Name: Automated Análise de Ca dinâmico 2 + Sinais em seqüências de imagens (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprenda análise automatizada de sinais de cálcio em artérias coronárias de porco. Este método reduz erros do usuário e aumenta a eficiência na pesquisa cardiovascular.

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Este trabalho foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Bolsas de Saúde HL-085887, HL-092992, S10RR027535 e MOP-93676.

1. Dissection Vessel and Imaging <ol><li> Tecido Colheita de suínos juvenis domésticos, conforme descrito no Martens et al 27. Coloque ventrículos direito suínos colhidas em um polidimetilsiloxano (PDMS) prato dissecção inferior contendo tampão HEPES solução salina fisiológica (PSS). <ol><li> Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, dissecar e remover um segmento da artéria coronária descendente anterior da artéria coronária (~ 8 milímetros de comprimento, 0,5 mm de diâmetro) de tecido circundante, utilizando um fórceps e tesouras mola através da remoção do segmento de vaso a partir das camadas de tecido cardíaco circundantes. NOTA: Tome cuidado para não perfurar a parede do vaso. </li><li> Coloque um bloco PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) para o prato de dissecação, e usar uma agulha para fixá-lo para o fundo. Cortar um diâmetro de fio de tungstênio, aproximadamente, 40 mM em doze segmentos de comprimento ~ 0,3 centímetros, formando micropins, e colocá-las no prato. Usando fórceps, fixar uma extremidade do segmento do vaso para o bloco com uma micropin. </li><li> Insira com cuidado tesoura pequena mola no lúmen do vaso e cortar longitudinalmente de um lado do navio para abri-lo completamente. Oriente o segmento navio abriu com o endotélio para cima. </li><li> Use as micropins restantes para proteger as fronteiras do segmento de vaso aberto para bloquear tais que a embarcação forma um retângulo plano. NOTA: topos Micropin devem ser dobrados a 90 º e inserido até nivelada com a superfície do bloco. Cuidados devem ser tomados para esticar a preparação navio sem hostes; largura final deve ser ~ 1,5 x a largura não esticada partida. </li><li> Prepara-se uma pequena quantidade (~ 1 ml) da solução de Fluo-4 AM carregamento por mistura de Fluo-4 AM (10 fiM) dissolvido em DMSO com plurico (0,03%) em um tampão HEPES PSS (contendo em mM: NaCl 134, KCl 6 , 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), e inserir o bloco inteiro na solução de carga para, aproximadamente, 40 minutos à temperatura ambiente no escuro. </li><li> Após carga, lava-se a blocos de tampão HEPESPSS para 5-10 min. </li><li> Monte o bloco para 50-100 ^ M espaçadores de espessura em uma câmara inferior lamela contendo tampão HEPES PSS. NOTA: pinos de metal podem ser utilizados como separadores e assegurar o segmento navio está voltada para baixo e não tocar os espaçadores. </li><li> Coloque a câmara no palco de um microscópio invertido equipado para imagem confocal, e concentrar-se sobre a camada de células endoteliais. </li><li> Sequências de imagens de lapso de tempo de captura de fluorescência relativa basal para ~ 3 min com ampliação de 20x e uma taxa de quadros de ~ 8 frames por segundo utilizando imagem confocal software seqüência de aquisição. </li><li> Após cerca de 3 minutos de gravação de fluorescência basal, substituir solução tamponada HEPES PSS com o mesmo volume (~ 1 ml) da substância P (100 pM) dissolvido em tampão HEPES PSS, e uma ficha de autopropulsão 3 min. </li></ol></li></ol> 2. Análise automatizada <ol><li> Renderização seqüência (s) imagem da atividade fluorescente de cálcio a partir de software de aquisição confocal como de 8 bits, grayscale &#39;. tif&#39; arquivos de formato sem informação de escala. </li><li> Abrir ImageJ, clique em &#39;open&#39; no menu arquivo e selecione a imagem seqüência apropriada na janela do Explorer para exibir a seqüência (s) imagem em ImageJ. </li><li> Determinar um diâmetro ROI apropriado usando a ferramenta ROI rectangular para estimar os limites superiores e inferiores da distribuição espacial da actividade dentro da sequência (s) da imagem. NOTA: O diâmetro médio retangular é uma escolha adequada para diâmetro ROI. </li><li> Crie uma nova pasta no disco rígido do computador, e adicione a seqüência (s) imagem para o diretório da pasta. </li><li> No ImageJ, clique em janela &#39;plugins&#39; e clique em &#39;LC_Pro&#39; para iniciar a análise. </li><li> Digite o valor do diâmetro ROI e selecione o valor limiar de filtro (ou 0,05 ou 0,01). </li><li> Clique na caixa de seleção &quot;tratamento de drogas&quot; e insira os valores de ponto de tempo imediatamente antes e depois que a droga foi adicionado (em segundos). </li><li> Clique em &#39;ok&#39;, edigite o diretório sequência de imagens para a janela do explorador de arquivos. </li></ol> 3. Saída gráfica <ol><li> Baixe a versão 3.0.2 a partir de R <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a> . </li><li> Abra a versão de R. 32 bits </li><li> Clique em &quot;Arquivo&quot; e depois &quot;script aberto &#39;e selecione o script de R&#39; traceplot.R &#39;para gerar relatórios experimentais gráficas. </li><li> Instale a calibrar e gplots pacotes, selecionando &#39;pacotes&#39;, &#39;instalar pacotes &quot;, e selecionando os pacotes justificativo. </li><li> Clique em &#39;arquivo&#39;, depois &#39;altere o diretório&#39; comando e usar a janela do explorer para selecionar o diretório que corresponde à saída de análise LC_Pro. </li><li> Clique na janela de script e, em seguida, o &quot;executar todos&quot; comando para executar o script. </li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Decodificando complexos Ca 2 + sinais a nível celular e multicelular exigirá abordagens experimentais e analíticos rigorosos. Aqui, é descrito um método em que a sequência de tempo de imagem confocal resolvidos de Ca 2 + dependente de fluorescência são submetidas a uma análise automatizado que identifica e quantifica a Ca 2 + sinais estatisticamente relevantes dentro de campos celulares intactos no caso concreto apresentado, um segmento da artéria foi isolado de coração de porco, preso a...

