Quantificar Único microvasos Permeabilidade em perfusão isolada-Sangue Rat Lung Preparação

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a permeabilidade em vasos microscópicos individuais de pulmões isolados de ratos utilizando um método baseado em fluorescência. Isso é realizado primeiramente isolando os pulmões de ratos e perfundindo-os com sangue autólogo. O segundo passo do procedimento consiste em inserir um microcateter atrial esquerdo em uma pequena região do pulmão para infundir dextrina marcada com flora quatro.

Em seguida, enquanto a dextrina marcada é infundida, são coletadas imagens dos microvasos pulmonares. O passo final é quantificar a permeabilidade de microvasos individuais a partir das imagens, utilizando um software. Em última análise, os resultados podem mostrar o grau de permeabilidade dos microvasos pulmonares sob diferentes condições, como após tratamento com LPS.

Demonstrará este procedimento a Dra. Kava Kasami, pesquisadora pós-doutoranda do meu laboratório. Comece realizando uma traqueotomia em um rato macho em plano cirúrgico confirmado de anestesia. Utilize uma cânula traqueal PE 90 e fixe-a com pontos. Em seguida, infunda o coração com 100 a 200 unidades de heparina usando uma agulha tipo borboleta de calibre 21.

Aguarde um minuto e, em seguida, realize a exsanguinação do sangue. Colete o sangue e coloque-o de lado com soro fisiológico. Encha duas cânulas feitas de tubo de tigon de três milímetros de diâmetro, com quatro centímetros de comprimento e alargadas em uma extremidade.

Agora realize uma toracotomia. Faça uma incisão apenas grande o suficiente para a cânula no ventrículo direito e insira suavemente a extremidade alargada de uma cânula em direção à artéria pulmonar. Fixe a cânula com pontos de sutura.

Utilize a mesma técnica para inserir a outra cânula no ápice do ventrículo esquerdo em direção ao átrio esquerdo. Fixe-a com fita umbilical de dois milímetros de largura. Agora, remova os tecidos conjuntivos que impedem a manipulação e retire o pulmão e o coração juntos com as cânulas.

Transfira-os para uma placa de Petri com a superfície diafragmática do pulmão voltada para cima e os três cânulas alinhados. Mova o preparado dissecado para uma plataforma ajustável equipada com tubo tigon número 18 conectado a transdutores de pressão que servem como tubos de entrada e saída. Agora, misture a coleta de sangue com um volume igual de solução de albúmina a 5%.

Adicione esta mistura ao reservatório de carga. Inicie a bomba a 14 mililitros por minuto. Certifique-se de que a tubulação não tenha bolhas de ar.

Na preparação, conecte a artéria pulmonar ao tubo de entrada do pulmão e a cânula atrial esquerda ao tubo de saída. Verifique cuidadosamente se não há ar nas tubulações e também confirme se o desvio está aberto.

Conecte a cânula traqueal a um terceiro transdutor de pressão. Influe os pulmões através da cânula traqueal com 30% de oxigênio. Mantenha os pulmões à pressão de cinco centímetros de água.

Agora, prenda o desvio e inicie a bomba a 14 mililitros por minuto. Para iniciar a perfusão pulmonar durante a perfusão, ajuste a bomba para manter a pressão pulmonar em cerca de 10 centímetros de água e mantenha a pressão atrial esquerda em três centímetros de água. Comece preparando o pulmão infundido com sangue.

Primeiro, monte um cateter de infusão a partir de um segmento de 40 centímetros de tubo PE 10 inserido em um segmento de 30 centímetros de tubo PE 90. Conecte a outra extremidade do tubo PE 10 a uma agulha de calibre 30 acoplada a uma seringa de 1 cc. Posicione a extremidade do tubo conectada ao pulmão acima do preparo e fixe o cateter de infusão a ela.

Guie o cateter de infusão até o átrio esquerdo e depois para dentro do pulmão até encontrar resistência. A força excessiva lesará o pulmão. O corte adequado do microcateter é essencial, pois qualquer dano ao pulmão causado pelo microcateter reduzirá o sucesso do protocolo.

Em seguida, encha a seringa com solução de Ringer e conecte-a a uma bomba. Infunda lentamente a solução a uma taxa de 10 microlitros por minuto. Gradualmente, o local da infusão ficará pálido em comparação com o restante do pulmão, mantendo a superfície pulmonar úmida, exceto no local da infusão.

Agora, para visualizar o pulmão, crie uma janela de observação fixando uma junta de borracha a uma lamínula de 22 milímetros. Usando graxa para torneira de três vias, fixe a junta de borracha a um suporte de tubo de ensaio. Em seguida, posicione a janela sobre o local de infusão.

Conclua a montagem posicionando um objetivo de 20 x sobre a lamínula e focalizando o pulmão. Nenhuma distorção visual é esperada. Agora, infunda o pulmão com uma solução de escolha.

Neste exemplo, após a administração da solução salina, um mililitro de dextrina conjugada com ZI é infundido no pulmão por meio da bomba de seringa ao longo de 60 minutos. Utilizando o software de imagem, registre uma imagem por minuto durante toda a infusão de uma hora e continue o registro durante a etapa subsequente de lavagem por mais 10 minutos. Após a infusão da dextrina Fitz, remova-a infundindo a solução de Ringer para pulmão por pelo menos mais 10 minutos, na mesma taxa de fluxo. Posteriormente, ao analisar as imagens adquiridas, determine a intensidade máxima de fluorescência na região de interesse durante a infusão da dextrina Fitz.

Em seguida, determine a intensidade máxima de fluorescência da fluorescência residual após a lavagem de 10 minutos. As alterações na permeabilidade vascular foram investigadas mediante infusão de dextrina fitzy após tratamento com lipopolissacarídeo bacteriano, pois este é um modelo amplamente utilizado de IL. A fluorescência residual da fit e foi baixa em microvasos tratados com ringer, mas elevada naqueles tratados com LPS. Além disso, em comparação com a infusão de ringer, a infusão de LPS provocou uma redução significativa no índice de permeabilidade, sugerindo um aumento global na permeabilidade em todos os vasos dentro do campo da imagem.

Além disso, em comparação com a infusão de Ringer, a infusão de LPS causou uma redução significativa no índice de permeabilidade, sugerindo um aumento global na permeabilidade de todos os vasos dentro do campo de imagem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar pulmões isolados de aves, inserir um microcateter na cauda esquerda e definir a permeabilidade em nível microscópico.