embora o esquema geral descrito aqui (Figura 3) não necessita de um vector especial de clonagem, o vector é preferível não ter intrínseca T7 ou T3 promotor para a facilidade de transcrição de tal modo que um promotor pode ser introduzido, através de PCR nas posições desejadas. Seqüência e comprimentos das alças.</e...

O desenvolvimento da técnica de pinças ópticas tem sido acompanhada com a sua aplicação no domínio da investigação biológica. Quando o efeito de captura óptica foi descoberto pela primeira vez, Arthur Ashkin observado que as bactérias em água contaminada pode ser preso no foco do laser 1. Desde então, as bactérias trapping tornou-se um involuntário, experiência divertida para gerações de estudantes de biofísica, bem como uma ferramenta de pesquisa séria para estudar a fisiologia microbiana 2,3. A técnica de captura óptica usa raio laser focado para imobilizar um objeto microscópico 1. Na prática, uma série de funções de armadilha de laser como uma fonte óptica, que também mede a força (F) sobre o objecto preso pelo seu deslocamento a partir do centro da armadilha (AX). Dentro de um curto intervalo, F = κ x AX, em κ é a constante da mola de prender. A armadilha óptica pode ser utilizado para exercer uma força em piconewton (pN) de precisão para uma microscopic objeto e medir a sua posição com nanômetros (nm) de precisão. Nas últimas duas décadas, pinças ópticas tornaram-se uma das técnicas de moléculas individuais mais utilizados em biofísica. A técnica tem sido utilizada para estudar e dobragem mecânica de ADN de 4-6, 7-9 de ARN, e proteínas de 10,11. As pinças ópticas também têm sido utilizados para observar a replicação de DNA de 12, a transcrição do RNA 13, e a síntese de proteínas 14,15, bem como muitos outros eventos biomoleculares 16-18. Abordagens de moléculas individuais são empregadas na pesquisa estrutural RNA principalmente para explorar a paisagem de energia dobrável robusto de RNA. Uma seqüência de RNA geralmente pode dobrar em várias estruturas, que se excluem mutuamente estáveis, devido às regras de composição química e desbastes de base simples de RNA. Tem sido conhecido que o polimorfismo de ARN, como a que ocorre em riboswitches 19,20, desempenha um papel importante na regulação de genes. A recent levantamento de todo o genoma revelou que as variações de temperatura tão pequenas como alguns graus influenciar grandemente a estrutura e síntese de proteínas de grande parte do transcriptoma celular 21. Este exemplo sugere que o papel biológico de alternativa dobrar RNA é talvez mais importante e abrangente do que o suposto anteriormente. Polimorfismo estrutural, no entanto, representa um desafio para as abordagens tradicionais bioquímicos e biofísicos, que examinam as propriedades médias de muitas moléculas. Por exemplo, o &quot;on&quot; e conformações &quot;off&quot; de uma riboswitch são mutuamente exclusivas. Uma estrutura média derivada de estruturas heterogéneas não é provável que se assemelham a um dos confórmeros biologicamente relevantes. Além disso, o ARN não traduzida do mRNA e geralmente formar estruturas. Sua interação com proteínas e RNAs regulatórios comumente requer desdobramento da estrutura existente, como parte da interação. Portanto, estudar RNA desdobramento / redobramento se torna um pertinenteemissão de biologia ARN. Para atender a este desafio, foi empregue uma abordagem única molécula de ARN de desvendar polimorfismo estudando uma molécula de cada vez 22-27. Em comparação com o método popular de fluorescência única molécula, com base pinça mecânica desdobramento oferece uma vantagem que as conformações das moléculas individuais podem ser manipulados pela força aplicada e ser medido com uma precisão nanométrica. Esta capacidade nanomanipulação pode ser utilizado para monitorar o desdobramento / dobragem de domínios estruturais individuais de tal modo que a dobragem hierárquica de um grande de RNA podem ser dissecados 28. Alternativamente, um único filamento pode ser dirigido a dobrar-se em um dos diversos confórmeros; ou uma estrutura existente pode ser induzida mecanicamente para redobrar a uma conformação diferente 29. Sob condições biológicas, uma estrutura de ARN podem ser alterados em caso de alteração da temperatura ou a ligação do ligando. A capacidade de manipular diretamente s molecularestructure abre um novo espaço de estudo estrutural RNA. Em princípio, outras técnicas mecânicas, tais como microscopia de