Name: Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Aprenda a isolar monócitos humanos por centrifugação em gradiente de densidade dupla e diferenciá-los em macrófagos usando bolsas de cultura revestidas com teflon. Este método eficiente gera cerca de 70 milhões de macrófagos funcionais por amostra.

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Os autores gostariam de agradecer a senhora Meike Schaffrinski para ela sempre excelente assistência técnica durante os últimos anos. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Alemanha (DFG), dentro do grupo de investigação conjunto 942 (FOR942) e pelo Programa de Pesquisa da Faculdade de Medicina, Georg-August-Universidade de Göttingen.

1 Preparação de estéril AB Soro Humano <ol><li> Colete 4-5 sacos de plasma fresco congelado (PFC). Armazenar os sacos a -20 ° C até sacos suficientes foram recolhidos. </li><li> Descongelar sacos e incubar durante 30 min a 56 ° C em um banho de água para inactivar o complemento e remover fibrina. </li><li> Desinfectar completamente a parte externa dos sacos e transferir o plasma para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 3000 xg por 15 minutos à temperatura ambiente para se livrar de precipitados e plaquetas residuais. </li><li> Piscina durante todo o sobrenadante e descartar os pellets. </li><li> As amostras de soro da alíquota em tubos de 15 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: Como alternativa, disponível comercialmente de soro AB humano normal inactivado pelo calor pode ser usado. </li></ol> 2 Isolamento de monócitos Para facilitar o balanceamento da centrífuga, é recomendado para processar duas crostas inflamatórias em paralelo. No entanto, tome care a utilização de materiais diferentes para cada dador e para não misturar as células. No caso de cremes leucocitários não pode ser facilmente obtido, de 400 ml de sangue periférico heparinizado podem ser utilizados em vez disso. <ol><li> Desinfectar cuidadosamente os sacos de plástico contendo os casacos de Buffy e transferir o conteúdo de cada creme leucocitário para dois tubos de 50 ml. </li><li> Para cada buffy coat encher três tubos de 50 ml com 15 ml de solução de Ficoll (1,077 g / ml). O Ficoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Camada de 30-35 ml de sangue de creme leucocitário no topo da solução de Ficoll para o primeiro gradiente de densidade. Tenha o cuidado de fazer isso devagar e com cuidado, a fim de evitar a mistura de ambas as camadas. </li><li> Centrifugar a 400 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 40 ml no total. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Sobrenadante aspirado e lave o peletizado de novo com 40 ml de PBS-EDTA (1 mM). </li><li> Para cada conjunto de dadores, as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 sem vermelho de fenol + 10% de FCS. </li><li> Preparar a solução de Percoll iso-osmótico do segundo gradiente de densidade: Para misturar dois doadores de 23,13 ml de solução de Percoll (densidade: 1,131 g / ml) num tubo de 50 ml com 1,87 ml de PBS 10 vezes. Em seguida, transferir 23 mL desta solução para um novo tubo de 50 ml e adicionar 27 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS para obter uma solução iso-osmótica de Percoll 46%. O Percoll deve estar à temperatura ambiente durante a preparação. </li><li> Para cada transferência de dador 25 ml de solução de Percoll preparada em um tubo de 50 ml e a camada de solução de PBMC preparado em 2.9) na parte superior da solução de Percoll. Tenha o cuidado de fazer isso muito lentamente umd cuidadosamente, ambas as camadas tendem a misture facilmente. Se isso for feito correctamente as duas fases podem distinguir-se, devido à sua diferença de cor. </li><li> Centrifuga-se a 550 x g sem travão, durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Para cada gradiente de recolher o anel branco de monócitos, que está localizado entre as duas fases, com uma pipeta de Pasteur de plástico e transferência para um tubo de 50 ml. </li><li> Encher cada tubo com PBS-EDTA (1 mM) até 50 ml no total. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min sem travão, à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as pelotas em 20 ml de RPMI-1640 com vermelho de fenol + 10% de FCS. </li></ol> 3. Diferenciação de monócitos para macrófagos <ol><li> Determinar o número de monócitos isolados em uma diluição de 1:10 em azul tripano. Só contam os grandes células, de forma irregular, muitas vezes, que são os monócitos. Não conte as células menores, de formato circular, que são linfócitos. NOTA: números de monócitos não tem que ser determinado com precisão muito porque eles só dão uma dica sobre quantos e quais FEP teflon sacos (pequenos ou grandes) devem ser utilizados para a diferenciação das células. </li><li> Para 1,0-1,5 x 10 8 monócitos de um doador, semear as células em um grande saco de cultura de células FEP teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 174 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 180 ml). <ol><li> Para 3,0-5,0 x 10 7 monócitos de um doador, semear as células em um pequeno saco de cultura de células revestidas de Teflon. Para cada saco de preparar o meio de cultura consistindo de 28,5 mL de meio RPMI-1640, 2% de soro AB humano (preparado como na Secção 1), 1% de penicilina / estreptomicina, e 2,5 ng / ml de FEC-M (volume total: 30 ml). NOTA: Se, por exemplo, 8,0 x 10 7 monócitos são obtidos, recomendamos para semeá-los em twO menor volume de sacos com 4,0 x 10 7 células cada. Em vez de M-CSF, monócitos, alternativamente, podem ser diferenciados com o factor estimulador de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF) com a mesma concentração (2,5 ng / ml). </li></ol></li><li> Adicionar a suspensão de células (20 ml) para a forma preparada e misturar cuidadosamente. Se dois sacos são preparados a partir de um dador, adicionar 20 mL de meio RPMI-1640 à suspensão de células e em seguida, adicionar metade da suspensão para cada preparação de meio. </li><li> Opcional: Para determinar se a preparação dos monócitos se manteve estéril, rasgar uma gota da suspensão de células numa placa de agar de sangue e incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Aperte a bainha de um 50 ml PERFUSOR seringa no plugue do saco de cultura de células FEP teflon e preenchê-lo com a suspensão de células preparado. </li><li> Desligue a seringa e empurrar o ar restante para fora do saco. Feche o saco com um cone de fecho. </li><li> Incubar as bolsas durante 6-7 dias a 3776; C com 5% de CO 2. </li></ol> 4. macrófagos Colheita <ol><li> Coloque as Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células com os macrófagos diferenciados em gelo durante pelo menos 1 hora para facilitar a separação das células (uma incubação de até 3 horas é possível). Assegure-se que toda a superfície do saco é coberto com gelo. </li><li> Puxe o saco com pressão mínima de 10x sobre a borda de uma mesa / tabuleiro. </li><li> Desinfectar cuidadosamente a parte exterior do saco e remover o cone de fecho. </li><li> Apertar uma seringa de 50 ml com o tampão do saco, remover a suspensão de células, e transferi-lo para tubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar a 400 xg durante 10 min à temperatura ambiente para girar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e reunir os peletes a partir de um saco, em 10 ml de RPMI-1640 + FCS a 10% no total. </li><li> Determinar o número de células num hemocitómetro (1: 4-1: 10 diluição em azul tripano). Só contam os grandes células redondas. Nota: Após a diferenciação dos macrófagos nos sacos de Teflon FEP-revestidas, pode haver células residuais, por exemplo, linfócitos, dependendo do dador e sobre a qualidade do isolamento de monócitos. </li><li> Para reutilizar os sacos de Teflon FEP-revestidos, lave-se duas vezes com etanol a 70% para remover células residuais. Encha-os com etanol 50 ml 70% e incubar durante a noite. Lavam-se as bolsas 3x com PBS estéril, embrulhá-los em papel de esterilização, e esterilizar em autoclave, utilizando procedimentos padrão. NOTA: Os sacos de cultura de células pode ser reutilizado várias vezes sem perda de rendimentos de macrófagos. No entanto, decidimos descartar os sacos após 10 usa antes de começar a vazar. </li><li> Para subseqüentes macrófagos experimentos de cultura em RPMI-1640 + 10% FCS. Se forem necessárias concentrações mais baixas de soro, a cultura em meio RPMI-1640 com 1% de FCS, também é possível. Semente e células incubar por 3-4 horas. Após este período, notar que os macrófagos aderem à superfície do prato de cultura de células, enquantoquaisquer células contaminantes (isto é, eritrócitos, linfócitos e células dendríticas) ficar em suspensão. Lavar as células, pelo menos, duas vezes com PBS para remover as células não aderentes. </li><li> Para retirar macrófagos cultivados a partir da placa de cultura de células para novas experiências, raspe-os cuidadosamente para fora da superfície. Alternativamente, incubar os pratos durante 20 minutos em gelo, aspirar o meio de cultura, e adicionar tampão de dissociação de células livres de enzima de 1 ml. Após 5 minutos de incubação a 37 ° C, adicionar 4 ml de PBS, e separar as células por pipetagem para cima e para baixo por, pelo menos, 3 minutos. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar, como não existe qualquer conflito de interesses.

