Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

O objetivo geral deste procedimento é gerar macrófagos humanos em alta quantidade e qualidade com equipamentos de laboratório padrão. Isso é conseguido primeiro centrifugando o sangue das camadas de Buffy em um gradiente de chamada FI para coletar os cs P BMCs. Em seguida, em um gradiente por chamada, os monócitos são separados dos linfócitos.

Em seguida, os monócitos são semeados em sacos de cultura de células revestidos com Teflon e diferenciados. Após seis ou sete dias, os macrófagos são colhidos e semeados para estudos subsequentes. As células obtidas devem expressar os marcadores típicos de macrófagos maduros e responder a vários estímulos, como co-cultivo com células tumorais ou estimulação com LPS, A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como contrafluxo, centrifugação ou classificação de células ativadas por magnetismo, é que os macrófagos humanos podem ser gerados com equipamento labial padrão sem a necessidade de reagentes ou instrumentos caros.

Embora esse método seja fácil de executar, os indivíduos novos nesse método podem ter dificuldade em visualizar e separar as diferentes populações de células nos gradientes de densidade. Portanto, a demonstração visual dessas etapas ajudará a superar essas dificuldades. Este protocolo é realizado em duplicata para facilitar o balanceamento dos rotores.

Comece desinfetando dois sacos da fração do revestimento leucocitário do sangue em camadas. Em seguida, transfira os casacos Buffy para dois tubos de 50 mililitros para cada casaco buffy. Prepare três tubos de 50 mililitros com 15 mililitros de solução de chamada FI à temperatura ambiente a 1,077 gramas por mililitro.

Agora, lenta e cuidadosamente, coloque de 30 a 35 mililitros de casaco inchado em cada tubo de chamada FI. As camadas não devem se misturar centrifugue esses tubos sem quebrar a 400 G por meia hora. À temperatura ambiente entre as duas fases, um anel branco de células mononucleares do sangue periférico se formará.

Remova essas camadas com uma pipeta de plástico. Combine as camadas dos três tubos de cada doador em dois tubos de 50 mililitros por doador. Lave as células coletadas adicionando um milimolar P-B-S-E-D-T-A até a linha de 40 mililitros e, em seguida, centrifugue-as a 300 G por 10 minutos sem quebrar à temperatura ambiente.

Agora aspire e descarte os sobrenadantes. Em seguida, repita a lavagem e P-B-S-C-D-T-A ressuspenda e agrupe os pellets de cada doador e 20 mililitros de RPMI mais FCS sem vermelho de fenol. Agora deve haver um tubo de células por doador.

Agora prepare o segundo gradiente de densidade misture 23,13 mililitros de temperatura ambiente por solução de chamada com 1,87 mililitros de 10 XPBS em um tubo de 50 mililitros. Prepare um tubo da mistura para cada duas amostras. Em seguida, transfira 23 mililitros da mistura para um novo tubo de 50 mililitros.

Em seguida, adicione 27 mililitros de RPMI mais FCS com vermelho de fenol. O resultado é uma solução osmótica por chamada de 46% ISO. Agora, para cada transferência de doador, 25 mililitros da solução de 46% para um tubo de 50 mililitros e coloque cuidadosamente a mistura de células.

As duas fases devem ser distinguíveis por suas cores sem interrupção. Centrifugue as células por meia hora em temperatura ambiente e a 550 G. Um anel branco de monócitos se acumulará entre as duas faces. Colete essas células em um tubo de 50 mililitros com uma pipeta de plástico.

Lave os monócitos com um milimolar P-B-S-E-D-T-A, preenchido até a marca de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue-os a 400 G sem quebrar por 10 minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e ressuspenda os monócitos peletizados em 20 mililitros de meio. Em seguida, prossiga com a próxima seção.

Este protocolo usa sacos de cultura revestidos com Teflon FEP como uma câmara de cultura. Comece estimando o número de monócitos coletados. Os monócitos são grandes e muitas vezes de formato irregular.