força atómica e pinças magnéticas, também podem ser usadas para estudar dobra de moléculas de ARN individuais. No entanto, essas aplicações são limitadas em grande parte devido à relativamente baixa resolução espacial de 30. O emprego de pinças ópticas permite que estruturas de RNA a ser desdobrada pela força mecânica. A vantagem mecânica desdobramento é várias vezes. Força pode ser usado para desdobrar as estruturas tanto secundárias e terciárias, enquanto íons de metal e ligante induzida dobrável são principalmente limitado a estruturas terciárias. Temperatura e desnaturante pode afetar significativamente as atividades de água e solutos. Em contraste, a força é aplicada localmente para perturbar as estruturas moleculares; o efeito da força sobre o meio ambiente é insignificante. Além disso, a fusão térmica é melhor usado para estudar termodinâmica dobragem de pequenas estruturas de ARN,Considerando que as pinças ópticas têm sido utilizadas para o estudo das estruturas de ARN com vários tamanhos, que vão desde um de sete pares de bases tetraloop grampo 28 para um ribozima 400 nucleótidos 31. Além disso, as estruturas de ARN pode ser desdobrada mecanicamente a temperaturas mesófilas. Em contraste, os ARN de se desdobrar em uma experiência de fusão térmica, a temperatura é normalmente levantada bem acima das temperaturas fisiológicas, o que aumenta significativamente a hidrólise de ARN, especialmente na presença de iões Mg2 +. É importante notar que o efeito da força mecânica depende de como ele é aplicado a uma estrutura. A força aplicada inclina o panorama energético dobrar. Por exemplo, quando a força é aplicada a um gancho de cabelo, as pares de bases são sequencialmente quebrada, um de cada vez (Figura 1-A). O garfo rasgando progride ao longo do eixo helicoidal, que é perpendicular à força aplicada. Em contraste, quando um complexo de beijos mínima está sob tensão, os dois kissingpares de bases, que são paralelas à força aplicada, partilhar a carga de força (Figura 1b). As diferentes geometrias do gancho e kissing relativamente complexo para o resultado a força aplicada na sua resposta mecânica diferentes, que podem ser utilizados para distinguir dobragem secundário e terciário 28,32. O aspecto teórico da mecânica desdobramento foi previamente analisado 8,9,30. Este trabalho descreve as abordagens básicas para configurar e executar uma única molécula de ensaio desdobramento mecânico. Configuração Experimental. Na nossa experiência, puxando mecânica, a amostra de ARN para pinça consiste no ARN de interesse ladeado por duas pegas de ADN / ARN de cadeia dupla (Figura 2) 7. Toda a molécula pode ser amarrado a dois micro-grânulos revestidos de tamanho de superfície (SPHEROTECH) através de estreptavidina-biotina e as interacções de anticorpos anti-digoxigenina-digoxigenina, respectivamente. Um cordão é realizada por um tr óptico de medição de forçaap, enquanto que a outra é mantida na ponta de uma micropipeta. A distância relativa entre os grânulos pode ser alterada por dirigir o movimento da armação ou da micropipeta. Usando esta abordagem, uma única molécula de ARN de amarrar os grânulos pode ser esticado e relaxado. Preparação de Amostras. A síntese das amostras de ARN para pinça inclui alguns passos (Figura 3). Em primeiro lugar, a sequência de DNA correspondente ao RNA de interesse é clonado em primeiro lugar num vector de plasmídeo. Em seguida, três reacções de PCR são realizadas para gerar as duas alças e um molde para a transcrição. O modelo de transcrição engloba as regiões do puxador e as sequências inseridas. O ARN completo é sintetizado por transcrição in vitro. Por último, o ARN e alças quimicamente modificados são hibridados em conjunto para gerar as moléculas de pinça. Calibração e Operação de pinças. O projeto básico do uso Minitweezersd neste trabalho segue a dos dual-feixe de pinças ópticas 33. Com muitos melhoramentos, os Minitweezers exibir extraordinária estabilidade, em comparação com as pinças ópticas da primeira geração. Um certo número de grupos de pesquisa em vários países usam os Minitweezers em sua pesquisa uma única molécula 14,15,34-37. Os detalhes da construção, calibração e operação do dispositivo, incluindo vídeos de instrução, estão disponíveis no site &quot;Pinças Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Aqui, os procedimentos de calibração e as melhorias que precisam ser executadas em bases diárias são descritos em detalhe.