Os macrófagos são células efetoras importantes do sistema imune inato e exibir funções importantes na imunomodulação, apresentação de antígenos e homeostase do tecido. Devido à sua notável plasticidade, eles são capazes de responder a estímulos de diferentes com que as alterações de fenótipo. No entanto, até agora um monte de dados sobre macrófagos polarização são obtidas no sistema murino, embora existam relatos que mostram que apenas cerca de 50% dos marcadores de macrófagos de polarização pode ser diretamente traduzido do mouse para humano 16. Por conseguinte, apresenta-se aqui um método para se obter os macrófagos humanos primários, em número e pureza suficiente sem a necessidade de materiais dispendiosos, como por exemplo, contas magnéticas MACS e um dispositivo de elutriação por centrifugação contrafluxo. O nosso método baseia-se no isolamento de monócitos a partir de PBMC e sua subsequente diferenciação em macrófagos em FEP Teflon sacos de cultura de células na presença de baixo concentrations de M-CSF 11-13. Enquanto monócitos representam menos de 5 a 10% dos leucócitos do sangue periférico em seres humanos, com a estimulação são recrutados para locais periféricos onde se diferenciam em macrófagos teciduais residentes ou células dendríticas 17. A citocina de M-CSF é importante para a sobrevivência dos monócitos e dirige a sua diferenciação para macrófagos 18,19. Até agora, as concentrações de FEC-M, que foram escolhidos para a diferenciação de monócitos variaram até 100 ng / ml, contudo, no nosso protocolo que é capaz de obter um número suficiente de macrófagos maduros com uma concentração de M-CSF de apenas 2,5 ng / ml 12 , 20. Além disso, as células são cultivadas em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células que facilitam o desprendimento dos macrófagos e a sua sementeira subsequente em números de células definidas. Uma vez que os sacos podem ser reutilizados várias vezes, o que diminui ainda mais os custos para o processo de isolamento. Os macrófagos obtidos por este procedimentosão altamente positivo para CD45, CD14, CD11b, CD11c e mostrar a expressão do CD206 receptor de manose que defende uma população de puros, macrófagos maduros 21,22. Especialmente alta expressão de CD14 é típico para macrófagos diferenciados na presença de M-CSF 23. Após sementeira das células, eles exibem uma adesão rápida a superfícies de plástico, com algumas células mostrando uma morfologia fusiforme típico, enquanto que outros apresentam um fenótipo de ovo frito. Isto está de acordo com as observações de outros autores 18,22,24. Foi relatado que a diferenciação de monócitos na presença de M-CSF conduz a macrófagos M2-polarizados 16,25. No entanto, os macrófagos isolados pelo nosso protocolo ainda são capazes de responder a uma grande variedade de estímulos, incluindo a exposição de microvesículas derivadas de células tumorais e de co-cultura com células tumorais 26,27 ou exposição ao LPS aos quais eles reagem com a indução de pró genes inflamatórios tais como IL-1 &amp;# 946 ;, TNFa, Wnt5a, ou várias metaloproteinases da matriz, que são consideradas típicas de macrófagos M1-polarizados 3,5,28. Em conclusão, o isolamento de monócitos por centrifugação em gradiente de densidade dupla e subsequente diferenciação em direcção macrófagos em Teflon FEP-revestidas de cultura de células resulta em sacos de um elevado número de macrófagos, sem a necessidade de procedimentos tecnicamente difíceis ou caros. Os macrófagos obtidos podem ser utilizados para posterior análise que vão desde a ativação clássica através de LPS para a co-cultura com células tumorais.

