Name: A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a técnica FUEL para gerar fótons vermelhos usando bactérias bioluminescentes e nanopartículas luminescentes. Este método demonstra compatibilidade com diversos fluoróforos e desafia paradigmas existentes em pesquisa de fluorescência.

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Os autores gostariam de alargar a sua gratidão pelo apoio financeiro da Fundação Pasteur de Nova York (a JD, CS, CS), a UE-FP7 Programa &quot;Automação&quot; (a SLS), o Programa de Carnot Institut 11 (de JD, AH , AR, RT, SLS) e Projeto IMNOS (a RT, SLS), a Fundação de Caridade Conny-Maeve (SLS), o mestrado europeu em Imagem Molecular (a ele), os programas Região Ile de France MODEXA (SLS), gergelim (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), a ANR Programa Grandes Investissement de l&#39;avenir Infraestruturas Nationales en Biologie-Santé: França LifebioImaging (FLI) França Vida Imagem (RT, SLS), França Bioimaging (JD, SLS) eo Institut Pasteur, Paris. Além disso, os autores gostariam de agradecer, José Bengoechea e Herbert Schweizer para reagentes. Além disso, os autores gostariam de agradecer a Cindy Fevre que gerou os anticorpos.

1. Reagentes <ol><li> Compra ou desenvolver bactérias luminescentes e meios de cultura apropriados, tais como Escherichia coli modificada expressando a ABCDE 21 lux, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Prepare uma solução salina fisiológica (NaCl 0,9%) e as soluções de meios de cultura de acordo com receitas-padrão. E. coli e K. pneumoniae foram cultivadas em meio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp em LB suplementado com 0,5 M de NaCl a 22 ° C. </li><li> Aquisição ou adquirir sondas fluorescentes, tais como Q-rastreador 705 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD705), Q-rastreador 800 (40 nm de diâmetro, que se refere a como QD800), fluorescente (40 nm de diâmetro) e microesferas de poliestireno não-fluorescente ( 48 nm de diâmetro), e corantes fluorescentes convencionais. </li><li> Prepare os reagentes necessários para a rotulagem bacteriana. </li><li> Assegurar o acesso aosum gerador de imagens de bioluminescência animal inteiro, tal como um IVIS Spectrum, que é capaz de detectar o sinal em uma ampla gama de comprimentos de onda de emissão e os tempos de exposição. Um leitor de placas capaz de medições bioluminescência é suficiente para a maioria das experiências aqui descritas. </li></ol> 2. Recapitulation Básico de COMBUSTÍVEL <ol><li> A partir de colônias individuais em placas de cultura padrão, comece culturas durante a noite de bactérias luminescentes. Aqui, V. Foram utilizados fischeri. </li><li> No dia da experimentação, iniciar subculturas frescos e permitir-lhes a progredir até uma DO600 de 1-1,5 é alcançado. De modo a produzir resultados comparáveis, é melhor utilizar as bactérias nos estados de crescimento semelhantes em que se produzem os sinais intensos. Isto pode ser assegurado por manter o 600 constante OD. </li><li> Combinar alíquotas de 100 ul de cada, quer com 5 ul de QD705 ou solução salina fisiológica (PS), e, em seguida, adicionar a 895 mL de PS em Standatinas rd espectroscópicas. Coloque as tinas cheias no IVIS Spectrum e tomar as medidas de acordo com as filtros adequados. Aqui, utilizou-se o filtro de emissão de 710-730 nm. </li></ol> 3. Combustível sobre diferentes distâncias <ol><li> Encha dois reduziu o volume (1 ml) fotométricos cuvetes de plástico, quer com 50 ul de QD705 ou 97,2 ul de não fluorescentes 48 nm microesferas de poliestireno, num volume total de 1 ml de PS. Isto assegura semelhante superfície sólida por volume total entre as duas entidades. </li><li> Prepara-se uma cuvete de fonte de luz encerrando uma terceira tina com fita preta padrão ou outro material opaco capaz de bloquear a luz. Preparar-se cuidadosamente duas janelas ópticas idênticas em lados opostos da cuvete. </li><li> Colocar as cuvettes previamente enchidos directamente para qualquer dos lados da tina de fonte de luz. Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de V. cultura fischeri ou outra (isto é, E. coli ou luminescente Photobacterium sp) a partir de uma nova subcultura na cuvete de fonte de luz e cobri-lo com um material opaco, tal como o papel preto para reduzir a contaminação de luz. </li><li> Visualize os três tinas sob os filtros de emissão adequadas, tais como a Luz total e 710-730 nm filtros de emissão, com tempos de exposição de 10, 30 e 30 segundos, respectivamente. </li><li> Reposicionar os tinas externas equivalentes a distâncias maiores da cuba central, e, em seguida, visualizar novamente. Repita até uma distância de 3 centímetros definitivo face-a-face (central para reduzir o volume da cuvete) seja alcançada. A cada passo, adquirir uma imagem de fluorescência (excitação 450-480 nm, 710-730 nm de emissão) para validar o local QD705. </li></ol> 4. Investigando pares potenciais COMBUSTÍVEL <ol><li> Encha duas cuvetes de volume reduzido, com soluções de 1 ml contendo quer um fluoróforo ou uma nanopartícula fluorescente de interesse em uma, e PS ou PS com nanopartículas não fluorescentes como o controlo negativo na outra. Em diae trabalho demonstrou aqui, uma variedade de potenciais fluoróforos combustível disponível comercialmente e nanopartículas fluorescentes foram investigadas conforme descrito na Tabela 1. </li><li> Adicionar uma parte alíquota de 1 ml de fresco V. fischeri ou outras bactérias luminescentes para uma terceira tina escurecidas contendo duas janelas ópticas fisicamente iguais situados em lados opostos. Cobrir a cuvete com uma substância opaca tal como uma folha de papel branco. </li><li> A uma curta distância, mas iguais lugar as duas tinas de volume reduzido em ambos os lados da tina escurecidas e visualizar sob os filtros apropriados. Aqui, foi utilizada uma distância de 0,7 cm. Repita com os outros fluoróforos. </li></ol> 5. FUEL alvejado <ol><li> Preparar anticorpos biotinilados específicos para as bactérias luminescentes. Por exemplo, os anticorpos aqui primárias específicas para K. pneumoniae (α-Kp) foram biotinilados utilizando uma solução contendo o EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Remover o excesso de reagente a partir dos anticorpos usando colunas de dessalinização sob centrifugação (1500 x g) durante 2 min. </li><li> Usar um ensaio de Bradford padrão para determinar a concentração de proteína e determinar o grau de biotinilação do anticorpo por ensaio HABA. </li><li> Obter o anticorpo biotinilado α-Kp-biot (AB) por mistura de lotes de 100 mL (10 mM, dissolvido em PBS 1x), com 40 ul de anticorpo α-Kp, o que resulta em um grau final de substituição de 16 resíduos de biotina por Ab e uma última concentração de proteína de 10 mg ml -1. </li><li> Usando múltipla durante a noite replicar culturas, alvo das bactérias lavado com os anticorpos acima mencionados a seguir o protocolo apropriado. <ol><li> Especificamente, a lavagem K. pneumoniae em 1x PBS, e ressuspender em 1x PBS a uma DO de 4 (ca. 4 x 10 8 UFC ml-1 OD-1). </li><li> Para cada repetição, incubar 100 mL PBS, α -Anticorpos kp (10 ul α-Kp-biotB ou 10 ul de PBS para o controlo) e 100 ul de células durante 90 min a 30 ° C. Lave as células três vezes em 1x PBS, e ressuspender em 196 ul de PBS. </li></ol></li><li> Rotular as células com o conjugado estreptavidina QD705 e dividi-los em dois volumes equivalentes. </li><li> Lavar uma solução três vezes e em seguida ressuspender em que o volume apropriado. </li><li> Distribuir 100 ul das soluções lavadas e não lavadas em poços individuais de um negro placa de 96 poços. Meça a luminescência resultante sob a Luz Total, 490-510 nm e 710-730 nm filtros. Concentração de fluoróforo pode ser determinada utilizando 450-480 nm de excitação e de emissão de 710-730 nm. </li></ol>

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Os autores declaram a competir interesses financeiros. JD, SB, KLR e SLS contribuiu para EP10290158.4 Europeu de Patentes e Organização Mundial da Propriedade Intelectual pedido de patente WO/2011/117847.

