Name: Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprenda a induzir trauma cerebral agudo em camundongos para estudos de neurociência usando microscopia de dois fótons. Este método permite observar o comportamento celular em tempo real e desenvolver estratégias terapêuticas.

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Estamos profundamente agradecidos ao Dr. Frank Kirchhoff para a prestação de GFAP-EGFP e cepas CX3CR1-EGFP do mouse. O trabalho foi suportado por concessões do Centro de Mobilidade Internacional da Finlândia, Tekes, o finlandês Graduate School of Neuroscience (FGSN) e da Academia da Finlândia.

Todos os procedimentos aqui apresentados foram realizados de acordo com a orientação local para cuidar dos animais (A lei finlandesa de Experimentação Animal º 62/2006). Licença Animal (ESAVI/2857/04.10.03/2012) foi obtida de autoridade local (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Camundongos adultos de 1-3 meses de idade, peso 24-38 g, foram mantidos em gaiolas individuais no biotério da Universidade de certificado e desde que com comida e água ad libitum. 1. Lesão Cerebral de imagem através de uma janela Cranial <ol><li> Anestesiar animais e preparar o campo de operação <ol><li> Anestesiar os ratos por injecção peritoneal de uma mistura de cetamina (Ketalar, 80 mg / kg) e xilazina (Rompun, 10 mg / kg) dissolvido em solução salina tampão de fosfato, esterilizada por filtro (PBS), pH 7,4. Confira os reflexos do rato regularmente (cauda e sonda pitada tep) para verificar a profundidade da anestesia. Aumentar a dose se necessário, para manter a anestesia adequada, mas evitar Overdose. </li><li> Manter o animal a 37,0 ° C utilizando uma almofada de aquecimento durante a operação cirúrgica, sessão de imagem e primeira hora após a recuperação da anestesia. </li><li> Para proteger os olhos do rato de secar, aplique um lubrificante ocular. </li><li> Administrar dexametasona (veterinário Rapidexon, 2 mg / kg) por injecção subcutânea para reduzir a inflamação e edema cerebral. </li><li> Administrar um analgésico (por exemplo, por via intraperitoneal Ketoprophene) até 30 minutos antes ou imediatamente após a cirurgia. Se o animal apresenta quaisquer sintomas de dor, como a relutância em se movimentar, comer ou beber, ou perda de peso, salivação, piloereção, ou respiratória sons anormais após a cirurgia, repetir a injeção de analgésico. </li><li> Raspar a cabeça de rato &quot;, com uma máquina de barbear (ver Materiais e Equipamentos). Evite danificar os bigodes. </li><li> Tratar a pele na cabeça do rato com uma solução de etanol 70% para limpar a área raspada. </li><li> Usando uma tesoura cirúrgica (ver Materiais eEquipamentos) e fórceps (ver Materiais e Equipamentos), corte a pele da linha média entre as orelhas para a testa. </li><li> Delicadamente raspar o tecido conjuntivo ligado ao crânio com uma lâmina microcirúrgica contundente. </li><li> Deslize fronteiras de pele de lado e puxe barras de ouvido ligeiramente em orifícios auditivos do crânio para a cabeça e fixação da pele. </li><li> Limpe o crânio com PBS estéril e tratar o local da cirurgia na cabeça do rato com 0,5% de digluconato de clorexidina, em seguida, secar a superfície do crânio usando uma combinação de cotonetes estéril e ar comprimido. </li></ol></li><li> Infliction da lesão picada <ol><li> Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com um suporte de animais (ver Materiais e Equipamentos). </li><li> Ajustar a posição do microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal. </li><li> Utilizando um microscópio binocular, localizar o ponto bregma no crânio. </li><li> Identificar a region de