As células da linhagem monocítica e seus terminalmente diferenciadas derivativos - macrófagos - exibem uma plasticidade impressionante no que diz respeito à sua função biológica, levando ao seu envolvimento em diversos processos tais como desenvolvimento, reparação tecidual e imunidade 1. O último é devido à sua capacidade fagocítica e apresentadora de antígeno que coloca macrófagos no cruzamento entre a resposta imune inata e adaptativa 2. No entanto, a sua capacidade para secretar citocinas, quimiocinas, factores de crescimento, e outras moléculas de sinalização 1, não só aumenta a sua função de imunomoduladores, mas também serve como uma base para as suas funções adicionais. As tentativas para espelhar essas etapas de ativação diversas no contexto de condições mediadas não-microbianos resultaram nas categorias M1 e M2 3. Embora esta classificação não é completo, permite um conhecimento básico da biologia dos macrófagos. Devido a estas capacidades multifacetadas ele vem como nenhuma surpresa que os macrófagos são associados a muitas condições que de alguma forma envolvem remodelação do tecido ou inflamação. Ao lado de seu papel fundamental no reconhecimento e liberação de patógenos invasores 4-6, os macrófagos têm cada vez mais entram em foco na aterosclerose, fibrose, obesidade e câncer de 7-10. Um método reprodutível para a geração de macrófagos humanos é, portanto, crucial para a compreensão dessas patologias. Aqui é apresentado um método com base no isolamento de monócitos humanos a partir de sangue periférico de dadores saudáveis, por uma técnica de dupla centrifugação de gradiente de densidade, tal como descrito previamente 11. De forma a facilitar a diferenciação no sentido macrófagos, as células monocíticas isolados são incubados na presença de baixas concentrações de FEC-M e soro humano normal a 12. Para facilitar ainda mais o manuseamento e a colheita de células, a diferenciação é realizada no gás de FEP permeávelSacos de cultura de células revestidas com teflon com uma superfície hidrofóbica 12-15. Os macrófagos que descansam resultantes podem ser submetidas a uma vasta gama de ensaios uma vez que ainda são capazes de responder a qualquer uma forma M1 ou M2-like. Métodos alternativos de isolamento de monócitos e subsequente diferenciação, tais como células ativadas magnética triagem (MACS) ou em contra-decantação centrífuga (CCE) tem algumas limitações em relação ao rendimento, custo e tempo necessário. O protocolo aqui descrito oferece a vantagem de que pode ser realizada com equipamento de laboratório padrão, sem a necessidade de reagentes especiais (por exemplo, contas magnéticas MACS) ou dispositivos (por exemplo, aparelhos CCE) e permite que o processamento de grandes quantidades de células.

<table><tbody><tr><td>Anticorpos para imunofenotipagem</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>por exemplo: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), controle de isotipo IgG1-PE (A07796), controle de isotipo IgG1-FITC (A07795)</td></tr><tr><td></td><td>BioLegends</td><td></td><td>por exemplo: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td></tr><tr><td>Microscópio Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>AnaSpec</td><td>89201</td><td></td></tr><tr><td>Cones de fecho com rolha combinada</td><td>Braun</td><td>4495101</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS, sem Ca e Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td>para PBS-EDTA (1 mM) adicionar 1 ml de EDTA 0,5 M por 500 ml de PBS</td></tr><tr><td>10x PBS, sem Ca e Mg</td><td>Invitrogen</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>A Merck</td><td>1084211000</td><td>preparar uma solução de 0,5 M em H2O, use um filtro estéril</td></tr><tr><td>Tampão de dissociação celular (sem enzimas, à base de PBS)</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td> Ficoll <td>inativado por calor</td></tr><tr><td>(densidade 1,077 g/ml)</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse FITC</td><td>santa cruz</td><td>sc-2010</td><td></td></tr><tr><td>LPS de E.coli</td><td>Sigma</td><td>L8274</td><td>conc final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Biochrom AG</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (densidade 1,131 g/ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Perfusor 50 ml</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina TRITC</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>ressuspende em metanol (c = 0,1 mg/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">[cabeçalho]</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur descartáveis de plástico</td><td>Tecnologias LVL</td><td>2655181</td><td></td></tr><tr><td>rh M-CSF</td><td>ImmunoTools</td><td>11343117</td><td>Ressuspender em 500 &micro; l estéril H2O estéril (c = 100 ng/&micro; l), alíquota</td></tr><tr><td>RPMI-1640 com vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 sem vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>11835-063</td><td></td></tr><tr><td>Papel de esterilização</td><td>VP grupo</td><td>3KFKFS230116</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4% p/v)</td>Saco de cultura de células revestido de Teflon <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>FEP, pequeno</td><td>CellGenix</td><td>72-C</td><td></td></tr><tr><td>Saco de cultura de células revestido com teflon FEP, grande</td><td>CellGenix</td><td>197-C</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon cultura de células bags