A manifestação fundamental do combustível pode ser alcançado simplesmente através da mistura de bactérias luminescentes com nanopartículas fluorescentes ou QDs. As duas entidades vão ser fisicamente separado e permanecem para além de qualquer distância RET eficiente. Mais difícil é a optimização do sinal COMBUSTÍVEL tanto in vitro como in vivo. Sob condições in vitro, com ou sem um absorvedor óptico presente, geralmente a adição de excesso de fluoróforo será suficiente para maximizar a resposta COMBUSTÍVEL. No entanto, em concentrações elevadas, tais como os fenómenos de têmpera ou de colisão estática pode levar a uma perda de sinal fluorescente. Realizando uma série de diluições variando independentemente da concentração da fonte luminescente e o fluoróforo irá contribuir para optimizar as concentrações desejadas. A criação e otimização de combustível sob nas concentrações in vivo é muito mais difícil e precisa ser tratada numa base caso-a-caso. Pode ser difícil criar um condition em que a entidade fluorescente pode ser acedida opticamente pela fonte luminescente. Como tal, a começar pelo co-injeções diretas dos dois grupos pode fornecer informações sobre o sucesso do combustível em condições ideais. Existem protocolos padrão para as bactérias de rotulagem e células eucarióticas com entidades fluorescentes, como a série Alexa e QDs. Muitas vezes, isto requer a funcionalização da superfície ou a activação com os anticorpos, o que pode levar a efeitos indesejados, como reduziu a viabilidade celular ou a actividade metabólica alterada. Para superar isto, é importante para determinar a quantidade óptima de anticorpo ou agente de activação necessário que minimiza as perturbações celulares e maximizar a marcação fluorescente. O uso de QDs é vantajoso por causa do seu amplo espectro de excitação caracteristicamente, os espectros de emissão e estreita sintonizável, e a possibilidade de um grande deslocamento de Stokes. No entanto, QDs pode ser citotóxico e pode não ser desejável em alguns casos. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL é um fenômeno que está presente em muitos experimentos BRET 13 e é aplicável a uma variedade de fontes luminescentes e fluorescentes. Até agora, os fótons resultantes da FUEL foram considerados o produto de interações não-específicas ou um sinal de fundo infeliz resultante de experiências BRET mal concebidos. É somente com o tipo de experiências demonstraram aqui que foram capazes de identificar a utilidade deste sinal indesejado. Nos exemplos mostrados, as bactérias luminescentes agir como uma fonte de excitação difusa capaz de desencadear uma resposta fluorescente padrão a partir de uma grande variedade de entidades fluorescentes. Além disso, devido à distância de trabalho substancial, é seguro concluir que, enquanto combustível pode ser construída sem a ocorrência de BRET, em BRET geral não pode ser observado sem a contribuição do combustível. Mais importante, devido à falta de um requisito de segmentação, o combustível pode ser usada para cobrir a abertura do espaço que existe entre BRET e ctécnicas de imagem de todo o onventional animais.

