Aip1p Dynamics são alteradas pela R256H Mutação em actina

O objetivo geral deste procedimento é visualizar o movimento da proteína de ligação à actina em leveduras que expressam uma isoforma de actina mutante. Isso é feito primeiro fazendo um plasmídeo e revestindo a proteína de interação com actina um ou um gene IP um P marcado com uma proteína fluorescente verde três x Fluor quatro. O segundo passo é gerar uma cepa de levedura expressando apenas o tipo selvagem ou o acton mutante.

Em seguida, o plasmídeo A IP one P marcado com GFP é transformado no tipo selvagem ou cepa de levedura mutante. A etapa final é criar imagens e analisar o movimento do A IP marcado com um P nas células de levedura do tipo selvagem e mutantes. Em última análise, reflexão interna total.

A microscopia de fluorescência ou turfa é usada para mostrar que o A IP um P se move mais lentamente em leveduras que expressam o cacton mutante R 2 56 H do que o áton do tipo selvagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do citoesqueleto, como os movimentos temporais relativos dos parceiros de ligação. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando descobri que, ao contrário da cepa do tipo selvagem, excluir A IP one P da cepa de levedura mutante era letal.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia confocal, é o contraste aprimorado e a velocidade de imagem. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldade em otimizar as configurações do microscópio para seu experimento individual devido aos inúmeros ajustes que podem ser feitos e à natureza subjetiva da qualidade da imagem. Comece este protocolo com a geração do plasmídeo A IP um PGFP e da cepa de levedura mutante conforme instruído no protocolo de texto, digerir o plasmídeo com uma enzima de restrição para permitir a integração na cultura do cromossomo de levedura.

As células SCVCA preparadas que são incapazes de sintetizar uracila durante a noite em cinco mililitros de meio YPD em uma roda a 30 graus Celsius. Gire um mililitro das células por cinco minutos a 1000 vezes g. Em seguida, faça a mistura da placa conforme as instruções do protocolo de texto e filtre, esterilize, decanta o sobrenadante das células e ressuspende as células no líquido restante para as células suspensas.

Adicione dois microlitros de 10 miligramas por mililitro de DNA portador de testículos de salmão. Em seguida, adicione 10 microlitros do plasmídeo digerido, DNA e vórtice antes de adicionar 0,5 mililitros de placa e vórtice novamente. Finalmente, adicione 20 microlitros de um molar DI três etol e vórtice.

Depois de incubar a mistura por seis a oito horas a 25 graus Celsius. Choque térmico das células em banho-maria a 42 graus Celsius por 10 minutos. Coloque 100 microlitros das células do fundo do tubo da microcentrífuga, onde elas se acomodaram em uma placa U negativa.

Incube a 30 graus Celsius por dois a três dias ou até que as colônias se formem. Selecione colônias individuais e risque para um sinal de menos. ATO. Para se preparar para a microscopia, essas células contêm o plasmídeo com o A IP one GFP e o UroGen integrados ao cromossomo.

Cultive uma cultura das células de levedura com o A IP um PGFP incorporado em YPD durante a noite em uma roda a 30 graus Celsius subcultura. Um mililitro da cultura da noite para o dia em nove mililitros de menos mídia euro. Cultive as células por mais três a quatro horas em um agitador a 30 graus Celsius para garantir que elas estejam na fase de crescimento logarítmico.

Em seguida, adicione três microlitros de células a uma lâmina de microscópio de vidro e adicione uma lamínula. Deixe as células assentarem na lâmina por cinco minutos. Antes de colocar a lâmina no suporte da placa de platina, observe a proteína PGFP A IP one com um microscópio de fluorescência ou relva de reflexão interna total usando uma objetiva de imersão em óleo 100 x turf e uma câmera digital CCD.

Para focar nas células, abra o software de livro de slides 5.0 e clique no botão da janela de foco na barra de ferramentas. Para acessar os controles de foco, selecione a guia de escopo e selecione a objetiva de relva de 100 x. Ligue a lâmpada e deslize a barra da lâmpada para 15%Altere a configuração do compartimento para dois por dois e altere o filtro para campo claro no microscópio.

Use o estilo de foco fino para colocar as células em foco, como visto na tela do computador. Usando os controles dentro da janela de foco, desligue a lâmpada, mude o filtro para vivo e clique no botão T-I-R-F-M no iluminador T-I-R-F-M conectado à porta do lado direito do microscópio. Ative a emissão do laser para selecionar a guia de fluxo na janela de foco.

Marque a caixa ao lado de iniciar a gravação e clique no botão de campo claro no iluminador TIR FM. Gire o micrômetro para ajustar o ângulo de incidência do laser. Isso é usado para otimizar a emissão fluorescente dos focos de GFP A IP um e minimizar a fluorescência da gripe de fundo das células e deslizar quando a imagem desejada é exibida.

Pressione Iniciar. Obtenha imagens por 20 segundos a uma taxa de cinco quadros por segundo. Após 20 segundos, pressione parar.

Salve as imagens na guia de arquivo na barra de menu principal. Selecione Salvar slide como e insira o arquivo, o local e o nome. Em seguida, use o software Image J.

Para analisar as imagens, use o rastreador manual do plug-in de macro para rastrear o movimento e a taxa dos focos fluorescentes A IP one P. Altere o parâmetro de intervalo de tempo para 0,2 segundos. Usando a seleção de adicionar faixa, selecione e rastreie uma proteína fluorescente individual através de quatro a oito quadros conectivos.

Use o comando N track e a velocidade do movimento da proteína entre cada quadro será exibida em uma janela de resultados. Determine a taxa média entre cada quadro. Usando uma planilha do Microsoft Excel.

Use os valores para calcular a velocidade média de um movimento IP um P ou cada cepa celular de interesse para quantificar um movimento IP um P. Mais de 50 focos fluorescentes A IP e P foram rastreados em mais de 10 células. Resultados representativos de um movimento IP um P em células do tipo selvagem são mostrados conforme o esperado.

O IP marcado com fluorescência um P move-se rapidamente pela célula e depois desaparece nas células que expressam o Acton mutante R 2 56 H. Um IP one P tem menos movimento em comparação com as células do tipo selvagem. Um IP um P é rastreado usando a Imagem J para mapear quantitativamente o movimento da proteína.

Um IP um P varia através da célula na cepa do tipo selvagem, mas se move apenas em uma região restrita. Na cepa actônica mutante, a velocidade média foi calculada para cada área fluorescente A IP one P. Em células do tipo selvagem, a velocidade média do movimento de um IP um P é de 1,60 mais ou menos 0,42 mícrons por segundo, as células que expressam a actina mutante R 2 56 H conhecida por ter morfologia anormal do citoesqueleto de actina têm um fenótipo A IP um P alterado na cepa mutante.

Um movimento IP one P é restrito e mais lento. A velocidade média de um movimento IP um P é de 0,88, mais ou menos 0,30 mícrons por segundo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens de proteínas do citoesqueleto usando microscopia de turf.

Ao usar este procedimento, é importante lembrar de não deixar as células secarem ou ficarem fotobranqueadas.