<table><tbody><tr><td>Pinças</td><td>Steven B. Smith Engineering</td><td></td><td><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td></tr><tr><td>Placa de aquisição de dados</td><td>National Instruments</td><td>USB-6351</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vídeo</td><td>National Instruments</td><td>PCI-1407</td><td></td></tr><tr><td>Software de programação Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NI Vision Builder</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gravador a laser</td><td>Epilogue Laser Systems</td><td>Zing-16</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>MEGAclear Life</td><td>Technologies</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-11-UTP</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>FERR0081</tr><tr><td>DNA polimerase T4</td><td>New England Labs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Microesfera revestida com estreptavidina</td><td>Spherotech</td><td>SVP-20-5</td><td></td></tr><tr><td>Microesfera revestida com antidigoxigenina</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>Tamanho padrão microesferas</td><td>Spherotech</td><td>PPS-6K</td><td></td></tr><tr><td>Fita Kapton</td><td>Kaptontape.com</td><td>KPPTDE-1</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura nº 2</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543D</td><td></td></tr></tbody></table>

nanomanipulação de solteiro rna moléculas por pinça óptica

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Uma grande parte do genoma humano é transcrito, mas não traduzidos. Neste pós genómico, as funções reguladoras de RNA foram mostrados para ser cada vez mais importante. Como função de ARN, muitas vezes depende da sua capacidade para adoptar estruturas alternativas, isto é difícil de prever a estrutura tridimensional de ARN directamente a partir da sequência. Uma única molécula de abordagens apresentam potenciais para resolver o problema de polimorfismo de ARN através da monitorização de estruturas moleculares de uma molécula de cada vez. Este trabalho apresenta um método para manipular com precisão o dobramento e estrutura de moléculas de RNA utilizando pinças ópticas. Primeiro, os métodos para sintetizar moléculas adequadas para o trabalho mecânico única molécula são descritos. A seguir, vários procedimentos de calibração para garantir as operações próprias dos pinças ópticas são discutidos. Em seguida, vários experimentos são explicados. Para demonstrar a utilidade da técnica, os resultados de desdobramento mecanicamente grampos de ARN e um único RNA Kissing complexo são usados ​​como prova. Nestes exemplos, a técnica nanomanipulação foi utilizado para estudar dobragem de cada domínio estrutural, incluindo secundário e terciário, de forma independente. Por fim, são discutidas as limitações e as futuras aplicações do método.

Limitado pelo espaço, nanomanipulação de moléculas de RNA é demonstrado ao mostrar apenas exemplos desdobramento mecânicas dos grampos de RNA e RNA com uma estrutura terciária. Manipular Único Hairpin Moléculas Uma vez que uma corrente é estabelecida entre as esferas, a extensão do e vigor na corda pode ser manipulado através de um protocolo definido pelo usuário. Quatro protocolos comuns de manipulação são comumente usados. <p class="jove_co...

Pinças ópticas têm sido usadas para estudar o dobramento de RNA esticando moléculas individuais de suas extremidades 5 'e 3'. Aqui são descritos procedimentos comuns para sintetizar moléculas de RNA para pinça, calibração do instrumento e métodos para manipular moléculas individuais.

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A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um experimento de desdobramento mecânico de uma única molécula em uma estrutura de RNA. Na primeira etapa, uma câmara de fluxo é construída e montada no instrumento. Na segunda etapa, microesferas são misturadas com a amostra de RNA de interesse, e então as duas diferentes tamanhos de microesferas são carregados na câmara de fluxo.Por fim, a câmara de fluxo e o armadilhamento óptico podem ser utilizados para direcionar as microesferas ao contato mútuo, a fim de avaliar uma variedade de interações de molécula única. Em última instância, essa técnica de nanomanipulação pode ser empregada para estudar a dobragem do RNA nos níveis estruturais secundário e terciário. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo do dobramento do RNA, como, por exemplo, como um RNA se dobra e se desdobra?Como ele transita entre diferentes conformações em resposta a uma mudança ambiental? E como ele interage com outras moléculas? O experimento de hoje será realizado pelo meu estudante de pós-graduação, Sr. Williams Stevenson, para montar uma câmara de fluxo, comece perfurando seis orifícios de dois milímetros de diâmetro em um lam

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