interesse, utilizando as coordenadas estereotáxica. NOTA: Evite as áreas de interesse que estão localizados diretamente sobre os vasos corticais superficiais. Destruição destes pode afetar fortemente a progressão trauma. </li><li> Posicione a agulha 30 G acima da região escolhida e marcar o local de destino, arranhando a superfície do crânio. </li><li> Perfurar o crânio com todas as precauções possíveis para evitar a ampliação desnecessária da superfície osso afetado. Use uma broca cirúrgica de alta velocidade (ver Materiais e Equipamentos) sob o microscópio. Pare de perfurar se líquido aparece na área perfurada. </li><li> Tocar no fundo do poço perfurado com agulha. </li><li> Mergulhar a agulha suavemente no cérebro (taxa de inserção 5-10 mm / min), para a profundidade de 0,5-2,0 mm, de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada. </li><li> Remova a agulha imediatamente após atingir a profundidade desejada (taxa de retração 5-10 mm / min) e limpar o sangue que aparece após a picada com um pequeno tampão (see Materiais e equipamentos). </li><li> Realize microinjeção de 100 M Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão usando uma bomba de micro-seringa (WPI) e 10 mL Hamilton seringa montar com pipeta de vidro. NOTA: Durante a preparação da pipeta de vidro de borosilicato capilar de vidro, aguçar a ponta de um diâmetro de 10-20 m. </li><li> Infundir 250-1,500 nl de solução de injecção a uma taxa de 2-5 nl / seg. NOTA: Deixe a pipeta após o término da infusão por pelo menos 5 minutos em parênquima cerebral, em seguida, removê-lo devagar e com cuidado para evitar a solução de saída. </li></ol></li><li> Craniotomia para janela craniana crônica <ol><li> Fure o crânio delicadamente e com cuidado para fazer uma janela de círculo em torno do local da lesão. Use diâmetro janela de 3-3,5 mm. </li><li> Aplicar uma gota de tampão de córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2 mM e 2 mM de MgSO4 em H2O destilada) para cobrir o window. </li><li> Coloque uma lamela de vidro redondo (# 1.5 espessura) na janela craniana. </li><li> Remover o excesso de tampão de córtex em torno da lamela. </li><li> Selar as bordas da lamínula com cola poliacrílico (ver Materiais e Equipamentos). NOTA: Assegurar que a cola não é aplicada à superfície superior da lamela. Se a tampa de vidro está contaminado com cola, espere até que o vidro é estavelmente colado ao crânio e a cola na superfície do vidro fica seca, em seguida, retire cuidadosamente a cola contaminar com uma micro-lâmina. </li><li> Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar. </li><li> Usando os parafusos altura da barra de ouvido, ajuste a posição da cabeça, de modo que o suporte do metal pode ser colocado. </li><li> Aplique uma pequena quantidade de cola poliacrílico no anel do suporte do aço (ver Materiais e Equipamentos). </li><li> Cole o anel do suporte do aço na lamela de vidro com o punho suporte de metal dirigido para trás. </li><li> Aguarde 5 minutos para deixar a cola secar. </li><li> Mix cimento dental (ver Materiais e equipamentos) com cola poliacrílico em um prato de Petri 3,5 centímetros (ou analógico) para alcançar condições viscosos. </li><li> Selar as bordas da janela craniana com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura até a fronteira da pele. </li><li> Aguarde 15 minutos para deixar a mistura de cola cimento + secar e, em seguida, remover as barras de ouvido. </li><li> Realize dois fótons de excitação microscópica (TPEM) de imagem para a região de interesse e uma área de controle, uma vez que definido no protocolo 3. </li><li> Depois de imagem, permitem que o animal se recuperar da anestesia em uma almofada de