A modificação genética de organismos, tais como os vírus 1, 2, 3, bactérias ou pequenos mamíferos ou 4 para induzir ou bioluminescência constitutivamente expresso, tem sido muito bem sucedido e amplamente demonstrado 5-7. A bioluminescência, uma reacção quimioluminescente in vivo envolvendo reagentes que ocorrem naturalmente, tem a vantagem de produzir luz sem a necessidade de uma fonte de luz externa. Como tal, a imagem de bioluminescência não sofre os inconvenientes comuns de sinal de auto-e não específica encontrados a partir de imagens de fluorescência 8. Por conseguinte, a bioluminescência tem uma proporção significativa de sinal-para-ruído, uma vez detectado qualquer sinal proveniente apenas da fonte destinada. Enquanto muitos modelos têm explorado o operon lux de luminescens Photorhabdus (máximo de emissão centrado entre 480 e 490 nm) para in vitro e in vivo 9 aplicações, seu uso em pequena mammals tem sido problemática devido à própria natureza das condições de imagem; a existência de impregnante absorvedores ópticas, tais como a hemoglobina, e agentes de dispersão, tais como tecidos e ossos, fortemente afectar azul para os comprimentos de onda amarelas 3. A expressão de uma luciferase de pirilampo engenharia (máximo de emissão a 617nm) foi desenvolvido recentemente e incorporada, fornecendo uma ferramenta que ultrapassa grandemente a absorção óptica 10, mas ainda está sujeito a efeitos de espalhamento. Em resposta, tem havido várias tentativas para vermelho-deslocar o sinal emitido para a janela óptica desejada de 650-900 nm, uma região de absorção e dispersão minimizado, utilizando transferência de energia de ressonância de bioluminescência (BRET) 11-13. Como uma ferramenta para melhorar a detecção do sinal, BRET, que utiliza uma fonte bioluminescente como o dador e um fluoróforo adicionado como o aceitador, tem encontrado um sucesso limitado. Como um exemplo seminal desse fenômeno &quot;, auto-iluminação pontos quânticos4; (SIQDs) 14 consistem modificado Renilla reniformis luciferases ligados à camada de polímero-lisina externo quântica de disponível comercialmente pontos (QDs). Após a adição do substrato, a reacção bioluminescente induz a emissão de fluorescência a partir de QDs, gerando uma produção significativa de fotões vermelhos. No entanto, estes SIQDs têm limitado a aplicabilidade na visualização in vivo de eventos fisiologicamente relevantes. Esta aplicabilidade limitada, é provavelmente devido à dificuldade de se ligar a sonda dupla para o órgão, célula ou do gene de interesse, uma vez que os SIQDs não pode ser geneticamente codificado e, portanto, seria necessária uma modificação secundária do material de cobertura polimérica. Para melhorar a sua aplicabilidade, SIQDs alternativos, onde as luciferases estão vinculados diretamente ao núcleo luminescente, recentemente foram empregadas 15. Construindo fora do conceito SIQD, um sistema BRET mais aplicável foi alcançada ligando Cypridina luciferase de um emdocyanine corante 16, que era capaz de se direccionar especificamente tumores em ratinhos, enquanto a produção de um desvio para o vermelho substancial de 460 nm a 675 nm. Para submeter a transferência de energia não-radiativos, BRET segue os mesmos constrangimentos primárias como sua contraparte fluorescente: deve haver uma forte sobreposição espectral entre a emissão de dador e o aceitador de espectros de excitação e a distância de trabalho entre as duas porções deve ser da ordem do raio de Förster (5-14 nm dependendo do par dador-aceitador, com uma distância máxima eficaz de duas vezes o raio de Förster 17). Esta dependência distância limita muito os tipos de eventos que podem ser observadas usando BRET como um meio para melhorar a detecção. Recentemente, uma nova abordagem foi identificado e demonstrados com estudos in vitro e em condições in vivo. Aproveitando a fundação de BRET, Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) 18, 19 </sup&gt; também requer uma forte sobreposição espectral entre o luminescente e componentes fluorescentes. No entanto, ao contrário BRET, o combustível é um processo completamente radiativa em que o fotão emitido a partir da fonte luminescente é absorvida por um fluoróforo opticamente acessíveis, o que posteriormente emite um fotão vermelho deslocado de acordo com o rendimento quântico de fluoróforo. Semelhante a BRET, esta abordagem também pode ser utilizada para ultrapassar as limitações de imagiologia, na presença de absorventes ópticos. O desvio para o vermelho resultante proporciona um aumento global e especificidade do sinal detectado, devido a uma diminuição da atenuação e de uma redução dos efeitos de dispersão óptica. COMBUSTÍVEL foi relatado para ocorrer entre Escherichia coli bioluminescentes expressando o operon lux e QDs 18, 19. Enquanto experimentalmente semelhante aos SIQDs, existe uma diferença fundamental: em combustível, ele não é necessário para a fonte luminescente estar fisicamente ligado ao fluoróforo, o qual permite que for codificação genética da sonda luminescente. Devido ao êxito da detecção de combustível entre as bactérias luminescentes e QDs, é possível que esta técnica pode ser aplicada a ambos superficial (pele) e profunda do tecido (pulmão, fígado) infecções, tais como Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae. Desde o relatório do seu significado experimental, COMBUSTÍVEL evoluiu para incluir um modelo matemático robusta 20, que pode ser utilizado para prever luminescente aceitável e pares fluorescentes, e as suas aplicações foram expandidas para incluir o uso na identificação das características fotofísicas, tais como o rendimento quântico. Nós descrevemos abaixo algumas das técnicas básicas de combustível. Primeiro, vamos mostrar evidências para esse fenômeno sobre a curto (mm) e comprimento (cm) distâncias de trabalho, o que fundamentalmente distingue COMBUSTÍVEL de BRET. Em segundo lugar, expandir os possíveis pares de combustível em examinar uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Third, aplicações de combustível são investigados, comparando pares COMBUSTÍVEL alvo e não-alvo.

