Name: De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a preparar e implantar complexo fármaco-resina Elvax 40W para liberação lenta na retina de ratos. Este método custo-efetivo permite tratamento direto de condições oculares crônicas com avaliação por eletroretinografia.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo Australian Research Council por meio do ARC Centre of Excellence in Vision Science (CE0561903), do National Health and Medical Research Council (1049990) e do Progetto regionale speciale multiasse 'Reti per l'Alta Formazione' - PO FSE Abruzzo 2007-2013 - Azione 4.II.iii.

Todos os experimentos realizados foram de acordo com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftálmica e Vision Research, e com a aprovação do Comitê de Ética da Universidade de L&#39;Aquila animal e ao Comité do Australian National University Ética em Experimentação Animal. Ratos adultos (P100-200) foram utilizados ao longo deste estudo. 1. Prepare os grânulos de resina de copolímero <ol><li> Colocar 20 pastilhas Elvax 40W em um pequeno copo de vidro na câmara de exaustão. </li><li> Encher o balão com 100% de etanol garantindo-se a cobrir todas as pelotas. </li><li> Cobrir a proveta com Parafilm e embeber os granulados em etanol a 100% à temperatura ambiente, durante 7-10 dias. NOTA: A partir desta etapa em diante, não use metal ou plástico para manipular ou armazenar a resina. </li></ol> 2 Preparar a solução de Drogas para carregar <ol><li> Dissolve-se o fármaco de escolha em 0,1% de dimetil-sulfóxido (DMSO). Adicione a solução de fármaco até 40 mL de volume.Carregar a resina com três vezes a concentração do medicamento que seria dado numa dose única. </li></ol> 3. Preparar e carregar o complexo de droga-resina <ol><li> Transferir os 20 pelotas lavadas com outra pequena proveta de vidro. Dissolve-se as pelotas em 4 ml de diclorometano durante aproximadamente 45 min. Cobrir o copo com Parafilm enquanto as pelotas estão se dissolvendo. </li><li> Prepara-se uma solução de Fast Green FCF, dissolvendo-o em 0,1% de DMSO a uma concentração de 0,001 mg / ml. </li><li> Tome uma pipeta, e elaborar 40 mL da solução da droga preparada anteriormente. Coloque outra pipeta, com 40 ml de solução de Fast Green. </li><li> Adicionar as duas soluções em simultâneo para o copo. Mistura-se rapidamente com uma vareta de vidro, até que o corante verde é uniformemente distribuída por toda a mistura. </li><li> Imediatamente transferir a taça sobre gelo seco durante 10 min a congelação rápida da resina. </li><li> Configurar uma &quot;câmara de evaporação&quot; para evaporar o solvente. Encha umamaior recipiente até um terço de pedrinhas de sulfato de cálcio. Criar um poço nas pedras, e coloque cuidadosamente o copo no poço para que as pedrinhas chegar até a metade do copo, para estabilizar o copo na câmara. </li><li> Cubra o recipiente fora maior com Parafilm. </li><li> Transferir a câmara de evaporação para o congelador. Manter a -20 ° C durante 2-3 semanas. </li></ol> 4 Prepare o complexo de droga-resina para implantação cirúrgica <ol><li> Retire a câmara de evaporação do congelador. Transferir o bloco de droga-resina sólido para um prato de vidro mantidos em gelo. </li><li> Com a ajuda de um microscópio ou lupa, cortar um pedaço de aproximadamente 0,05 mm de diâmetro e 0,1 mm de comprimento do bloco, utilizando uma ferramenta ou punção trefina. </li><li> Envolver o remanescente do bloco de material à prova de congelação (por exemplo, uma folha de alumínio) e manter a -20 ° C até ser necessário. </li></ol> 5. Cirurgicamente Implant o complexo de droga-resina para a Rat Eye </p&gt; <ol><li> Prepare o animal por cirurgia. Anestesiar utilizando uma injecção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (100 mg / kg de peso corporal) e xilazina (12 mg / kg de peso corporal). Observar o animal até anestesia completa seja alcançada. NOTA: O animal deve ter uma perda de movimentos (exceto a respiração), e uma perda de reflexos pitada da córnea e do dedo do pé. </li><li> Transferir o animal completamente anestesiados para a mesa de cirurgia. Use mydriaticum (por exemplo, sulfato de atropina) e anestesia local (por exemplo, cloridrato de tetracaína) cai no olho (s) submetidos a cirurgia. Aplicar lágrimas artificiais para manter a córnea úmida durante a cirurgia. Utilize agulhas descartáveis ​​e instrumentos esterilizados durante toda a cirurgia. </li><li> Estabilize o olho usando um par de pinças curvas cegas após o aluno está totalmente dilatado. Usar um microscópio de operação para fazer uma perfuração profundidade máxima para alcançar o vítreo, cerca de 2 mm do limbo usando uma agulha de 25 G. </li><li> Insira o pedaço preparado de tele complexo de droga-resina para dentro da ferida punção usando um par de fórceps finos, pontiagudas (por exemplo, uma pinça), que são capazes de penetrar no local da punção. </li><li> Como profilaxia da infecção bacteriana, aplicar uma pomada antibiótica ao olho, para prevenir a inflamação, bem como prevenir a secura da córnea, enquanto o animal está a recuperar. </li><li> Observar o animal até a recuperação completa. Não deixe o animal sozinho até que ele recuperou a consciência. Não devolver o animal para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Se o animal apresenta sinais de stress ou desconforto, analgésicos devem ser utilizados de acordo com o protocolo de ética aprovado. </li><li> Siga os procedimentos experimentais habituais para coleta e análise do tecido. </li><li> Após a conclusão de experiências, sacrificar o animal com uma injecção intraperitoneal de uma pentobarbital (60 mg / kg de peso corporal) de solução de cloridrato de lidocaína a 2%. </li></ol> NOTA: A lidocaína cloridrato minimizes desconforto local.