Ca 2 + é um segundo mensageiro ubíquo molécula sinalizadora e citosólicas de Ca2 + níveis são altamente regulamentados. Ca 2 + intracelular sinais são complexas e incluem transientes isoladas, oscilações, e as ondas de propagação 1-4. Controle espacial e temporal da Ca 2 + é pensado para ser a base especificidade sinal fisiológico e, portanto, a análise de Ca 2 + padrões de sinal é de considerável interesse para os investigadores em vários campos 5. Corantes de Ca 2 +, como indicador de Fluo-4 e de Fura-2 são normalmente utilizados para medir intracelulares de Ca 2 + sinais com microscopia de fluorescência 5-12. Normalmente, os temporais Ca 2 + sinais são avaliados como alterações dependentes do tempo em média de fluorescência dentro de uma área definida pelo usuário, ou região de interesse (ROI) 5,6,13 - 16. Atualmente, a análise de ROI manual é tanto demorado e trabalho emintensiva, porque requer que os usuários identifiquem muitos ROIs e realizar cálculos repetitivos 17 - 19. Essas técnicas também podem ser sujeitos a considerável erro do usuário, incluindo a introdução de modos de sinal artificiais e exclusão de baixa amplitude ou sinais difusos 18,20. Algoritmos automatizados de detecção de ROI previamente implementada utilizando uma variedade de métodos estatísticos para determinar a colocação óptima de ROI, mas eles têm sido geralmente limitados à análise de varrimento de linha ou pseudo linha de imagens digitalizadas, que limita a análise a um único dimensão espacial no tempo 17, 19-22. Além disso, muitos algoritmos existentes não são suficientes para abranger a diversidade de Ca 2 + eventos de liberação, que vão desde, transientes localizadas periódicas às ondas que se propagam 23,24. Avaliação abrangente dos fisiológicos de Ca 2 + sinais muitas vezes é ainda mais complicada pela presença de Artif imagem significativaagir que confunde sinal de discriminação de ruído em muitos sistemas experimentais. Anteriormente, um algoritmo de detecção de solução automatizada ROI para Ca 2 + sinal de detecção transitória, implementado como um plugin para o software ImageJ NIH (National Institutes of Health, Bethesda, MD), foi desenvolvido e validado 25,26. Este algoritmo, chamado LC_Pro, foi projetado para identificar e analisar ROIs abrangendo Ca 2 + transientes de sinal em sequências de imagens de lapso de tempo bidimensionais. Aqui um protocolo experimental e demonstração prática representante de uma aplicação do algoritmo no endotélio das artérias coronárias de suínos é fornecido, com pós-processamento adicional, usando o open source software de processamento estatístico R para gerar a saída gráfica utilizável.

