A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar a simplicidade do combustível e observar a geração de fótons vermelhos decorrentes de eventos de emissão por excitação radiativa. Isso é alcançado combinando bactérias bioluminescentes e nanopartículas luminescentes para a produção de combustível. Em seguida, um leitor de placa de bioluminescência é utilizado para observar os fótons vermelhos resultantes que surgem do combustível; os resultados obtidos mostram que uma quantidade substancial de fótons vermelhos pode ser produzida quando as bactérias bioluminescentes e os pontos quânticos são mantidos na mesma solução.

Com base no aumento observado no fluxo de fótons vermelhos, as implicações dessa técnica estendem-se à questionamento do paradigma da transferência de entrada residencial NCE ou Brett. Isso é frequentemente relatado na literatura a partir de colônias individuais. Em placas de cultura padrão, inicie culturas noturnas de bactérias luminiscentes.

Aqui, Vibrio Fisher Eye foram utilizados no dia do experimento. Inicie subculturas frescas e permita que progridam até que uma densidade óptica ou DO em 600 nanômetros de um a 1,5 seja alcançada. Utilize bactérias em estados de crescimento semelhantes, nos quais produzem sinais intensos, para obter resultados comparáveis.

Combine alíquotas de 100 microlitros de cada uma com cinco microlitros da sonda fluorescente, QD 7 0 5 ou solução salina fisiológica. Em seguida, adicione a mistura a 895 microlitros de solução salina fisiológica e cubetas espectroscópicas padrão. Coloque as cubetas preenchidas em um imageador de bioluminescência de animais inteiros e realize as medições com os conjuntos de filtros apropriados.

Aqui, o filtro de emissão de 710 a 730 nanômetros foi utilizado para realizar o combustível em diferentes distâncias. Encha duas cubetas fotométricas de volume reduzido com 50 microlitros de QD 7 0 5 ou com 97,2 microlitros de microesferas de poliestireno não fluorescentes de 48 nanômetros, em um volume total de um mililitro de solução salina fisiológica. Isso garante uma área superficial sólida semelhante por volume total entre as duas entidades.

Prepare uma fonte de luz qve envolvendo um terceiro qve com fita preta padrão ou algum outro material opaco capaz de bloquear a luz. Prepare cuidadosamente duas janelas ópticas idênticas em lados opostos do vete. Adicione uma alíquota de um mililitro de Vibrio fii ou outra cultura proveniente de uma subcultura fresca no vete da fonte de luz e cubra-o com um material opaco, como papel preto, para reduzir qualquer contaminação luminosa.

Em seguida, coloque as cubetas previamente preenchidas diretamente em ambos os lados da fonte de luz vete no imageador. Visualize os três Q vets sob os filtros de emissão apropriados, como o filtro de luz total e os filtros de emissão de 710 a 730 nanômetros, com tempos de exposição de 10, 30 e 30 segundos, respectivamente. Adquira uma imagem de fluorescência com excitação de 450 a 480 nanômetros e emissão de 710 a 730 nanômetros para validar a localização do QD 7 0 5.

Reposicione ambos os Q vets externos a distâncias equivalentes e maiores em relação ao Q Vet Central. Em seguida, visualize e adquira uma imagem de fluorescência antes de repetir este processo novamente até que uma distância final face a face de três centímetros seja alcançada. Preencha duas cubetas de volume reduzido com soluções de um mililitro contendo, em uma delas, um fluoro quatro ou uma nanopartícula fluorescente de interesse, e na outra, solução salina fisiológica com nanopartículas não fluorescentes como controle negativo.

Adicione uma alíquota de um mililitro de Vibrio FII fresco ou outras bactérias bioluminescentes a um terceiro vete escurecido contendo duas janelas ópticas fisicamente iguais situadas em lados opostos; cubra o vete com uma substância opaca, como um pedaço de papel preto, a uma distância curta, porém igual. Posicione os dois cubetas de volume reduzido em ambos os lados do vete Q escurecido e visualize sob os filtros apropriados — aqui, utilizou-se uma distância de 0,7 centímetros. Repita com a outra força de piso do qd 7 0 5 sobre as bactérias.

Observa-se um aumento substancial no número de fótons vermelhos em comparação com as bactérias apenas. O combustível controle pode ocorrer em longas distâncias na ausência de qualquer absorvedor. Essa dependência com a distância pode ser caracterizada pela lei do inverso do quadrado.

Para fontes pontuais. O direcionamento das flora fours à membrana bacteriana parece ter pouco ou nenhum efeito na quantidade total de sinal de combustível gerado. Nesse contexto, o combustível direcionado é mantido mesmo após várias etapas de lavagem.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como reconstituir combustível sob múltiplas modalidades como um meio para gerar fótons vermelhos a partir de eventos de emissão por excitação radiativa.