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Os autores não têm nada a divulgação.

Este trabalho demonstrou a utilização de um complexo de droga-resina para a entrega de libertação lenta de drogas para a retina. Nosso objetivo foi apresentar um método que é relativamente barato e fácil de aplicar em um modelo animal pequeno. Tendo em conta que a função do APB é actuar como um análogo do glutamato, que vai bloquear a resposta da retina no olho. Os resultados mostram que o bloqueio provocado APB da resposta da retina de uma semana após a implantação. Isto indica que foi APB ...

O tratamento de doenças crônicas, como diabetes e pressão arterial elevada apresenta muitos desafios, como essas doenças geralmente necessitam de tratamento por longos períodos de tempo, muitas vezes por toda a vida. Este apelou para o desenvolvimento de sistemas de liberação de liberação lenta, o que reduz a necessidade de doses freqüentes. A eficácia destes métodos de libertação lenta tem sido demonstrada através de desenvolvimento de bombas de insulina, para reduzir o número de injecções de insulina necessários para o tratamento da diabetes. As doenças crônicas do olho, particularmente aquelas que afetam suas camadas internas, requerem a administração freqüente de drogas através de procedimentos invasivos. Uma doença crônica, que afeta o olho humano é a idade degeneração macular relacionada à (AMD). Ela afecta a retina central, que é uma camada de tecido neural situado na parte de trás do olho responsável por iniciar a visão. AMD é a principal causa de cegueira no mundo ocidental 1. Um desafio particular com o tratamento de redoenças tinal é que a droga é necessária para atingir esta camada profunda no olho, o que muitas vezes requer a entrega de métodos invasivos. As drogas são geralmente administradas a câmara vítrea e retina utilizando injecções intravítreas. No entanto, com cada injecção há o risco de complicações após a injecção, incluindo endoftalmite, descolamento da retina, catarata e hemorragia vítrea 2. Este risco é multiplicado com cada reinjecção do fármaco. Reduzindo a necessidade de múltiplas injeções seria um grande benefício no tratamento da AMD. Para tratar a forma úmida de DMRI, onde crescimento de novos vasos é uma característica marcante, a estratégia terapêutica estabelecida é atingir os factores de crescimento endotelial (VEGF) que usam inibidores de VEGF 3. No momento, estes são entregues através de injeções intravítreas repetidas. De igual modo, no tratamento de edema macular, uma complicação comum da retinopatia diabética, os corticosteróides são fornecidos através de injecções repetidas <saté&gt; 4. A entrega de drogas através destes métodos de libertação lenta pode, de facto reduzir o risco de complicações após a injecção. A noção de um sistema de entrega de droga de libertação lenta foi descrita pela primeira vez utilizando um veículo de borracha de silicone para proporcionar moléculas pequenas em tecidos animais 5. Desde então, outros métodos de libertação lenta foram desenvolvidos para entregar moléculas grandes, algumas das quais foram testadas no olho. Transportadoras de partículas, tais como microesferas biodegradáveis, poli-láctido-co-glicólido (PLGA) nanopartículas e vesículas de fosfolípidos (lipossomas) podem ser úteis como veículos de distribuição de 6,7. Nanopartículas e lipossomas PLGA foram comparados num ambiente in vitro quanto à sua capacidade para entregar agentes anti-cancerígenos através da esclera 7 ao longo do tempo. Ambos os veículos foram eficazes na lentamente liberando as drogas. No entanto, o estudo foi realizado apenas num ambiente in vitro. Bochot et al. (2002) 8 testadosa eficácia de lipossomas para entregar moléculas para a retina in vivo. Eles demonstraram que os lipossomas entregam com sucesso oligonucleótidos pequenos para a retina do coelho. Os autores sugeriram que os lipossomas podem ser benéficos no tratamento de doenças da retina 8. No entanto, a natureza destas vesículas para flutuar no vítreo significa que eles provavelmente borrar ou prejudicar a visão 9. Okabe et ai. (2003) 10 não utilizados discos de polímero biodegradável constituída por 33% de etileno-acetato de vinilo para aplicar beta-dexametasona em coelhos. Eles discos implantados no bolso escleral e demonstraram a libertação eficaz da droga no vítreo e