<table><tbody><tr><td>Escherichia coli expressando o luxABCDE&nbsp;</td><td></td><td></td><td>gentilmente cedido por Jos&eacute; A. Bengoechea com permissão de Herbert P. Schweizer</td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae 52145&nbsp;</td><td></td><td></td><td>52145 é uma estirpe de referência do serotipo K2</td></tr><tr><td>Luria Bertani (LB)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>mídia de crescimento padrão</td></tr><tr><td>Q-Tracker 705&nbsp;</td><td>Ciências da Vida</td><td>Q21061MP</td><td></td></tr><tr><td>Q-Tracker 800</td><td>Ciências da Vida</td><td>Q21071MP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555</td><td>Ciências da Vida</td><td>S21381</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 568</td><td>Ciências da Vida</td><td>S11226</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 633</td><td>Ciências da Vida</td><td>S21375</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 700</td><td>Ciências da Vida</td><td>S21383</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas não fluorescentes</td><td>Polysciences, Inc</td><td>15913</td><td></td></tr><tr><td>Microesferas rosa</td><td>Life Sciences</td><td>F8887</td><td>40 nm de diâmetro</td></tr><tr><td>Microesferas amarelas</td><td>Life Sciences</td><td>F8888</td><td>40 nm de diâmetro</td></tr><tr><td>Ivis Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Dessalinização Colunas 7K MWCO</td>Kit de ensaio <td>Thermo Scientific Pierce</td><td>21425</td><td></td></tr><tr><td>HABA&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Pierce</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0201</td><td></td></tr></tbody></table>

a step beyond bret: fluorescência por excitação unbound de luminescência (fuel)

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL) é um processo de emissão de excitação radiativa que produz um aumento do sinal e realce de contraste in vitro e in vivo. Ações de combustível Muitos dos mesmos princípios subjacentes como Transferência Bioluminescência Resonance Energy (BRET), mas é muito diferente nas distâncias de trabalho aceitáveis ​​entre a fonte luminescente ea entidade fluorescente. Enquanto BRET que se encontra limitada a um máximo de duas vezes o raio de Förster, geralmente menos do que 14 nm, o combustível pode ocorrer a distâncias até ao fim ou mesmo centímetros na ausência de um absorvedor óptico. Aqui vamos expandir sobre o fundamento e aplicabilidade do FUEL, revendo os princípios relevantes por trás do fenômeno e demonstrar a sua compatibilidade com uma ampla variedade de fluoróforos e nanopartículas fluorescentes. Além disso, a utilidade de COMBUSTÍVEL alvo-anticorpo é explorado. Os exemplos mostrados aqui fornecem evidências de que o combustível pode ser utilizado para applications onde BRET não é possível, preenchendo o vazio espacial que existe entre BRET e toda tradicional imagem dos animais.

Expandindo a fundação e aplicabilidade da fluorescência por Unbound excitação de luminescência (FUEL) através do levantamento os princípios relevantes e demonstrar a sua compatibilidade com uma infinidade de fluoróforos e condições alvo de anticorpos.

