Name: qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a detectar DNA de citomegalovírus em biópsias gastrointestinais usando qPCR em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade diagnóstica.

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Reconhecemos Amy Thomasson por sua assistência com a preparação deste manuscrito, e Fredrik Skarstedt e Ryan Christy por seus esforços na preparação das figuras.

Com a aprovação do Conselho de Revisão Institucional, foi realizada uma pesquisa no banco de dados do laboratório de eletrônica para identificar fixadas em formalina e incluído em parafina (FFPE) blocos que representam casos de infecção pelo citomegalovírus (CMV) em gastrintestinal (GI) biópsias diagnosticados por histopatologia (hematoxilina e eosina (H &amp; E) e / ou imuno-histoquímica (IHQ)). 1. Processamento de tecidos de biopsia de tecido FFPE GI <ol><li> Colete FFPE GI blocos de tecido para biópsia citomegalovírus (CMV) polimerase quantitativa reação em cadeia (qPCR). Estes blocos são armazenados à temperatura ambiente. </li><li> Tubos pré-label 1,7 ml de microcentrífuga com número de identificação único do bloco. </li><li> Trave o volante micrótomo. </li><li> Assente o bloco de tecido para o prendedor de cassete. </li><li> Usando uma lâmina utilizada fresca, alinhar o bloco para o ângulo de faca no micrótomo. </li><li> Ajuste o micrótomo para cortar 10 mm de espessura. </li><li> Desbloquear ªe volante e avanço do bloco na direção da lâmina. </li><li> Corte 5 seções do bloco em 10 mM intervalos de espessura, permitindo que cada corte para rolar em um rolo de tecido. Certifique-se de que cada um pergaminho contém uma representação adequada dos tecidos de biópsia desejados. </li><li> Trave o volante micrótomo. </li><li> Com uma pinça, coloque todos os 5 pergaminhos de tecido para dentro do tubo de centrífuga de pré-rotulados, tendo o cuidado de apenas manipular a rolagem pela parafina, a fim de reduzir o potencial de contaminação cruzada. Encaixe a tampa no tubo e colocá-lo de volta na prateleira. </li><li> Retire o bloco de tecido a partir do micrótomo. </li><li> Retire e deite fora a lâmina. </li><li> Descontaminar todas as superfícies ou instrumentos que possam ter entrado em contato com o tecido anterior. </li><li> Coloque uma lâmina não utilizado fresco no suporte da faca. </li><li> Repita os passos 1,4-1,14 para cada bloco adicional para ser processado. Os tubos de microcentrífuga contendo os rolos de tecido podem ser armazenadas à temperatura ambiente até que o time da extração de DNA. </li></ol> 2. Extração de DNA a partir de Scrolls de FFPE GI biópsia de tecido NOTA: Este protocolo é uma adaptação da bula do tecido kit FFPE DNA extração (ATENÇÃO: consulte a Ficha de Segurança (MSDS)). <ol><li> Adicione 1 ml de xileno (ATENÇÃO: Consulte o MSDS) para cada tubo de microcentrífuga amostra. Fechar a tampa e vortex vigorosamente durante 10 sec. </li><li> Prossiga com a extração de DNA como descrito especificamente na inserção do produto do fabricante com as seguintes modificações. </li><li> Primeiro adicione 6 mL do controle interno (CI) para cada tubo de microcentrífuga. <ol><li> Seguindo o ATL / proteinase K incubação de lise a 56 ° C durante 1 hora, incubar a 99 ° C durante 30 minutos, em vez de 90 ° C durante 1 hora. </li><li> Durante o passo final de eluição de ADN, aberto com cuidado a tampa da coluna de purificação de ADN e aplicar 50 ul de ADNase / água livre de ARNase destilada no centro da membrana, em vez de da-manhãr ATE. NOTA: Consulte a bula para o armazenamento e preparação de reagentes adequados. ADN deve ser extraído a partir de todos os cinco rolos de FFPE. Executar todos os passos de centrifugação à temperatura ambiente (15-25 ° C). </li></ol></li></ol> 3. QPCR para CMV <ol><li> Polymerase Chain Reaction (PCR) Procedimento <ol><li> Gerar uma planilha do Excel PCR para o CMV ensaio prazo. Esta planilha Excel calcula a quantidade total de cada reagente necessário para tornar-se o mix principal com Mg. Multiplica-se a quantidade de cada reagente necessária por amostra (listados abaixo) vezes o número de amostras e controlos mais um (para compensar as perdas devido a pipetagem). <ol><li> Incluir os seguintes reagentes em cada reação de PCR, no montante indicado: Reagente0; Quantidade por Amostra Master mix CMV LC frasco de 12,5 mL Mg solução amarelo frasco de 2,5 mL O volume total de 15,0 uL </li></ol></li><li> Incluir em cada ensaio, execute uma água ou nenhum controle de destino (NTC), controle negativo, controle positivo baixo, um controle positivo alto, e quer QS3 ou QS4, e todas as amostras dos pacientes. Os capilares devem ser criados por esta ordem. </li><li> Obter o bloco específico de arrefecimento para o equipamento de PCR em tempo real que está guardado a 4 ° C. Colocar os tubos capilares apropriadas do bloco de arrefecimento. Não toque na superfície dos tubos capilares. Sempre use luvas ao manusear os capilares. </li><li> Configure todas as reações em cadeia da polimerase em uma capa limpa não contaminada com amplificação produçãots. <ol><li> Remover o número correto de frascos mestre do kit de PCR para testar todas as amostras dos pacientes, mais 5 controles. Deixe os frascos mestre, solução Mg e PCR degelo água grau no bloco de resfriamento. Cada frasco mestre contém reagentes suficientes para 12 ensaios. </li><li> Suavemente vortex os frascos de mestrado e rápida spin-los na centrífuga à velocidade máxima. </li><li> Combinar o conteúdo de cada recipiente principal para um frasco, e suavemente vortex novamente. </li><li> Combine a mistura principal e solução de Mg nas quantidades indicadas na planilha de PCR em um único tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Misturar suavemente e alíquota de 15 ul de mistura principal com Mg em cada tubo capilar, com excepção do capilar na posição 5, que é o padrão para a quantificação (QS). </li></ol></li><li> Mova o bloco de arrefecimento, contendo os tubos capilares e master mix com Mg da capa limpa para um capuz processamento. </li><li> Adicione 2 mL de controlo