aquecimento e mantê-lo em uma gaiola indivíduo sob observação até a recuperação completa. Alimentos úmidos pode ser dada para facilitar a mastigação e hidratação. </li></ol></li></ol> 2. Lesão Cerebral de imagem através do crânio afinado <ol><li> Anestesiar animais e preparar o campo de operação <ol><li> Anestesiar o mouse e prepará-lo para a indução do traumatal como descrito na etapa 1.1. </li></ol></li><li> Crânio afinamento e imposição da lesão picada <ol><li> Posicione um animal pequeno instrumento estereotáxico com o suporte do animal (ver Materiais e equipamentos). </li><li> Ajustar a posição de um microscópio binocular ao lado do instrumento estereotáxico para focar na superfície do crânio do animal. </li><li> Localize o ponto bregma no crânio usando o microscópio binocular, identificar a área do cérebro a ser trabalhada com base nas coordenadas estereotaxia e marcá-lo riscando. NOTA: Crânio posição desbaste não deve ser localizado sobre ou perto suturas cranianas, como a estabilidade crânio é comprometido nessas áreas. Além disso, grandes vasos e meninges localizados abaixo das suturas do crânio corticais ou meninges são susceptíveis de causar artefatos de imagem. </li><li> Colocar o suporte metálico revestido com cola ao longo da área de interesse no crânio do animal, aplicar uma ligeira pressão e esperar cinco minutos, até o suporte do metal é firmemente colado ao crânio. </li&gt; <li> Misturar o cimento dental (ver Materiais e Equipamento) com cola poliacrílico em uma placa de Petri de 3,5 cm (ou análogo) para alcançar condições viscosos. </li><li> Selar as bordas do suporte de metal com a mistura de cola + cimento e cobrir a superfície exposta do crânio com a mesma mistura-se até à fronteira da pele. </li><li> Aguarde 15 minutos para deixar o cimento e mistura de cola secar. </li><li> Lavar a região crânio diluído e as partes circundantes de suporte metálico várias vezes com PBS, de modo que os restos de cola nonpolymerized são lavados. NOTA: É fundamental garantir a fixação estável do crânio ao titular. Isto permite que a estabilidade durante a preparação de imagem. </li><li> Usando o modo de alta ampliação do microscópio binocular, remover as camadas superiores do osso do crânio com um micro-broca de alta velocidade para criar uma área de crânio diluído de ~ 0,5-1,5 mm de diâmetro. Use ar comprimido durante a perfuração para remover os escombros do osso. Realize o intermittentl perfuraçãoy durante o processo de desbaste de modo a evitar o sobreaquecimento induzida por fricção. Arrefece-se a broca com a solução à temperatura ambiente e aplicar periodicamente tampão para a zona adelgaçada para absorver o calor. NOTA: Para evitar danos ao córtex, não perfurar em grandes regiões (&gt; 1,5 mm) até uma camada fina (&lt;50 mm). NOTA: A estrutura de roedor osso do crânio é constituído por duas camadas finas de osso compacto separadas por uma camada espessa de osso esponjoso. Cavidades minúsculas da forma de osso esponjoso círculos concêntricos e canalículos, que contêm vasos sanguíneos. Utilizar a microdrill para remover tanto a camada externa de osso compacto e mais da camada esponjosa. O rompimento dos vasos sanguíneos dentro do osso esponjoso pode provocar sangramento. Use esponja de colágeno hemostasia para parar o sangramento. </li><li> Use geração de segundo harmônico (SHG) de imagem para analisar se a maior parte do osso esponjoso foi removido. Tenha cuidado para evitar desbaste excessivo, certifique-se que o osso restante é thicker do que 50 um, nesta fase da preparação. </li><li> Coloque uma gota de tampão quente (35-37 ° C) no topo da região diluído. Use uma lâmina microcirúrgica ou acabamento