A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar a simplicidade do combustível e observar a geração de fótons vermelhos decorrentes de eventos de emissão por excitação radiativa. Isso é alcançado combinando bactérias bioluminescentes e nanopartículas luminescentes para a produção de combustível. Em seguida, um leitor de placa de bioluminescência é utilizado para observar os fótons vermelhos resultantes que surgem do combustível; os resultados obtidos mostram que uma quantidade substancial de fótons vermelhos pode ser produzida quando as bactérias bioluminescentes e os pontos quânticos são mantidos na mesma solução.Com base no aumento observado no fluxo de fótons vermelhos, as implicações dessa técnica estendem-se à questionamento do paradigma da transferência de entrada residencial NCE ou Brett. Isso é frequentemente relatado na literatura a partir de colônias individuais. Em placas de cultura padrão, inicie culturas noturnas de bactérias luminiscentes.Aqui, Vibrio Fisher Eye foram utilizados no dia do experimento. Inicie subculturas frescas e permita que progridam até que uma densidade óptica ou DO em 600 nanômetros de um a 1,5 seja alcançada. Utilize bactérias em estados de crescimento semelhantes, nos quais produzem sinais intensos, para obter resultados comparáveis.Combine alíquotas de 100 microlitros de cada uma com cinco microlitros da sonda fluorescente, QD 7 0 5 ou solução salina fisiológica. Em seguida, adicione a mistura a 895 microlitros de solução salina fisiológica e cubetas espectroscópicas padrão. Coloque as cubetas preenchidas em um imageador de bioluminescência de animais inteiros e realize as medições com os conjuntos de filtros apropriados.Aqui, o filtro de emissão de 710 a 730 nanômetros foi utilizado para realizar o combustível em diferentes distâncias. Encha duas cubetas fotométricas de volume reduzido com 50 microlitros de QD 7 0 5 ou com 97,2 microlitros de microesferas de poliestireno não fluorescentes de 48 nanômetros, em um volume total de um mililitro de solução salina fisiológica. Isso garante uma área superficial sólida semelhante por volume total entre as duas entidades.Prepare uma fonte de luz qve envolvendo um terceiro qve com fita preta padrão ou algum outro material opaco capaz de bloquear a luz. Prepare cuidadosamente duas janelas ópticas idênticas em lados opostos do vete. Adicione uma alíquota de um mililitro de Vibrio fii ou outra cultura proveniente de uma subcultura fresca no vete da fonte de luz e cubra-o com um material opaco, como papel preto, para reduzir qualquer contaminação luminosa.Em seguida, coloque as cubetas previamente preenchidas diretamente em ambos os lados da fonte de luz vete no imageador. Visualize os três Q vets sob os filtros de emissão apropriados, como o filtro de luz total e os filtros de emissão de 710 a 730 nanômetros, com tempos de exposição de 10, 30 e 30 segundos, respectivamente. Adquira uma imagem de fluorescência com excitação de 450 a 480 nanômetros e emissão de 710 a 730 nanômetros para validar a localização do QD 7 0 5.Reposicione ambos os Q vets externos a distâncias equivalentes e maiores em relação ao Q Vet Central. Em seguida, visualize e adquira uma imagem de fluorescência antes de repetir este processo novamente até que uma distância final face a face de três centímetros seja alcançada. Preencha duas cubetas de volume reduzido com soluções de um mililitro contendo, em uma delas, um fluoro quatro ou uma nanopartícula fluorescente de interesse, e na outra, solução salina fisiológica com nanopartículas não fluorescentes como controle negativo.Adicione uma alíquota de um mililitro de Vibrio FII fresco ou outras bactérias bioluminescentes a um terceiro vete escurecido contendo duas janelas ópticas fisicamente iguais situadas em lados opostos; cubra o vete com uma substância opaca, como um pedaço de papel preto, a uma distância curta, porém igual. Posicione os dois cubetas de volume reduzido em ambos os lados do vete Q escurecido e visualize sob os filtros apropriados — aqui, utilizou-se uma distância de 0,7 centímetros. Repita com a outra força de piso do qd 7 0 5 sobre as bactérias.Observa-se um aumento substancial no número de fótons vermelhos em comparação com as bactérias apenas. O combustível controle pode ocorrer em longas distâncias na ausência de qualquer absorvedor. Essa dependência com a distância pode ser caracterizada pela lei do inverso do quadrado.Para fontes pontuais. O direcionamento das flora fours à membrana bacteriana parece ter pouco ou nenhum efeito na quantidade total de sinal de combustível gerado. Nesse contexto, o combustível direcionado é mantido mesmo após várias etapas de lavagem.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa ideia de como reconstituir combustível sob múltiplas modalidades como um meio para gerar fótons vermelhos a partir de eventos de emissão por excitação radiativa.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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A Step Beyond BRET: Fluorescência por Excitação Unbound de luminescência (FUEL)

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