interno (CI) para os restantes 30 mL de mestremisturar com Mg. Misture delicadamente e alíquota de 15 mL para o capilar na posição 5 (posição para o QS). </li><li> Pipetar 10 ml de água, controle de ADN, ou o ADN da amostra no tubo capilar apropriado. Tapar os tubos capilares usando a ferramenta de nivelamento. </li><li> Tome arrefecimento do bloco / amostras para o tempo real instrumento de PCR. </li></ol></li><li> Programar o tempo real do instrumento de PCR (ver Tabela 1) </li><li> Amplificação e Detecção executada em tempo real o instrumento de PCR <ol><li> Efetue logon no computador </li><li> Dê um duplo clique sobre o ícone do instrumento e fazer login no software. </li><li> Ligue o tempo real instrumento de PCR </li><li> Clique em &quot;CMV / EBV&quot; a partir da tela da frente. </li><li> Siga as instruções do assistente de macro. </li><li> Marque a caixa para executar um auto-teste, quando solicitado pelo software. Um auto-teste deve ser realizado uma vez a cada dia o instrumento estiver em uso. </li><li> Nomeie o prazo. </li><li> Ajuste a contagem de amostra localizada na ABL superiort canto da página para a soma de controles e pacientes incluídos no Executar e digite o número de cada amostra de identificação. </li><li> Clique na aba &quot;Abs Quant&quot;. </li><li> Em &quot;Tipo de amostra&quot;, atribuir o tipo de amostra adequado para o padrão. </li><li> Digite as concentrações esperadas para o padrão de quantificação (QS). </li><li> Retire os tubos capilares a partir do bloco de arrefecimento e colocá-los na posição correspondente no carrossel (arrefecimento do bloco de amostra # 1 deve ser colocado na posição # 1 no carrossel, etc.) </li><li> Coloque o carrossel em centrífuga e começar a pressionar o instrumento. </li><li> Abra centrífuga e remover o carrossel. </li><li> Coloque o carrossel para o instrumento em tempo real, PCR. Feche a tampa. </li><li> Pressione o botão &quot;Start Run&quot;. </li><li> A real-time PCR instrumento irá verificar cada posição para uma amostra. Não se afaste do instrumento até que essa verificação tenha sido concluída, especialmente se um dos capilares não é no carrossel. O instrumento vai notar isso e perguntar se a corrida é para ser continuada. Responda sim antes de sair. </li><li> Uma vez que a corrida é completa, feche o relatório que foi gerado. </li><li> Clique em &quot;Absolute quantificação&quot;. </li><li> Clique na seta ao lado de Cor de Compensação. </li><li> Clique em &quot;Selecionar cor de Compensação&quot; a partir da caixa drop-down. </li><li> Escolha o arquivo de compensação de cor mais atual para aplicar a fuga. </li><li> Clique em OK quando a caixa aparece. </li><li> Clique na seta por curva padrão. </li><li> Selecione &quot;uso externo&quot; a partir do menu drop-down. </li><li> Selecione o arquivo de curva padrão externo mais atual e clique em OK. </li><li> Olhe para cada curva no menu Absolute Quantificação para garantir que as curvas estão presentes e não linha reta, se uma concentração é atribuída. A quantificação absoluta para o 705/Back 530 é analisado automaticamente. </li></ol></li><li> Qucontrole ality <ol><li> Gerar uma nova curva padrão sempre que um número novo lote de reagentes é recebido, ou a cada seis meses, o que é mais freqüente. </li><li> Adicionar 10 ml de cada uma das normas para a mistura principal com Mg. Considere as normas incluídas no kit de DNA previamente extraído. </li><li> Adicionar 1 ml de controlo interno para cada padrão para a mistura principal com Mg utilizados em gerar a curva padrão, a fim de assegurar uma quantificação precisa. Não adicione IC para a mistura principal com Mg para o modelo de controle n º (NTC). </li><li> Prepare um NTC e três repetições de quantificação Normas QS 4, 3, 2, 1, e uma diluição de 1:10 de QS4 para a corrida para gerar a curva padrão, totalizando em 16 pontos de dados. </li><li> Selecione &quot;idêntico&quot; no menu drop-down para os padrões repetidos </li><li> Escolha canal 530/back nenhum e ligar compensação de cor quando se analisa o prazo, </li><li> Em &quot;Curva padrão (In Run)&quot;, selecione &quot;salvar como exexterno &quot;eo nome da curva. Digite o comentário &quot;aplicado como curva padrão&quot; ao salvar. </li><li> Gráfico dos resultados. O coeficiente de linearidade resultante deve ser ≥ 0,81. </li><li> Para corridas diárias, incluir uma cópia do QS3 ou QS4 como um controle na corrida. A curva padrão externa atual podem ser importados para a corrida durante a fase de análise. </li><li> Executar controles: sem controle de DNA, controle negativo, os baixos e os controles positivos altos. Carga viral esperada é determinada e ajustada para cada fornecedor e número de lote. </li><li> Adicionar um IC para cada amostra e controle durante a extração de DNA. </li><li> Se qualquer um dos controles cair fora da faixa, registrar os resultados inaceitáveis ​​e remeter o ensaio para a solução de problemas. </li></ol></li><li> Frequência dos controlos <ol><li> Inclua em cada corrida: a NTC, baixo, alto positivo e padrão de controle positivo negativo. </li></ol></li></ol> Nota: os limites aceitáveis ​​para controles. Sem picos deve ser observard para a nenhum modelo (NTC) e controles negativos. Picos deve estar presente no canal 530 e cargas virais esperados são determinadas e ajustadas para cada vendedor e número de lote para os controlos positivos de baixa e alta.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
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<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Muitos métodos laboratoriais estão disponíveis para o diagnóstico da infecção pelo citomegalovírus (CMV), incluindo sorologia, cultura viral, ensaios moleculares de viremia, histologia do material da biópsia e, como demonstrado recentemente, ensaios moleculares de, a biópsia fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE) 5,6 tecido. Sorologia, uma vez que um dos pilares do diagnóstico, identifica apenas confiável exposição e não se correlaciona bem com a infecção por CMV aguda 7. A cultura viral,...