Micro Bur para remover mais camadas de osso e formam uma zona lisa de ~ 700 um de diâmetro com a espessura do osso de ~ 20 mM. Durante este passo, que é útil para realizar imagiologia de SHG repetitivo e regularmente medir a espessura do osso. </li><li> Realize imagem TPEM para a região de interesse e uma área de controle. </li><li> Ajustar a posição de cabeça utilizando os parafusos de barra de altura da orelha, de tal maneira que a região é diluído posicionados rigorosamente horizontalmente. Posicione a agulha acima da região diluída e certifique-se de que não existem grandes navios sob o local alvo. </li><li> Fazer uma lesão por meio de imersão da agulha no cérebro, com a profundidade de 0,5-2,0 mm da superfície do crânio e afinada de acordo com as coordenadas do local de aplicação da picada. </li><li> Remova a agulha e suprimir a hemorragia que aparece depois de tele lesão cerebral aguda com tampão hemostático (ver Materiais e equipamentos). Espere até que os coágulos de sangue forma e pulsação vaso no local da lesão pára. </li><li> Realizar a microinjecção de 100 uM Sulforodamina 101 ou outro composto de interesse para o local da lesão, tal como acima descrito na secção 1.2.10. </li><li> Realize imagem TPEM para monitorar a progressão de lesões e recuperação, conforme descrito no Protocolo no 3. </li><li> Depois de imagem, permitem que o animal a recuperar a consciência da anestesia em uma almofada de aquecimento. Não deixe o animal sem supervisão e devolvê-lo à sua gaiola somente após a recuperação física completa. </li></ol></li></ol> 3. Imagem <ol><li> Colocar o animal sob o microscópio, anexando o suporte do metal para o quadro personalizado construído. </li><li> Para imagens, use por exemplo, o FV1000MPE dois fótons microscópio equipado com Mai Tai DeepSee laser e XLPLN 25X 1,05 NA objetivo de imersão em água otimizado para in vivo de dois fótonsimagiologia. </li><li> Identificar o local da lesão ao microscópio usando o modo de fluorescência de campo amplo. Utilize filtros passa longos para visualizar vasculatura cerebral e selecionar a área de controle de acordo com o padrão observado dos vasos sanguíneos. </li><li> Para a imagem do sinal de geração de segundo harmônico (SHG), ajustar o laser de femtosegundos para o comprimento de onda de 800 nm e coletar a luz emitida usando o filtro de desvio nm 380-410. Para imagens de fluorescência, utilize o filtro passa-banda (515-560 nm) para coletar a luz emitida, e os seguintes comprimentos de onda são usados ​​para excitar a fluorescência: GFP-860 nm, YFP-950 nm. </li><li> Use software FluoView para aquisição de imagem. </li><li> Coordena loja de cada ROI para posterior imagem repetitivo. Imagem da mesma ao longo do tempo de ROIs, e ajustar as coordenadas de cada vez para maximizar a sobreposição de imagem. </li><li> Analisar as imagens com o software apropriado (por exemplo,. ImageJ). Reconstruções aqui apresentados foram feitos usando software Imaris. </li></ol>

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<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J. Vis. Exp. 61, (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Trauma cerebral é um evento abrupto, imprevisível. Aqui, nós descrevemos o modelo animal que reproduz um espectro de alterações patológicas observadas em pacientes humanos após a lesão do cérebro, tais como a neurodegeneração, a eliminação de dendritos, edema cerebral, cicatriz glial, hemorragias no córtex cerebral, juntamente com uma hemorragia subaracnóide focal e aumento da permeabilidade da barreira sangue-cérebro. Estudar patogênese primário e secundário, bem como a recuperação após o trauma, este modelo foi combin...