retina de até um mês 10. No entanto, este protocolo em particular, o implante foi relativamente grande e rígida, e é necessária uma cirurgia mais complexa, incluindo uma grande incisão escleral e sutura. Um estudo anterior investigou a tissue resposta a vários veículos de polímero por implantá-las para a córnea do olho de coelho, e verificou que os copolímeros de etileno-acetato de vinila, lavados em álcool não causou inflamação ou irritação. Estes complexos foram mostrados para sustentar a entrega de compostos de maior dimensão em tecidos animais, por períodos de tempo alargados, excedendo alguns até 100 dias dependentes da droga 11. Um tal tipo de resina de copolímero foi desenvolvido industrialmente, sob a forma de Elvax 40W (40% em peso de etileno-vinil-acetato com conteúdo de comonómero de «W» amida aditivo para melhorar o tratamento da pelota). Esta resina de copolímero é uma substância inerte, que é estável a ambos os quarto e a temperatura do corpo. Não tem sido demonstrado causar alergias ou toxicidade no tecido biológico. Esta resina tem efectivamente fornecida uma grande variedade de drogas, em diferentes modelos experimentais que investigam as funções de vários sistemas, tais como o sistema ductal de mama 12, o córtex auditivo primário 13,14 &lt;/ Sup&gt;, eo sistema visual 15 sapo. Esta resina tem também sido utilizada no olho para entregar drogas para o desenvolvimento de tartaruga 16,17, 18,19 embrião de galinha, e de adultos furão retinas 20. No sistema nervoso central de rato, a resina foi usada apenas no cérebro de 21-23, mas o seu uso no olho do rato não foi documentada. As vantagens da utilização desta resina de copolímero para entregar drogas lentamente a retina através de outros métodos, é que é um composto estável que não cause inflamação ou irritação no olho. Ao contrário das partículas transportadoras, o complexo de droga-resina não iria prejudicar a visão, após o implante, uma vez que normalmente permanece no local da entrega, em vez de flutuar no vítreo. Só seria necessário um processo simples implantação na cavidade vítrea próxima ao limbo do olho, e que não requerem a sutura após o implante. Recentemente, tem havido uma emergência em vários novos sistemas de distribuição, tais comotecnologia de célula encapsulada (ECT) 24,25, hidrogéis 26 e 27 de microfilmes. No entanto, o método utilizado no presente estudo para a preparação e fornecimento do complexo droga-resina é fácil de seguir e de baixo custo, sendo assim mais vantajosa para utilização num ambiente de investigação básica. O desafio de utilizar este complexo para entregar drogas tratamentos de longo prazo é determinar a melhor concentração da droga que irá maximizar os benefícios terapêuticos da redução do número de injeções intravítreas. Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso do complexo droga-resina para tratamento a longo prazo da retina de ratos adultos. A eficácia deste modo de entrega é testado usando o análogo do glutamato 2-amino-4-fosfonobutirato (APB) como a droga. Blocos APB a resposta à luz das células bipolares ON imitando glutamato, um neurotransmissor endógeno na retina 28. Quando APB concorre com o glutamato para o seu receptor, ele bloqueia o lighresposta t. APB foi usado em estudos fisiológicos para controlar a função da retina e medir o seu efeito através de métodos electrofisiológicos como electroretinografia (ERG). Em estudos anteriores, APB foi usado para tanto a curto prazo 29 e o tratamento de longo prazo da retina em desenvolvimento; este último envolvido que dá uma dose única, por injecção intra-ocular ao dia durante 30 dias 30. A mesma quantidade de APB (0,092 mg em solução salina estéril, a uma concentração de 50 ^ M) foi usada para todas as injecções, tal como sugerido em 28,29,31 trabalho anterior. Escolhemos APB para testar o complexo droga-resina, como um veículo de libertação lenta para entregar drogas no olho. Os métodos descritos neste estudo são similares aos métodos descritos anteriormente, envolvendo a preparação da droga-resina complexo 16,32; no entanto, também detalhar o seu uso principalmente no olho de um rato adulto. Após a implantação cirúrgica da resina APB-carregado para dentro do olho, ERG foi realizado para determinar se APB abole a rresposta à luz etinal e, portanto, se APB foi lançado com sucesso no vítreo e retina.