Interpretação da infecção por citomegalovírus (CMV) em amostras clínicas é criticamente importante. O CMV é um membro da subfamília Betaherpesvirinae de herpesvírus. Semelhante a outros vírus de herpes, CMV tem a capacidade de estabelecer infecção persistente ou latente caracterizada por uma falta de replicação viral activa 1. A reativação do vírus pode ocorrer durante momentos de estresse ou outra imunossupressão, levando a replicação viral activa caracterizada pela liberação virion, que pode ser acompanhada de manifestações da doença 2-4. Gastrointestinal (GI) os sintomas da doença CMV freqüentemente incluem dor abdominal e / ou fezes com sangue um. O diagnóstico de CMV gastroenterite por histologia utiliza hematoxilina e eosina (H &amp; E) para identificar CMV inclusões virais. Nos casos em que a suspeita clínica é alta ainda são observados sem inclusões óbvias, imuno-histoquímica (IHQ) é freqüentemente usado como um método de ensaio adjunto. No entanto, IHCtambém pode ser prejudicada pela não-clássicas surgem padrões raros de coloração celular (duvidosos), tornando difícil interpretação (Figura 2) 5. Buscou-se utilizar DNA extraído de fixados em formalina e incluído em parafina (FFPE) tecidos de biópsia GI e reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para detectar CMV em biópsias IG. Esta técnica tem mostrado ser útil na detecção de CMV em biópsias GI, e é particularmente útil em casos duvidosos IHC coloração 5,6. Além disso, qPCR também tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os dados de teste de CMV clínica adicional, quando ele está disponível 6. Uso de qPCR na detecção de CMV pode levar a um diagnóstico precoce e tratamento nos casos em que a suspeita clínica para CMV é alta, mas H &amp; E e CMV IHC são negativos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microfuga de 1,7 ml</td> Pinça serrilhada <td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Serviços</td> de <td>microscopia eletrônica</td><td>62086-1S</td><td>Micro fórceps MF-1</td></tr><tr><td>Centrífugas de mesa (microfuga)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 galão</td></tr><tr><td>de etanol</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Kit de Tecido</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>CMV LC PCR Kit de Suplemento</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Roche</td><td></td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler Bloco de Resfriamento</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>LightCycler Ferramenta de Cobertura</td><td>Roche</td><td>3357317</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Compensação de Cor</td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Capilares</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge perfil baixo</td></tr></tbody></table>