Lesão cerebral aguda é um problema significativo de saúde pública, com alta incidência de lesões em acidentes de trânsito, quedas ou agressões, e alta prevalência de incapacidade crônica subseqüente. As abordagens terapêuticas para o tratamento de lesões cerebrais permanecem totalmente sintomático, limitando assim a eficácia do atendimento pré-hospitalar, cirúrgico e crítico. Isso faz com que o impacto social e econômico da lesão cerebral particularmente grave. Por uma variedade de razões, a maioria dos ensaios clínicos não demonstraram melhoria na recuperação após a lesão cerebral usando novas abordagens terapêuticas. Os modelos animais são cruciais para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para uma fase em que a eficácia da droga pode ser previsto em pacientes com lesões cerebrais. Atualmente, existem vários modelos animais bem estabelecidos de traumatismo craniano, incluindo o impacto controlado cortical 1, o fluido lesão percussão 2, dinâmico deformação cortical 3, peso-drop4 e lesão foto 5. Uma série de modelos experimentais têm sido utilizados para estudar certos aspectos morfológicos, moleculares e comportamentais de cabeça associada a trauma patologia. No entanto, nenhum modelo animal único é totalmente bem-sucedido na validação de novas estratégias terapêuticas. Desenvolvimento de modelos animais confiáveis, reprodutíveis e controladas de lesão cerebral é necessário avaliar os processos patológicos complexos. A nova combinação das mais recentes tecnologias de imagem microscópica e repórteres fluorescentes geneticamente codificados oferece uma oportunidade sem precedentes para investigar todas as fases da lesão cerebral, que incluem lesão primária, espalhando-se da lesão primária, a lesão secundária e regeneração. Em particular, in vivo microscopia de dois fótons é uma tecnologia óptica não-linear única que permite a visualização em tempo real das estruturas celulares e subcelulares mesmo em profundas camadas corticais do cérebro de roedores. Vários tipos de células e organelles podem ser visualizados simultaneamente, combinando diferentes marcadores fluorescentes. Usando essa poderosa ferramenta, podemos visualizar as alterações morfológicas e funcionais dinâmicos no cérebro vivendo sob condições pós-traumáticas. As vantagens da microscopia in vivo de dois fótons em estudar lesão cerebral foram recentemente demonstrado pelo Kirov e colegas 6. Usando um modelo de contusão cortical focal leve, estes autores mostraram que a lesão dendrítica aguda no córtex pericontusional é fechado pela diminuição do fluxo sanguíneo local. Além disso, demonstraram que o córtex metabolicamente comprometida em torno do local contusão é mais danificado pela despolarização espalhar. Este dano secundário afeta circuitos sinápticos, tornando as conseqüências da lesão cerebral traumática mais grave. Aqui, propõe-se o método de picada estereotáxico com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação tópica de drogas em simultâneo, como um modelo avançado para o local do cérebrolesão e como uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas do trauma agudo no cérebro de mamíferos in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pinça muda 2A-sa, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G &frac12; na agulha</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>Aparador de animais, máquina de barbear</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Binocular</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de Temperatura Biológico com almofada de aquecimento de aço inoxidável</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina microcirúrgica romba</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de borossilicato com filamento</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Para produção de pipetas de vidro</td></tr><tr><td>Carprofeno</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Digluconato de clorexidina</td><td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Cimento dentário</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon veterinário</td><td></td></tr><tr><td>Brocas descartáveis</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fórceps, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodos Ealing</td><td>Ealing</td><td>50-2013</td><td>Extrator vertical para produção de pipetas de vidro</td></tr><tr><td>Pomada para os olhos</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Controle de broca Foredom</td><td>FM3545</td><td></td>Peça <td></td></tr><tr><td></td><td>de mão micromotor ForedomForedom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Plataforma