<table><tbody><tr><td>Prato de dissecação</td><td>Fisher Sci</td> <td># 08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td> <td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td><td>kit de elastômero, deve ser moldado em pratos</td></tr><tr><td>com buffer HEPES PSS</td><td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES ácido</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Nikon Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Fórceps</td><td>Fine Science Tools</td> <td># 11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Fio de tungstênio</td><td>Scientific Inst Svcs</td> <td># 406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Pinos de metal</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Câmara</td><td></td><td></td> inferior de vidro <td>de</td>cobertura</tr><tr><td>Microscópio confocal de disco giratório</td> personalizado <td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro plugin para imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">download em: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">baixe em: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr>Script <td></td><td></td><td>de plotagem de rastreamento R</td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">baixe em: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

automated análise de ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; sinais em seqüências de imagens

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Ca 2 + intracelular sinais são vulgarmente estudada com corantes de Ca 2 + indicadoras fluorescentes e as técnicas de microscopia. No entanto, a análise quantitativa de Ca 2 + dados de imagem é demorado e sujeito a viés. Algoritmos de análise de sinal automatizado baseado na região de interesse (ROI) de detecção têm sido implementadas para medições de varredura de linha unidimensional, mas não há nenhum algoritmo atual que integra a identificação otimizado e análise de ROI em sequências de imagens bidimensionais. Aqui um algoritmo para rápida aquisição e análise de ROI em sequências de imagens é descrito. Ele utiliza elipses caber aos sinais filtrados de ruído, a fim de determinar a colocação ROI ideal, e calcula Ca 2 + parâmetros do sinal de amplitude, duração e distribuição espacial. Este algoritmo foi implementado como um plug-in gratuito para software ImageJ (NIH). Juntamente com os scripts de análise escritos para o open source software de processamento estatístico R,Esta abordagem proporciona um gasoduto de alta capacidade para a realização de análise estatística rápida da produção experimental. Os autores sugerem que o uso deste protocolo de análise levará a uma caracterização mais completa e imparcial do fisiológica Ca 2 + de sinalização.

Um algoritmo de costume, LC_Pro, foi desenvolvido e implementado, a fim de realizar a análise automatizada de Ca 2 + dinâmicas em sequências de imagem confocal. Como representado na Figura 1, o algoritmo utiliza módulos de processamento sequenciais que A) detectar e locais de pista de dinâmica de Ca 2 + mudar acima estatística (p &lt;0,01) o ruído, B) definir as regiões de interesse (ROI) automaticamente em centros de sítio activo, e C) calcular intensidades médias de fluorescência...

Aqui um romance região do protocolo de análise de juros com base na classificação elipses melhor ajuste atribuídos a regiões de sinal positivo dentro de sequências de imagens de lapso de tempo bidimensional é demonstrada. Este algoritmo pode permitir que os investigadores a analisar exaustivamente sinais fisiológicos Ca + 2 com entrada mínima do usuário e preconceito.

Automated Análise de Ca dinâmico<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sinais em seqüências de imagens