<table><tbody><tr><td>Elvax 40W Pellets</td><td>Du Pont, DE, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EUA Ácido</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-amino-4-fosfonobutírico (APB)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EUA</td><td>A1910</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EUA</td><td>34856</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drierita, sulfato de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, EUA</td><td>238910</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina, Ilium Ketamil</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina, Ilium Xylazil-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de atropina, colírio Minims</td><td>Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de tetracaína, colírio mínimo</td><td>Bausch & amp Lomb Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol, pomada Chlorsig</td><td>Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital, Lethabarb</td><td>Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de lidocaína, Ilium Lignocaína-20</td><td>Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Austrália</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de punção Uni-Core</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça curva</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio cirúrgico, Zeiss OPMI 99</td><td>Zeiss, Alemanha</td><td></td><td></td>Ocidental</tr><tr><td>25 G Agulha de insulina</td><td>Terumo Corp., Tóquio, Japão</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça Dumont</td><td>World Precision Instruments Inc., FL, EUA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

de liberação lenta drug delivery através elvax 40w para o rat retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Doenças da retina, são difíceis de tratar como na retina encontra-se profundamente no interior do olho. Métodos invasivos de entrega de drogas são muitas vezes necessários para tratar essas doenças. Doenças da retina crônicas, tais como edema retinal ou neovascularização normalmente requerem múltiplas injecções intra-oculares para tratar eficazmente a doença. No entanto, os riscos associados a estas injecções aumentar com a repetição de uma entrega da droga. Portanto, métodos alternativos de entrega precisam ser estabelecidos, a fim de minimizar os riscos de reinjeção. Várias outras investigações têm desenvolvido métodos para administrar medicamentos ao longo do tempo prolongado, através de materiais capazes de libertar lentamente produtos químicos para dentro do olho. Na presente investigação, que descrevem a utilização de Elvax 40W, uma resina de copolímero, para actuar como um veículo para a entrega da droga à retina de um rato adulto. A resina é feita e carregados com o fármaco. O complexo de droga-resina é então implantado na cavidade vítrea, que irá libertar o fármaco lentamente durante time. Este método foi testada utilizando 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), um análogo de glutamato que bloqueia a resposta à luz da retina. Demonstrou-se que o APB foi libertada lentamente a partir da resina, e foi capaz de bloquear a resposta da retina por 7 dias após a implantação. Isto indica que a entrega de droga de libertação lenta utilizando esta resina de copolímero é eficaz para o tratamento da retina, e pode ser utilizada de forma terapêutica com outros ensaios.

Electroretinografia de campo total (ERG) foi utilizado para detectar o efeito de APB na retina. Para detalhes sobre como o ERG foi realizada, consulte os seguintes estudos 33,34. Em resumo, depois de anestesiar o animal, um eléctrodo de ouro foi colocado sobre a córnea do olho, e o eléctrodo de referência foi colocado no couro cabeludo anterior, entre os olhos, para registar a actividade eléctrica da retina. Os estímulos foram geradas usando uma unidade de flash electrónico e a intensidade variou de 10-1...

Este artigo fornece detalhes sobre como Elvax 40W pode ser utilizado como um método de libertação lenta para entrega da droga à retina de um rato adulto. O protocolo para a preparação, o carregamento e entrega o complexo droga-resina, para o olho é descrito.

De liberação lenta Drug Delivery através Elvax 40W para o Rat Retina: implicações para o tratamento de condições crônicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

O objetivo geral do experimento a seguir é demonstrar um método relativamente simples e economicamente viável para fornecer um sistema de liberação sustentada de fármacos no tratamento de condições crônicas do olho. Isso é alcançado primeiramente preparando os pelotas de resina copolimérica, criando um veículo para o fármaco de escolha. Como segundo passo, a solução do fármaco e D são combinadas para criar o complexo de resina com o fármaco.Em seguida, o complexo fármaco-resina é inserido no olho para garantir a administração direta do fármaco à retina. São obtidos resultados que demonstram a entrega bem-sucedida do fármaco com base na eletroretinoscopia. Assim, a implicação dessa técnica estende-se ao tratamento de condições crônicas da retina, pois pode oferecer liberação lenta e direta do fármaco ao tecido-alvo.Portanto, a principal vantagem dessa técnica em comparação com outros métodos existentes, como nanopartículas, hidrogéis e microfilmes, é que ela é relativamente fácil de seguir e de baixo custo, sendo assim viável em um ambiente de laboratório de ciências. O primeiro passo é preparar os pelotas de resina do copolímero. Para isso, coloque 20 pelotas de LVA X 40 W em um bé

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