de anestesia a gás para camundongos</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>Montado em instrumento estereotáxico</td></tr><tr><td>Hemostasia Colágeno Esponja</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suporte de metal</td><td>Neurotar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microdressing fórceps, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>Micro capilares de enchimento de seringas</td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de varredura a laser multifotônico</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>Seringa NanoFil 10 &mu; l</td><td>Seringa WPI</td><td>NANOFIL</td><td>Hamilton</td></tr><tr><td>Cotonetes não tecidos 5 x 5 Tampões</td><td>cirúrgicos</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td></tr><tr><td>Cola poliacrílica</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Lamínula de vidro redonda&nbsp;</td>Ciências <td></td><td></td><td>de Microscopia Eletrônica</td></tr><tr><td>1.5 espessura&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequenos animais</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de rato e rato neonatal Stoelting</td><td></td><td>51625</td><td>Montado em instrumento estereotáxico.</td></tr><tr><td>Tesoura de íris de estudante, reta 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sulforrodamina 101</td><td>Sondas Moleculares</td> Bomba de microsseringa <td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 e controlador de bomba de micro 4 microseringas</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>Microinjetor e controlador</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun vet</td><td></td></tr></tbody></table>

aguda cérebro trauma em camundongos seguiu por longitudinal dois fótons de imagem

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Embora trauma cerebral aguda muitas vezes resulta de danos à cabeça em diferentes acidentes e afeta uma fração substancial da população, não existe um tratamento eficaz para ele ainda. Limitações dos modelos animais usados ​​atualmente impedem a compreensão do mecanismo de patologia. Microscopia Multiphoton permite o estudo de células e tecidos dentro cérebros de animais intactos longitudinalmente sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui, descrevemos dois modelos de lesão cerebral aguda estudados por meio de dois fótons de imagem de comportamento das células do cérebro em condições pós-traumáticas. A região do cérebro selecionado é ferido com uma agulha fina para produzir um trauma de largura controlada e profundidade no parênquima cerebral. O nosso método utiliza estereotáxico picada com uma agulha de seringa, que pode ser combinado com a aplicação simultânea de drogas. Propomos que este método pode ser utilizado como uma ferramenta avançada para estudar os mecanismos celulares de consequências fisiopatológicos de traumas agudos no cérebro dos mamíferos <em&gt; In vivo. Neste vídeo, nós combinamos lesão cerebral aguda com duas preparações: cranial janela e crânio de desbaste. Discutimos, também, vantagens e limitações de ambos os preparativos para várias sessões de imagem de regeneração cerebral após trauma.

Nós otimizamos dois procedimentos de operação: 1) janela craniana crônica e 2) desbaste crânio, para imagiologia cerebral pós-traumático em camundongos transgênicos. Representação esquemática das preparações experimentais é apresentada na Figura 1. Traumática por picada de agulha de aço de 0,3 mm de diâmetro externo (30 L) é aplicada ao poço perfurado (Figura 1A). A preparação janela craniana bem sucedido permite imagens em profundidades de até 650 mícrons abaixo da superfície pial <str...

Trauma cerebral aguda é uma lesão grave que não tem tratamento adequado à data. Microscopia Multiphoton permite estudar longitudinalmente o processo de desenvolvimento agudo trauma cerebral e sondagem estratégias terapêuticas em roedores. Dois modelos de trauma cerebral aguda estudou com in vivo de dois fótons de imagem de cérebro são demonstrados neste protocolo.

Aguda Cérebro Trauma em camundongos seguiu por Longitudinal dois fótons de imagem