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

O objetivo geral do seguinte experimento é analisar a atividade de cálcio endotelial em artérias coronárias de porco utilizando análise automatizada de ROI. Isso é realizado dissecando e abrindo artérias coronárias de porco para medir a atividade de cálcio endotelial como segundo passo. A análise automatizada de ROI é realizada nas medidas de cálcio adquiridas, resultando na saída resumida da atividade de cálcio.Em seguida, os scripts de software são executados sobre a saída para analisar estatisticamente e representar graficamente os resultados da análise da atividade de cálcio, obtendo-se resultados que mostram os parâmetros dos transientes do sinal de cálcio com base na análise automatizada de ROI e no processamento estatístico. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a análise manual de ROI, é que a análise automatizada é mais rápida, abrangente e menos suscetível a erros do usuário. Neste procedimento, coloque os ventrículos direitos de suíno colhidos em uma placa de dissecação A-P-D-M-S contendo grandes quantidades de solução salina fisiológica tamponada.Sob o microscópio estereoscópio, remova um segmento da artéria coronária descendente anterior esquerda ao dissecá-lo das camadas teciduais cardíacas circundantes. Tenha cuidado para não perfurar a parede do vaso. Em seguida, coloque o bloco de PDMS na placa de dissecação e use uma agulha para fixá-lo ao fundo.Adicione o tampão à placa. Em seguida, corte um fio de tungstênio com diâmetro aproximado de 40 mícrons em 12 segmentos de 0,3 centímetro de comprimento, formando pinos microscópicos, e coloque-os na placa. Use a pinça para fixar uma extremidade do segmento do vaso ao bloco com um pino microscópico.Insira cuidadosamente a tesoura de mola pequena na luz do vaso e corte longitudinalmente ao longo de um dos lados do vaso para abri-lo completamente. Em seguida, posicione o segmento do vaso aberto com o endotélio voltado para cima. Utilize os pinos microscópicos restantes para fixar as bordas do segmento do vaso aberto ao bloco, de modo que o vaso forme um retângulo plano.Em seguida, prepare um mililitro de solução de carregamento flu oh 4:00 AM. Coloque todo o bloco na solução de carregamento por aproximadamente 40 minutos à temperatura ambiente, no escuro. Após o carregamento, lave o bloco com PSS tamponado com heaps por cinco a 10 minutos. Posteriormente, monte o bloco sobre espaçadores com espessura de 50 a 100 mícrons em uma câmara com fundo de lamínula contendo PSS tamponado com heaps.Coloque a câmara na platina de um microscópio invertido equipado para imagem confocal e foque na camada de células endoteliais utilizando o software de aquisição de sequências de imagens confocais para capturar sequências de imagens em lapso de tempo da fluorescência relativa basal durante três minutos, com aumento de 20x e taxa de quadros de oito quadros por segundo. Após três minutos de registro da fluorescência basal, substitua a solução PSS tamponada com heaps pelo mesmo volume de substância P 100 picomolar dissolvida em PSS tamponada com heaps e registre por mais três minutos. Neste procedimento, gere a sequência de imagens da atividade fluorescente de cálcio a partir do software de aquisição confocal como um arquivo no formato TIFF em escala de cinza de oito bits, sem informações de escala.Em seguida, abra o ImageJ. Clique em Abrir no menu Arquivo e selecione a sequência de imagens apropriada na janela do explorador. Para visualizar a sequência de imagens no ImageJ, determine uma ROI apropriada utilizando a ferramenta de ROI retangular para estimar os limites superior e inferior da dispersão espacial da atividade dentro da sequência de imagens. Em seguida, crie uma nova pasta no disco rígido do computador e adicione a sequência de imagens ao diretório da pasta.No ImageJ, clique na janela de plugins. Em seguida, clique em LC Pro. Para iniciar a análise, insira o valor do diâmetro da ROI e selecione o valor do limiar do filtro após a palavra.Clique na caixa de seleção do tratamento com fármaco e insira os valores dos pontos de tempo imediatamente antes e depois da adição do fármaco. Em seguida, clique em OK e insira o diretório da sequência de imagens na janela do explorador de arquivos. Nesta etapa, faça o download da versão 3.0 0.2 do R e instale-a.Em seguida, abra a versão de 32 bits do R. Depois clique em arquivo. Em seguida, abra o script e selecione o script de gráfico de traçado RR para gerar relatórios experimentais gráficos. Instale os pacotes calibrate e gpls selecionando pacotes.Instale os pacotes e selecione os pacotes apropriados posteriormente. Clique em arquivo, depois no comando alterar diretório e use a janela do explorador para selecionar o diretório que corresponde à saída da análise lc pro. Em seguida, clique na janela de script e depois no comando executar tudo para rodar o script aqui.As imagens em lapso de tempo de uma sequência de imagens de entrada com um intervalo de amostragem basal seguido por um intervalo de amostragem estimulado por substância P são mostradas em sequências de imagens em escala de cinza. As melhores lises para os intervalos basal e estimulado foram renderizadas pelo lc Pro, e as curvas de intensidade escalonadas dependentes do tempo, provenientes de cada ROI posicionada automaticamente, são exibidas aqui. Histogramas da amplitude de pico, duração na metade máxima e dispersão espacial máxima, para eventos de controle e estimulados pela substância P, provenientes de um experimento representativo, foram gerados. Utilizando R para processamento gráfico da saída do lc Pro.Notavelmente, a estimulação por substância P aumentou o número de eventos e causou um deslocamento significativo para a direita na mediana da amplitude e da duração, conforme indicado por um teste Mann-Whitney U. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de minimizar artefatos na imagem devido ao movimento do plano focal ou configurações incorretas de contraste, pois isso pode afetar grandemente o resultado da análise.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Focal Ca 2 + Detecção de transitórios no músculo liso

Em miócitos cardíacos, estruturas de membrana tubular formar redes intracelulares. Descrevemos os protocolos para i) isolamento de miócitos de coração do rato, incluindo controle de qualidade, ii) coloração de células vivas para a microscopia de fluorescência state-of-the-art otimizado, e iii) a análise de imagens direto para quantificar a complexidade do componente ea plasticidade de membrana intracelular redes.

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Aqui apresentamos técnicas para imagens de eventos locais de Ca2+ mediados por IP3 usando microscopia de fluorescência em células intactas de mamíferos carregadas com indicadores de Ca2+, juntamente com um algoritmo que automatiza a identificação e análise desses eventos.

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Apresentamos um protocolo para a detecção óptica em tempo real de proteínas sem rótulo única, como eles são secretados de células vivas. Isto é baseado em microscopia de dispersão interferométricas (iSCAT), que pode ser aplicada a uma variedade de diferentes sistemas biológicos e configurações.

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