qpcr é um método sensível e rápido para detecção de dna por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

É crucial para identificar a infecção por citomegalovírus (CMV) no trato gastrointestinal (TGI) de pacientes imunossuprimidos, dada a sua maior risco de desenvolver infecção grave. Muitos métodos laboratoriais para a detecção de infecção por CMV têm sido desenvolvidos, incluindo sorologia, a cultura viral, e métodos moleculares. Muitas vezes, esses métodos refletem o acometimento sistêmico com CMV e não identificam especificamente o envolvimento do tecido local. Portanto, a detecção de infecção por CMV no tracto GI é frequentemente feito por histologia tradicional de tecidos de biopsia. Hematoxilina e eosina (H &amp; E) em conjunto com a coloração imuno-histoquímica (IHQ) mantiveram-se os principais pilares de examinar essas biópsias. H &amp; E e IHC, por vezes, resultar em atípicos (ambíguos) padrões de coloração, tornando difícil interpretação. Foi mostrado que a polimerase de reacção em cadeia quantitativa (qPCR) por CMV pode ser realizada com sucesso em, tecidos de biopsia (FFPE) em parafina e fixado em formalina para muitoalta sensibilidade e especificidade. O objetivo deste protocolo é para demonstrar como realizar testes de qPCR para a detecção de CMV no tecido biópsia FFPE em um ambiente de laboratório clínico. Este método é susceptível de ser de grande benefício para o paciente, em caso de coloração equívoca para CMV em biópsias GI.

Um total de 228 blocos de tecido foram testadas por reação de polimerase em cadeia quantitativa (qPCR), que foi composta por 91 citomegalovírus (CMV) casos positivos com base na histologia e imuno-histoquímica positiva (IHC), 18 com equívoco CMV IHC, e 79 controles negativos. Tal como ilustrado na Figura 2, os casos positivos que demonstraram CMV CMV inclusões típicas virais (A) e / ou coloração IHC positivo (B). Casos duvidosos teria demonstrado, não-clássicas surgem p...