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Olá, sou Michel iv, pesquisador pós-doutorando no Centro de Neurociência da Universidade de Helsinque. Olá, sou Hel Stein, estudante de pós-graduação na Universidade de Helsinque. Neste vídeo, descreveremos um método para aplicação de um trauma agudo local em um cérebro de camundongo, visando posterior imagem por fotografia do comportamento celular cerebral e das condições pós-traumáticas.Lesão cerebral aguda é uma patologia grave que afeta uma proporção significativa da população em países desenvolvidos. A microscopia multiphoton permite estudar células no contexto tecidual em cérebros vivos de roedores sob condições fisiológicas e patológicas. Aqui descrevemos um método de lesão cerebral aguda aplicado como uma punção estereotáxica com agulha de seringa, seguida por imagem de dois fótons do comportamento celular cerebral e das condições pós-traumáticas.O método de indução estereotáxica de lesão cerebral local é uma ferramenta para estudar as consequências fisiopatológicas de trauma agudo. No cérebro de mamíferos, uma região cerebral específica pode ser direcionada e lesionada com uma agulha afiada para produzir um trauma de largura e profundidade desejadas no parênquima cerebral. Neste vídeo, utilizaremos lesão cerebral aguda em combinação com procedimentos de janela craniana ou afinamento do crânio, seguidos por imagem de dois fótons de neurônios e gliócitos no cérebro pós-traumático.Todos os experimentos apresentados aqui são realizados de acordo com as regulamentações da Universidade de Helsinque para experimentos com animais; o camundongo é anestesiado por injeção intraperitoneal de cetamina e zine. Um pedaço de pele é removido para expor o crânio e o animal é então fixado usando barras auriculares na mesa aquecida acoplada ao manipulador estereotáxico. Uma seringa com uma agulha de aço de diâmetro de 0,3 milímetro é fixada no dispositivo de microinjeção.A configuração de microinjeção permite aplicar uma picada traumática em uma área definida do cérebro utilizando um microscópio binocular; localizamos o ponto bregma no crânio. Identificamos a região de interesse utilizando as coordenadas estereotáxicas. Perfuramos suave e cuidadosamente o crânio no ponto marcado usando uma broca cirúrgica de alta velocidade.Aplicamos a picada no poço perfurado e imergimos brevemente a agulha no cérebro de 0,5 a dois milímetros de profundidade, partindo do nível da base do poço. Uma vantagem notável deste método é que podemos injetar água destilada ou fármacos no mesmo poço pequeno e, portanto, entregar as soluções com precisão no local da lesão. Para a administração de soluções na córtex, utilizamos um microinjetor com controlador eletrôn游戏副本ico e uma seringa de 10 microlitros acoplada a um manipulador estereotáxico.Quando a ponta da pipeta de vidro toca a superfície do cérebro, avançamos mais 0,5 a um milímetro. Em seguida, utilizamos o controlador de microinjeção para injetar 0,5 a dois microlitros de solução de D ou de fármaco no cérebro, à taxa de cinco nanolitros por segundo. Em seguida, o osso é cuidadosamente perfurado ao redor do local da lesão e o fragmento circular do crânio é removido.A superfície do cérebro é lavada com um tampão de córtex e uma lamínula redonda e fina é colocada sobre a abertura no crânio. A lamínula é selada com cola de poliacrilamida e o suporte de aço é colado sobre a lamínula. Para garantir uma fixação firme da janela craniana ao crânio, o cimento dental é aplicado ao redor de todo o suporte.O camundongo anestesiado é posicionado no microscópio de dois fótons, e as células são imagens no local da lesão dentro do cérebro vivo. Esta imagem foi obtida três horas após a lesão cerebral. O local da lesão é mostrado no cérebro de um camundongo transgênico que expressa GFP sob o promotor GFAP em astrócitos.Além dos astrócitos verdes que expressam GFP, muitas células astrogliais são coradas em vermelho pela injeção de ruminha de enxofre 1 0 1. As fibras brancas representam o sinal de geração de segundo harmônico, presumivelmente visualizando as estruturas fibrilares na matriz extracelular. A geração de segundo harmônico revela-se uma ferramenta valiosa para delimitar o local da lesão.O sinal é emitido por estruturas não simétricas centrais, como fibras proteicas, e não requer qualquer coloração exógena. O sinal de geração do segundo harmônico é mais intenso na superfície do cérebro e não se propaga profundamente no parênquima cerebral. Nesta imagem, é possível observar o acúmulo de micróglias ativadas no local da lesão.As células microgliais são mostradas em verde e a geração de segundo harmônico em cinza. Na proximidade do local da lesão, a microglia ativada exibe uma morfologia característica com poucos prolongamentos ramificados enquanto se prepara a superfície do crânio. Utilize coordenadas estereotáxicas para localizar a área cerebral a ser imageada e marque-a com uma caneta.Evite áreas de interesse localizadas diretamente sobre os buscadores cranianos, pois o crânio é menos estável nessas regiões e porque