Não conte os linfócitos menores. Se 100 a 150 milhões de células de um doador estiverem disponíveis, prepare 180 mililitros de RPMI suplementado. Se houver menos células, prepare 30 mililitros de volume de meio para cada 30 a 50 milhões de células.

Em uma alíquota de 20 mililitros, misture cuidadosamente as células nos 180 mililitros de meio preparado. Em seguida, coloque o saco de cultura com as células com uma seringa de perfu de 50 mililitros ligada ao tampão do saco de cultura. Remova a seringa, empurre o ar restante e tampe o plugue com um cone.

Agora incube os sacos por seis a sete dias com 5% de dióxido de carbono. Após seis a sete dias de incubação, transfira os sacos de cultura para o gelo para colher as células, mergulhe completamente os sacos no gelo e deixe-os esfriar por uma hora a três horas para separar as células. Em seguida, puxe suavemente os sacos sobre uma borda cerca de 10 vezes.

Em seguida, desinfete completamente a parte externa dos sacos. Substitua o cone do plugue por uma seringa de 50 mililitros. Em seguida, retire a suspensão celular e transfira-a para um tubo de 50 mililitros.

Quando todos os tubos forem coletados, gire-os a 400 G por 10 minutos À temperatura ambiente, agora aspire o sobrenadante e agrupe todas as células em 10 mililitros de RPMI mais FCS. Em seguida, conte as células como antes. Conte apenas os macrófagos, pois linfócitos residuais podem estar presentes.

Em seguida, use as células para a aplicação de interesse para reutilizar os sacos de cultura. Lave-os duas vezes com etanol 70%. Em seguida, encha-os com 50 mililitros de etanol a 70% e incube-os durante a noite em temperatura ambiente no dia seguinte, enxágue os sacos três vezes com PBS estéril.

Em seguida, embrulhe-os em papel de esterilização e autoclave-os. Uma bolsa pode ser facilmente reutilizada 10 vezes o gradiente de densidade. As centrifugações produzem uma interface branca contendo linfócitos e monócitos.

Aqui examinamos o primeiro gradiente de densidade. Maio Grunwald. A coloração dessas células mostra uma alta proporção de citoplasma de núcleo, típica de linfócitos, e núcleos em forma de feijão ou anel, típicos de monócitos.

Essas manchas mostram os resultados do segundo gradiente. Cada camada leucocitária produz cerca de 150 milhões de monócitos, que podem ser diferenciados em cerca de 70 milhões de macrófagos. Em 20 preparações, 47% dos monócitos tornaram-se macrófagos.

Os macrófagos purificados podem ser enriquecidos ainda mais pela aderência a superfícies plásticas, uma característica que não é compartilhada pelas células contaminantes. Uma vez plaqueados, a maioria dos macrófagos mostra uma morfologia de ovo frito, enquanto outros têm um fenótipo semelhante a um fuso esticado. As células são caracterizadas pela expressão de vários marcadores.

Típico para macrófagos maduros. A expressão de CD 11 B argumenta contra uma diferenciação dendrítica, assim como a falta de expressão de CD 2 0 9. Após a diferenciação, as células permanecem funcional e metabolicamente ativas por cinco a sete dias.

A coloração de cálcio de células viáveis mostra sua capacidade de absorver vesículas extracelulares marcadas em vermelho eliminadas de células tumorais. Além disso, os macrófagos podem ser ativados, por exemplo, a estimulação com lipopolissacarídeo resulta na expressão de vários genes pró-inflamatórios. Após este procedimento, os macrófagos isolados podem ser submetidos a um enorme espectro de ensaios funcionais para responder a questões básicas sobre a biologia dos macrófagos na saúde e na doença.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um grande número de macrófagos humanos. No entanto, é importante lembrar que você está trabalhando com amostras de sangue humano, que podem ser potencialmente infecciosas.