Este protocolo descreve a detecção de qPCR de citomegalovírus em tecido de biópsia fixado em formalina e embebido em parafina, que é rápido, sensível, específico e útil para interpretar padrões de coloração ambíguos de hematoxilina e eosina ou imuno-histoquímica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é aumentar a sensibilidade na detecção de DNA viral do citomegalovírus em biópsias gastrointestinais, particularmente em biópsias que apresentam resultado equívoco com métodos convencionais de coloração. Isso é alcançado primeiramente cortando e coletando rolos de tecido de biópsia gastrointestinal embebido em parafina e fixado em formalina. Em seguida, o DNA é extraído dos rolos de tecido para amplificação.Os primers específicos utilizados amplificam seletivamente qualquer DNA viral do citomegalovírus. Quando métodos convencionais aplicados em tecido de biópsia gastrointestinal apresentam resultados equívocos, este método sensível pode detectar o DNA viral do citomegalovírus. A principal vantagem desta técnica em relação a outros métodos do campo, como hematina, andina e imuno-histoquímica, é que este método não envolve a interpretação de padrões de coloração não clássicos. No lâmina demonstrando o corte de tecido de biópsia gastrointestinal estará Zainab van Horn, uma histotecnologista do laboratório, demonstrando a extração de ácidos nucleicos, bem como a configuração da R-T-P-C-R no laboratório.Rebecca Jocelyn Para este protocolo. Tenha prontos blocos de tecido de biópsia GI em FFPE sobre gelo triturado. Primeiro, rotule um tubo microcêntrifuga para cada bloco de amostra com o número de identificação do bloco de tecido no micrótomo.Certifique-se de que a roda manual está travada e coloque o bloco de tecido na pinça da cassete. Certifique-se de estar usando uma lâmina nova para evitar contaminação cruzada entre espécimes. É crucial que você use uma lâmina não utilizada para o seu primeiro espécime.Altere para outra lâmina entre os espécimes e descontamine o micrótomo entre os espécimes. Em seguida, alinhe o bloco ao ângulo da lâmina e ajuste a espessura das secções para 10 mícrons. Agora, destrave a roda manual e avance o bloco em direção à lâmina.Corte cinco seções do bloco em intervalos de 10 mícrons, permitindo que cada seção se enrole em um rolo de tecido. Certifique-se de que cada rolo contenha uma representação adequada do tecido da biópsia desejado. Após o corte dos cinco rolos, fixe a roda manual.Ao transferir os cinco cortes para o tubo de centrífuga rotulado, certifique-se de que a pinça toque apenas a parafina e não o tecido imediatamente. Tampe o tubo, depois remova o bloco do prendedor da cassete para coletar cortes da próxima amostra. Primeiro, remova e descarte a lâmina.E antes de instalar uma lâmina nova e não utilizada, descontamine todas as superfícies que possam ter entrado em contato com a amostra anterior. Até que as amostras sejam processadas posteriormente, elas podem ser armazenadas à temperatura ambiente. O seguinte protocolo foi adaptado do kit de extração de DNA de tecido FFPE.Certifique-se de consultar a ficha de dados de segurança do material antes de prosseguir. Comece adicionando um mililitro de xileno em cada tubo de amostra e, em seguida, agite-os vigorosamente em vórtex por 10 segundos. Em seguida, siga as instruções do fabricante com as seguintes modificações.Primeiro, adicione seis microlitros do controle interno a cada tubo. Segundo, após a incubação de lise com proteinase K A TL a 56 graus Celsius por uma hora. Incube as amostras a 99 graus Celsius por 30 minutos, em vez de a 90 graus Celsius por uma hora.Terceiro, ao concluir a etapa de eluição, em vez de tampão TE, aplique cuidadosamente 50 microlitros de água destilada livre de DNA e RNA no centro da membrana da coluna de eluição. Por último, todas as etapas de centrifugação devem ser realizadas à temperatura ambiente. Monte as reações em uma câmara limpa que não tenha contaminantes de produtos de amplificação do kit.Retire frascos-mestre e solução de magnésio suficientes para as amostras mais cinco controles. Cada frasco-mestre contém reagente suficiente para 12 testes. Após o descongelamento, agite os frascos-mestre em vórtex e centrifugue-os brevemente à velocidade máxima.Em seguida, seguindo a planilha de PCR, combine a solução de magnésio e a mistura mestra. Misture suavemente as soluções por pipetagem, colocando-as no bloco de resfriamento. Adicione 15 microlitros da mistura aos capilares de teste no bloco de resfriamento, exceto na posição cinco.Este capilar é reservado para o padrão de quantificação. Transfira o bloco de resfriamento contendo os capilares e a mistura mestra com magnésio da capela limpa para uma capela de processamento separada. Adicione então dois microlitros do controle interno aos 30 microlitros restantes da mistura mestra.Misture a solução pipetando para cima e para baixo e transfira 15 microlitros dessa mistura para a capilar na posição cinco. Em seguida, adicione 10 microlitros de DNA controle com água ou DNA da amostra no local apropriado. Após o carregamento, tampe as capilares com a ferramenta de fechamento no centrífugo de capilares.Transfira os capilares do bloco de resfriamento para a posição correspondente no suporte do carrossel. Em seguida, carregue o carrossel na centrífuga e execute o ciclo após a centrifugação. Transfira o carrossel para a máquina de PCR em tempo real e execute a reação posteriormente durante a análise.Visualize os dados utilizando quantificação absoluta para garantir que uma curva esteja disponível para realizar quantificações, totalizando 228. Blocos de tecido foram testados por QPCR 91. Os blocos foram casos positivos para CMV com base na histologia e na imunohistoquímica positiva.18 blocos apresentaram C-M-V-I-H-C equívoco. Os outros 79 foram controles negativos. Casos positivos para CMV demonstraram.Inclusões virais típicas de CMV e coloração positiva na IHC, ou pelo menos um dos dois. Os casos equívocos demonstraram padrões de coloração não clássicos raros, enquanto os controles negativos não apresentaram histologia suspeita nem coloração na IHC das 91 amostras teciduais positivas para CMV 88. Testaram positivo por QPCR dos 71 controles negativos; um testou positivo para CMV por QPCR.A. Uma discussão sobre as biópsias com coloração C-M-V-I-H-C equívoca é fornecida no protocolo textual. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a extração de DNA a partir de tecido de biópsia gastrointestinal embebido em parafina fixado em formalina e, posteriormente, a detecção do DNA viral do citomegalovírus por PCR em tempo real.