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Macrófagos humanos estão envolvidos em uma infinidade de processos patológicos que vão desde doenças infecciosas ao câncer. Assim, eles representam uma ferramenta valiosa para compreender os mecanismos subjacentes a estas doenças. Por isso, apresentam um protocolo simples para o isolamento de monócitos humanos a partir de crostas inflamatórias, seguido por um processo de diferenciação, que resulta em rendimentos elevados de macrófagos. A técnica baseia-se principalmente em comumente disponíveis equipamentos de laboratório e, portanto, fornece uma alternativa de custo e tempo efetivo de obter grandes quantidades de macrófagos humanos. Resumidamente, crostas inflamatórias a partir de dadores de sangue saudáveis ​​são submetidas a uma centrifugação de gradiente de densidade dupla para a colheita a partir de monócitos do sangue periférico. Estes monócitos são então cultivadas em fluorados de etileno propileno (FEP) revestido com Teflon sacos de cultura de células na presença de factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF). Os macrófagos diferenciados podem ser facilmente colhidas e usadas para estudos posteriores e funcional quantodiz. Métodos importantes para o controle de qualidade e validação das etapas de isolamento e diferenciação será destacado dentro do protocolo. Em resumo, o protocolo aqui descrito permite aos cientistas rotina e de forma reprodutível isolar macrófagos humanos, sem a necessidade de ferramentas de custo intensivo. Além disso, os modelos de doença pode ser estudado num sistema humano singeneico contornar a utilização de macrófagos de murino.

