Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a permeabilidade em microvasos únicos de pulmões isolados de ratos usando um método baseado em fluorescência. Isso é feito isolando primeiro os pulmões dos ratos e perfundindo-os com sangue autólogo. O segundo passo do procedimento é inserir um microcateter atrial esquerdo em uma pequena região do pulmão para infundir a flora quatro dextrina marcada.

Então, enquanto a dextrina marcada é infundida, as imagens dos microvasos pulmonares são coletadas. A etapa final é quantificar a permeabilidade de microvasos únicos a partir das imagens usando software. Em última análise, os resultados podem mostrar o grau de permeabilidade dos microvasos pulmonares em diferentes condições, como após o tratamento com LPS.

Demonstrando este procedimento estará o Dr. Kava Kasami, um pós-doutorado do meu laboratório Comece realizando uma traqueotomia em um rato macho em um plano cirúrgico confirmado de anestesia. Use uma cânula traqueal PE 90 e prenda-a com suturas. Em seguida, infunda o coração com 100 a 200 unidades de heparina usando uma agulha borboleta calibre 21.

Espere um minuto e depois sangre o sangue. Colete o sangue e reserve-o com solução salina. Encha duas cânulas feitas de tubos tigônicos de três milímetros com quatro centímetros de comprimento e alargados em uma extremidade.

Agora faça uma toracotomia. Faça uma incisão grande o suficiente para que a cânula penetre no ventrículo direito e deslize na cova alargada de uma cânula em direção à artéria pulmonar. Prenda a cânula com suturas.

Use a mesma técnica para inserir a outra cânula no ápice do ventrículo esquerdo em direção ao átrio esquerdo. Prenda-o com fita umbilical de dois milímetros de largura. Agora remova os tecidos conjuntivos impeditivos e remova o longo e o coração junto com as cânulas.

Transfira-os para uma placa de Petri com a superfície diafragmática do pulmão para cima e as três cânulas todas alinhadas. Mova a preparação dissecada para um estágio ajustável equipado com tubo tigon número 18 conectado a transdutores de pressão que servem como tubos de entrada e saída. Agora misture a coleta de sangue com um volume igual de solução de albumina a 5%.

Adicione esta mistura ao reservatório de carregamento. Ligue a bomba a 14 mililitros por minuto. Certifique-se de que a tubulação não tenha bolhas de ar.

Na preparação. Conecte a artéria pulmonar ao tubo de entrada do pulmão e a cânula do átrio esquerdo ao tubo de saída. Verifique novamente se não há ar na tubulação e também se o shunt está aberto.

Conecte a cânula traqueal a um terceiro transdutor de pressão. Infle os pulmões através da cânula traqueal com 30% de oxigênio. Mantenha os pulmões a cinco centímetros de pressão da água.

Agora clamp o shunt e ligue a bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar a perfusão pulmonar durante a perfusão, ajuste a bomba para manter a pressão pulmonar em cerca de 10 centímetros de água e mantenha a pressão do átrio esquerdo em três centímetros de água. Comece preparando o pulmão com infusão de sangue.

Primeiro, construa um cateter de infusão a partir de um tubo PE 10 de 40 centímetros de comprimento inserido em um tubo PE 90 de 30 centímetros de comprimento. Conecte a outra extremidade do tubo PE 10 a uma agulha de calibre 30 conectada a uma seringa de um cc. Coloque a extremidade do tubo preso ao pulmão acima da preparação e conecte o cateter de infusão a ele.

Guie o cateter de infusão para o átrio esquerdo e depois para o pulmão até encontrar resistência. Força excessiva ferirá o pulmão. A incisão adequada do microcateter é fundamental, pois qualquer dano ao pulmão pelo microcateter reduzirá o sucesso do protocolo.

Em seguida, encha a seringa com toques e conecte-a a uma bomba. Infundir lentamente a solução a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Gradualmente, o local da perfusão ficará pálido em comparação com o resto do pulmão para manter a superfície pulmonar húmida rapidamente em plástico, com exceção do local da perfusão.

Agora, para visualizar o pulmão, crie uma janela de visualização anexando um O-ring a uma lamínula de 22 milímetros. Usando graxa de torneira, prenda o O-ring a um suporte de tubo de ensaio. Em seguida, posicione a janela sobre o local da perfusão.

Complete a configuração balançando uma objetiva de 20 x sobre a lamínula e concentrando-se no pulmão. Nenhuma distorção visual é esperada. Agora infundir o pulmão com uma solução de sua escolha.

Neste exemplo, após a solução salina, um mililitro de dextrina conjugada com ZI é infundido no pulmão através da bomba de seringa ao longo de 60 minutos. Usando o software de imagem, registre uma imagem por minuto durante a infusão de uma hora e continue gravando durante a lavagem subsequente Etapa por mais 10 minutos Após a infusão da dextrina Fitz, lave-a infundindo a solução de ringer pulmonar por pelo menos mais 10 minutos na mesma taxa de fluxo. Posterior. Ao analisar as imagens adquiridas, pontue a intensidade máxima de fluorescência na região de interesse durante a infusão.

Em seguida, marque a intensidade máxima de fluorescência da fluorescência residual após o washout de 10 minutos. Alterações na permeabilidade vascular foram investigadas usando infusão de dextrina fitzy após tratamento com lipopolissacarídeo bacteriano, pois este é um modelo amplamente utilizado de um LI. Além disso, em comparação com a infusão de ringer, a infusão de LPS causou uma redução significativa no índice de permeabilidade, sugerindo um aumento global na permeabilidade em todos os vasos dentro do campo de imagem.

Além disso, em comparação com a infusão de ringer, a infusão de LPS causou uma redução significativa no índice de permeabilidade, sugerindo um aumento global na permeabilidade em todos os vasos dentro do campo de imagem. Depois de assistir a este vídeo, ele deve ter uma boa compreensão de como preparar pulmões profiláticos isolados de aves, inserir um microcateter de cauda esquerda e definir a permeabilidade em micro.