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Neste vídeo, as células infectadas com vírions MCPyV foram submetidas a uma reação em cadeia de hibridização in situ para detectar genomas específicos do MCPyV. Além disso, a técnica DNA-HCR foi combinada com FISH para visualizar o DNA MCPyV em células da pele humana infectadas.

HCR-DNA FISH: Uma técnica de hibridização in situ de fluorescência para detectar DNA viral em células infectadas

Fornecido é um protocolo para o desenvolvimento de um ensaio de amplificação da polimerase recombinase em tempo real para quantificar a concentração inicial de amostras de DNA usando um termociclador ou um microscópio e aquecedor de platina. Também é descrito o desenvolvimento de um controle positivo interno. Os scripts são fornecidos para processar dados brutos de fluorescência em tempo real.

Desenvolvimento de um Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Ensaio com um controlo positivo interno

Os cromossomos projetados do projeto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, podem ser distinguidos de suas contrapartes nativas usando um ensaio de genotipagem baseado em PCR chamado PCRTagging, que tem um endpoint de presença/ausência. Aqui, descrevemos um método de detecção de PCR em tempo real de alto rendimento para genotipagem de PCRTag.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

O objetivo deste vídeo é para demonstrar como executar extração de DNA automatizado a partir de linhas fixas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de referência padrão de células e de gotículas digital de análise de PCR (ddPCR) para detectar mutações raras em um ambiente clínico. Detecção de mutações em amostras de FFPE demonstra a utilidade clínica de ddPCR em amostras FFPE.

Empregando Digital Gota PCR para detectar mutações BRAF V600E em parafina-encaixados Linhas Celulares de Referência Padrão fixadas em formalina

Obtenção de DNA genômico de alta qualidade dos tecidos de tumor é um primeiro passo essencial para a análise de alterações genéticas, utilizando a próxima geração de sequenciamento. Neste artigo, apresentamos um método simples e rápido para enriquecer as células do tumor e obter DNA intacto do toque espécimes de citologia de impressão.

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

Digital cadeia da polimerase (PCR) é uma ferramenta útil para a detecção de alta sensibilidade de variantes de nucleotídeo único e as variantes números de cópia do DNA. Aqui, demonstramos considerações-chave para variantes raras no genoma humano usando PCR digital com o formato de microplaqueta-em-um-tubo de medição.

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

Análise de reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real combinada com transcrição reversa (RT-qPCR) tem sido amplamente utilizada para medir o nível de infecções por vírus de RNA. Aqui nós apresentamos um ensaio de RT-qPCR direto, que não requer uma etapa de purificação de RNA, desenvolvida para a quantificação de vários vírus de RNA, incluindo o vírus da dengue.

Dengue vírus RNA no sobrenadante de cultura de células infectadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real de quantitativos de medição

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Identificação dos mecanismos subjacentes à lesão muscular é crucial. Aqui apresentamos a técnica histológica para preparar parafina e congeladas seções do Drosophila músculos do tórax. Isto permite a análise da morfologia do músculo e localização de proteínas e outros componentes celulares do músculo.

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

Aprenda a detectar DNA de citomegalovírus em biópsias gastrointestinais usando qPCR em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina. Este método oferece maior sensibilidade e especificidade diagnóstica.

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded (Vídeo) | JoVE Journal

qPCR é um método sensível e rápido para detecção de DNA por citomegalovírus em formalina-fixo, tecido da biópsia de parafina-embedded

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