A primeira centrifugação de gradiente de densidade usando Ficoll produz uma interfase branca contendo as PBMC (Figura 1A), ou seja, os linfócitos e monócitos. Isso pode ser confirmado através de uma coloração May-Gruenwald (Figuras 1B e C) das células coletadas, que mostra tanto um elevado rácio núcleo / citoplasma (típico de linfócitos) e bean- ou núcleos em forma de anel (típica de monócitos). Quando estas células são, então, carregados num gradiente de Percoll utilizando segunda densidade, os monócitos pode ser ainda separado dos linfócitos e novamente aparece como uma interfase branca (Figuras 1E-F). Para cada buffy coat em gradiente de densidade dupla centrifugação descrito rotineiramente produz 150 ± 40 x 10 6 de monócitos, que podem ser diferenciados para 70 ± 30 x 10 6 de macrófagos (Figura 2) por buffy coat. O rendimento médio de macrófagos20 preparações independentes foi de 47 ± 14% do total de monócitos isolados. Após a centrifugação de gradiente de Percoll, ainda pode haver algumas células não monociticas residuais presentes na preparação, que é dependente do dador de sangue, assim como na precisão do processo de isolamento. No entanto, após a fase de diferenciação de 6-7 dias, a preparação é constituído principalmente por macrófagos maduros (Figura 3), que pode ser ainda mais enriquecido, devido à sua aderência a superfícies de plástico, uma característica que não é partilhada por as células contaminantes aleatórios (Figuras 4A e B). Uma vez banhado, a maioria dos macrófagos mostram uma morfologia clássica &quot;ovo frito&quot;, enquanto também existem células com uma esticada fenótipo fusiforme (Figuras 4C e D). Isto reflecte-se a sua distribuição F-actina dentro dos clusters de citoplasma e de adesão. As células diferenciadassão caracterizados pela expressão de CD45, CD14, CD16, CD206 (receptor de manose), CD11b e CD11c, que são marcadores para macrófagos maduros normais (Figura 5). A presença de CD11b argumenta contra uma diferenciação predominantemente dendrítica, que é suportada pelo facto de que as células são negativas para CD209 o marcador de células dendríticas (DC-SIGN). Após o processo de diferenciação, as células permanecem funcionalmente e metabolicamente activa de cerca de 5-7 dias (Figura 6), uma vez que podem ser visualizadas através de calceina AM de coloração e a sua capacidade para assumir vesículas extracelulares derramado a partir de células tumorais. Além disso, as células podem ainda ser activado, como mostrado, por exemplo, para a estimulação com lipopolissacarídeo (LPS), que resulta na expressão de vários genes pró-inflamatórios (Figura 7). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in"src = &quot;/ files / ftp_upload / 51554 / 51554fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Aparência e composição do PBMC- e monócitos-camada após a centrifugação de gradiente de densidade dupla. Fotografia que ilustra (A) a banda de PBMC após o gradiente de Ficoll e (D) a-fase de monócitos após a centrifugação de Percoll iso-osmótico. Colorações Maio-Gruenwald de preparações de citospina do (B, C) ​​e a fracção de PBMC remanescentes (E, F), os monócitos. Barra de escala = 200 um em B e E, = 50 um em C e F. <img alt="Figura 2" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2 Rendimento de monócitos e macrófagos. Contagens celulares representativas dos monócitos e macrófagos isolados de 20 buffy coat preparations. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3. Micrografias e medições do tamanho das células de monócitos e macrófagos. Microscopia de contraste de fase de suspensão de células monocíticas, antes (A) e após (B) a diferenciação de macrófagos. Correspondendo histogramas do tamanho das células de monócitos (C) e os macrófagos (D). Barra de escala = 100 pm. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4 Morfologia e organização do citoesqueleto de macrófagos aderentes. Microscopia de contraste de fase de macrófagos aderentes antes (A) e após (B) A remoção de não-adherenAs células t. (C, D) faloidina-TRITC coloração de actina filamentosa em macrófagos aderentes, não-estimuladas. Barra de escala = 100 mm em AC, 20 um em D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 Imunofenótipo de macrófagos diferenciados. Análise de citometria de fluxo de macrófagos após 6 dias de diferenciação em Teflon FEP-revestidos sacos de cultura de células (indicado em vermelho). Os controles isotipo correspondentes são mostradas em cinza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 6 Captação de microvesículas de células de tumor por macrófagos. Micrografias de macrófagos aderentes após exposição à microvesículas derivadas de células (vermelho fluorescente) PKH26-tumorais marcadas. As imagens são sobrepostas para o correspondente (A) de campo claro ou (B) coloração citosólica com o corante de viabilidade calceína AM. Barras de escala = 100 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7 A sobre-regulação de IL-1 β, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7, e depois de MT1-MMP estimuladormento de macrófagos com LPS (100 ng / ml) durante 24 horas. expressão de genes foi medido por RT-PCR quantitativa a partir de amostras de ARN total (A) e normalizado em HPRT1 e GNB2L1 expressão. Os valores mostrados são as mudanças de dobragem em comparação com o controlo não tratado (média ± DP, n = 5, * p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). TNFa e IL-6 de indução sob estimulação por LPS foram também confirmadas por meio de ELISA (B) (média ± DP, * p &lt;0,05).