os grandes vasos subjacentes nas meninges comprometerão a qualidade da imagem. Posicione o suporte craniano codificado com cola sobre a área de interesse no crânio do animal, aplicando pressão mínima. Em seguida, aplique cimento dental ao redor do suporte e aguarde aproximadamente cinco minutos para que o suporte craniano fique firmemente colado ao crânio.Lave a abertura do suporte do crânio várias vezes com PBS para remover a cola não polimerizada residual. Sob um microscópio binocular, remova cuidadosamente uma área circular do crânio, normalmente com diâmetro entre 0,5 e 1,5 milímetros, acima da região de interesse. O crânio do camundongo é composto por duas camadas finas de osso compacto e uma camada espessa de osso esponjoso situada entre elas.O osso esponjoso contém pequenas cavidades dispostas em círculos concêntricos e múltiplos canalículos que contêm vasos sanguíneos; ao afinar, remova a camada externa de osso compacto e a maior parte do osso esponjoso. Utilizando uma microfresa de alta velocidade, use ar comprimido durante a perfuração para remover os detritos ósseos. Realize a perfuração de forma intermitente para evitar o superaquecimento do osso causado pelo atrito.Resfrie, a parte entediante no líquido, mantida à temperatura ambiente, e aplique periodicamente o tampão de córtex na área de adelgaçamento para observar o calor. Algum sangramento dos vasos que percorrem o osso esponjoso pode ocorrer durante o processo de adelgaçamento. Esse sangramento geralmente cessará espontaneamente em alguns minutos.Utilize a imagem de geração de segunda harmônica para garantir que a maior parte do tecido ósseo esponjoso seja removida. Nesta etapa, a espessura do crânio ainda deve ser de no mínimo 50 micrômetros. Mergulhe o crânio em uma gota do tampão de córtex e continue o procedimento de afinamento do crânio usando uma lâmina microcirúrgica ou uma broca de acabamento micro para obter uma preparação muito fina e lisa, com aproximadamente 20 micrômetros de espessura e 700 micrômetros de diâmetro. Durante a fase final do processo de afinamento, examine repetidamente a preparação utilizando a imagem de geração de segunda harmônica.A região escolhida pode ser imageada antes e depois da indução da lesão. Diversas áreas diferentes da região fina devem ser imageadas para controlar possíveis artefatos induzidos pela cirurgia para a indução do trauma. Posicione a agulha acima da região fina.Certifique-se de que não há vasos grandes subjacentes. Mergulhe a agulha no cérebro de 0,5 a dois milímetros para baixo, de acordo com as coordenadas do local de aplicação da punção. Remova a agulha e controle a hemorragia que aparece após a lesão cerebral aguda.Com um tampão hemostático, aguarde até que os coágulos sanguíneos se formem e a pulsação no local da lesão diminua. Soluções contendo, por exemplo, Rumine 1 0 1 de enxofre ou outros corantes podem ser injetadas na abertura da lesão da mesma forma demonstrada acima para o preparo da janela craniana. Em contraste com a janela craniana no preparo de afinamento do crânio, o local da lesão pode ser acessado repetidamente para administração de fármacos e corantes.Manter a esterilidade de todas as operações ajuda a manter a região afinada transparente, prevenindo inflamação. Aqui você pode ver o local da lesão capturado após o afinamento do crânio. Na imagem do lado esquerdo, é possível observar o lado da lesão cercado por dendritos marcados com YFP de neurônios corticais 20 minutos após o trauma.A imagem à direita representa a mesma área do cérebro no mesmo animal cinco dias após o trauma. Nesta imagem, é possível observar outro exemplo da microscopia de dois fótons do cérebro. Após o afinamento do crânio, o osso pode ser visto pelo sinal de geração de segundo harmônico mostrado em cinza.No painel esquerdo, os micróglios aparecem em verde. Nesta configuração experimental, os micróglios podem ser observados sob o osso ao redor do local da lesão, conforme mostrado no painel direito. No presente estudo, utilizamos tanto a janela craniana crônica quanto o preparo de afinamento do crânio para estudar o comportamento celular em condições pós-traumáticas dentro do cérebro vivo.Os dois métodos apresentam certas vantagens e limitações. A janela craniana crônica oferece melhor resolução, maior penetração nos tecidos cerebrais e a conveniência de múltiplas sessões de imagem. Por outro lado, o procedimento de afinamento do crânio tem menor probabilidade de induzir inflamação no local de imagem e permite aplicações repetidas de fármacos e corantes.

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