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar macrófagos humanos em alta quantidade e qualidade utilizando equipamentos de laboratório padrão. Isso é alcançado primeiro por meio da centrifugação de sangue proveniente de capas leucocitárias em um gradiente de densidade para coletar as CBPMs. Em seguida, em um gradiente de percolação, os monócitos são separados dos linfócitos.Em seguida, os monócitos são semeados em sacos de cultivo celular revestidos com Teflon e diferenciados. Após seis ou sete dias, os macrófagos são colhidos e semeados para estudos subsequentes. As células obtidas devem expressar os marcadores típicos de macrófagos maduros e responder a diversos estímulos, como cocultivo com células tumorais ou estimulação com LPS. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como contracorrente, centrifugação ou separação magnética ativada por células, é que macrófagos humanos podem ser gerados com equipamentos lip padrão, sem a necessidade de reagentes ou instrumentos caros.Embora este método seja fácil de realizar, indivíduos novos nesse procedimento podem ter dificuldades em visualizar e separar as diferentes populações celulares nos gradientes de densidade. Portanto, uma demonstração visual dessas etapas ajudará a superar essas dificuldades. Este protocolo é realizado em duplicata para facilitar o balanceamento dos rotores.Primeiro, desinfete duas bolsas da fração de camada de buffy provenientes de sangue separado por centrifugação. Em seguida, transfira as camadas de buffy para dois tubos de 50 mililitros para cada camada de buffy. Prepare três tubos de 50 mililitros com 15 mililitros de solução FI call a temperatura ambiente, com densidade de 1,077 gramas por mililitro.Agora, lentamente e com cuidado, adicione 30 a 35 mililitros de camada espumosa sobre cada tubo de FI call. As camadas não devem se misturar; centrifugue esses tubos sem interrupção a 400 ×g por meia hora. Entre as duas fases, à temperatura ambiente, formará-se um anel branco de células mononucleares do sangue periférico.Remova essas camadas com uma pipeta de plástico. Combine as camadas dos três tubos de cada doador em dois tubos de 50 mililitros por doador. Lave as células coletadas adicionando P-B-S-E-D-T-A 1 milimolar até a marca de 40 mililitros e, em seguida, centrifugue-as a 300 ×g por 10 minutos sem desaceleração, à temperatura ambiente.Agora aspire e descarte os sobrenadantes. Em seguida, repita a lavagem e ressuspenda os pellets em P-B-S-C-D-T-A, reunindo os pellets de cada doador em 20 mililitros de RPMI acrescido de FCS sem vermelho de fenol. Deve haver agora um tubo de células por doador.Agora prepare a segunda mistura para gradiente de densidade, combinando 23,13 mililitros da solução percal à temperatura ambiente com 1,87 mililitro de PBS 10X em um tubo de 50 mililitros. Prepare um tubo da mistura para cada duas amostras. Em seguida, transfira 23 mililitros da mistura para um novo tubo de 50 mililitros.Em seguida, adicione 27 mililitros de RPMI acrescido de FCS com vermelho de fenol. O resultado é uma solução osmótica por célula de 46% ISO. Agora, para cada doador, transfira 25 mililitros da solução a 46% para um tubo de 50 mililitros e sobreponha cuidadosamente a mistura celular.As duas fases devem ser distinguíveis por suas cores, sem interrupção. Centrifugue as células por meia hora à temperatura ambiente e a 550 G. Um anel branco de monócitos se formará entre as duas fases. Colete essas células em um tubo de 50 mililitros com uma pipeta de plástico.Lave os monócitos com P-B-S-E-D-T-A de um milimolar, completando até a marca de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue-os a 400 G sem interrupção por 10 minutos à temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e re-suspenda os monócitos sedimentados em 20 mililitros de meio. Em seguida, prossiga com a próxima seção.Este protocolo utiliza sacos de cultura revestidos com Teflon FEP como câmara de cultivo. Comece estimando o número de monócitos coletados. Os monócitos são grandes e frequentemente possuem formato irregular.Não conte os linfócitos menores. Se estiverem disponíveis 100 a 150 milhões de células de um mesmo doador, prepare 180 mililitros de RPMI suplementado. Se houver menos células, prepare volumes de 30 mililitros de meio para cada 30 a 50 milhões de células.Em uma alíquota de 20 mililitros, misture cuidadosamente as células aos 180 mililitros do meio preparado. Em seguida, carregue a bolsa de cultura com as células utilizando uma seringa perfusora de 50 mililitros acoplada à tampa da bolsa de cultura. Remova a seringa, elimine o ar remanescente e feche a tampa com um cone.Agora, incube as bolsas por seis a sete dias com 5% de dióxido de carbono. Após seis a sete dias de incubação, transfira as bolsas de cultura para gelo para colher as células; imerja completamente as bolsas em gelo e deixe esfriar por uma a três horas para destacar as células. Em seguida, puxe suavemente as bolsas sobre uma borda cerca de 10 vezes.Em seguida, desinfete completamente o exterior das bolsas. Substitua o cone do plugue por uma seringa de 50 mililitros. Em seguida, aspire a suspensão celular e transfira para um tubo de 50 mililitros.Quando todos os tubos forem coletados, centrifugue-os a 400 G durante 10 minutos à temperatura ambiente, aspire então o sobrenadante e reúna todas as células em 10 mililitros de RPMI mais FCS. Em seguida, conte as células como anteriormente. Conte apenas os macrófagos, pois linfócitos residuais podem estar presentes.Em seguida, utilize as células para a aplicação de interesse para reutilizar as bolsas de cultura. Lave-as duas vezes com etanol 70%. Em seguida, preencha-as com 50 mililitros de etanol 70% e incube-as durante a noite à temperatura ambiente; no dia seguinte, enxágue as bolsas três vezes com PBS estéril.Em seguida, envolva-os em papel de esterilização e autoclave-os. Um saco pode facilmente ser reutilizado 10 vezes o gradiente de densidade. As centrifugações resultam em uma interface branca contendo linfócitos e monócitos.Aqui examinamos o primeiro gradiente de densidade. May Grunwald. A coloração dessas células mostra tanto uma alta relação núcleo-citoplasma, típica de linfócitos, quanto núcleos em forma de feijão ou em anel, típicos de monócitos.Essas colorações mostram os resultados do segundo gradiente. Cada camada de buffy coat produz cerca de 150 milhões de monócitos, que podem ser diferenciados em cerca de 70 milhões de macrófagos. Em 20 preparações, 47% dos monócitos se transformaram em macrófagos.Os macrófagos purificados podem ser ainda mais enriquecidos pela aderência a superfícies de plástico, uma característica que não é compartilhada pelas células contaminantes. Após o plaqueamento, a maioria dos macrófagos apresenta uma morfologia em forma de ovo frito, enquanto outros exibem um fenótipo alongado semelhante a um fuso. As células são caracterizadas pela expressão de diversos marcadores.Típico de macrófagos maduros. A expressão de CD11b contraindica uma diferenciação dendrítica, assim como a ausência de expressão de CD209. Após a diferenciação, as células permanecem funcional e metabolicamente ativas por cinco a sete dias.A coloração por cálcio de células viáveis mostra sua capacidade de incorporar vesículas extracelulares marcadas com cor vermelha, provenientes de células tumorais. Além disso, os macrófagos podem ser ativados; por exemplo, a estimulação com lipopolissacarídeo resulta na expressão de diversos genes pró-inflamatórios. Após este procedimento, os macrófagos isolados podem ser submetidos a uma ampla gama de ensaios funcionais, com o objetivo de responder questões fundamentais sobre a biologia dos macrófagos na saúde e na doença.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar grandes quantidades de macrófagos humanos. No entanto, é importante lembrar que você está trabalhando com amostras de sangue humano, que podem ser potencialmente infecciosas.

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de monócitos do sangue humano total por separação imunomagnética negativa. Os monócitos isolados podem ser usados para análises posteriores a jusante.

Isolamento de Monócitos de Sangue Total por Seleção Imunomagnética Negativa

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para induzir a diferenciação e polarização de monócitos derivados do sangue periférico em macrófagos M1 ou M2. A incubação com fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos, lipopolissacarídeo e interferon-gama produz macrófagos M1 pró-inflamatórios, enquanto a incubação com fator estimulador de colônias de macrófagos e interleucina-4 induz a produção de macrófagos M2 anti-inflamatórios.

Diferenciação e Polarização de Células Derivadas de Monócitos em Células Semelhantes a Macrófagos

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Apresentamos um protocolo para obter assinaturas de proteomic de macrófagos humanos e aplicar isso a determinação do impacto de um ambiente de baixo oxigênio na polarização do macrófago.

Análise de Proteomic do macrófago humano polarização sob um ambiente de baixo oxigênio

Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Macrófagos associados ao tumor M2 (TAM) estão associados à progressão do tumor e ao prognóstico ruim no câncer. Este protocolo serve como um guia detalhado para reproduzir e polarizar células semelhantes a monócitos THP-1 em macrófagos semelhantes a M2 dentro de 14 dias. Este modelo é a base para investigar os efeitos anti-inflamatórios da TAM dentro do microambiente tumoral.

Diferenciação e polarização do macrófago em um fenótipo semelhante a M2 usando uma linha celular de leucemia THP-1 semelhante ao monocito humano

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a interação de macrófagos primários derivados de monócitos humanos com um esferóide tumoral em uma matriz tridimensional (3D) de colágeno I, com a possibilidade de comparar o impacto das propriedades solúveis e físicas do microambiente na invasão celular.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Aprenda a isolar monócitos humanos por centrifugação em gradiente de densidade dupla e diferenciá-los em macrófagos usando bolsas de cultura revestidas com teflon. Este método eficiente gera cerca de 70 milhões de macrófagos funcionais por amostra.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

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