Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium

O objetivo geral deste procedimento é comparar a expressão de microRNA em células-tronco pluripotentes induzidas. Células epiteliais pigmentadas da retina derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas e células epiteliais pigmentadas da retina fetais. Isso é realizado primeiramente cultivando e expandindo células IPS e RPE fetais.

O segundo passo é diferenciar as células iPS em RPE. Em seguida, o RNA é extraído das células iPS, das células iPS-RPE e das células RPE fetais. O passo final é realizar a análise de microarray de microRNA nas amostras de RNA e analisar os dados.

Por fim, a análise de vias e redes é utilizada para identificar microRNAs diferencialmente expressos que estão envolvidos em múltiplas redes celulares, incluindo proliferação e progressão do ciclo celular. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa da visão, como o papel do microRNA na regulação da diferenciação em células epiteliais pigmentadas da retina maduras, na progressão do ciclo celular, na proliferação e na senescência. As implicações desta técnica estendem-se à terapia com epitélio pigmentado da retina derivado de células-tronco, utilizada para substituir o EPR danificado ou afetado por doença, uma vez que o número de passagem Optima das células utilizadas na terapia pode ser determinado.

Embora este tema possa fornecer informações sobre os fatores que regulam a diferenciação de RRP a partir de IPS, ele também pode ser aplicado a outros sistemas orgânicos, como a diferenciação de outros tipos celulares específicos de TC a partir de IPS. Para iniciar este procedimento, plaque as células-tronco pluripotentes induzidas em cerca de 350 colônias celulares por poço em uma placa recém-revestida com meio M tester one, e permita que as colônias de IPSL se expandam por quatro a cinco dias em cultura.

Em seguida, a cada três dias, substitua o meio M tesser por quatro mililitros de meio de diferenciação e troque metade do meio por meio de diferenciação fresco. Deixe os focos pigmentados crescerem o suficiente para serem dissecados manualmente da cultura, o que leva cerca de 40 a 50 dias. Em seguida, utilize uma ponteira de pipeta de 200 microlitros para cortar ao redor e levantar as colônias pigmentadas.

Colete e reúna as colônias dissecadas em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione cinco mililitros de meio DMMF 12 às células de RPE reunidas e centrifugue a 300 ×g durante cinco minutos. Em seguida, remova o meio, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de meio e repita a centrifugação.

Remova o meio do pellet celular. Em seguida, prepare uma solução de células simples incubando o I-P-S-R-P-E agrupado com tripsina 0,25% EDTA por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius, até que os agregados celulares se dissociem em células individuais. Lave as células I-P-S-R-P-E com meio I-P-S-R-P-E e, então, plaque as células coletadas em uma placa nova revestida com matrigel em quatro mililitros de meio de cultura I-P-S-R-P-E, mantendo as células por três semanas antes da passagem e trocando o meio por meio I-P-S-R-P-E fresco a cada três dias durante o experimento.

Plaque as células I-P-S-R-P-E a 100.000 células por centímetro quadrado e, em seguida, colete as células 17 dias após a semeadura para obtenção de células IPS indiferenciadas. Incube as células até que colônias indiferenciadas sejam observadas densas no centro. Quando isso for observado, lave as colônias em meio D-M-E-M-F 12 e, em seguida, dissocie as células IPS em células individuais utilizando Accutase.

Coletar as células em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugar a 300 ×g por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em dois mililitros de meio D-M-E-M-F 12 para coletar o RPE fetal; primeiro, lavar as culturas de células de RPE fetal com D-M-E-M-F 12. Em seguida, dissociar as culturas celulares em células individuais utilizando TRIPSINA 0,25% com EDTA por cinco a 10 minutos, a 37 graus Celsius.

Colete as células de EPR fetal em um tubo cônico de 15 mililitros e centrifugue a 300 ×g por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de meio D-M-E-M-F 12.

Colete as células I-P-S-R-P-E no dia 17. Após a terceira e a quinta passagem, lave as células I-P-S-R-P-E duas vezes com PBS e prepare uma suspensão simples de células por meio da incubação com um mililitro de tripsina a 0,25% por cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, neutralize a tripsina com dois mililitros de meio I-P-S-R-P-E gelado e colete as células em um tubo cônico de 15 mililitros.

Centrifugue o tubo por cinco minutos a 300 Gs e, em seguida, aspire o sobrenadante. Re-suspenda o pellet celular em três mililitros de tampão de marcação do kit de microesferas. Centrifugue a suspensão celular I-P-S-R-P-E no tampão de marcação a 300 Gs por cinco minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e re-suspenda.

Suspenda o pellet celular até uma concentração de dois vezes 10 elevado a seis células por 100 microlitros do tampão de marcação do kit de microesferas. Adicione 10 microlitros do anticorpo anti-TRA um 60 PE por dois vezes 10 elevado a seis células. Misture bem e, em seguida, incube a quatro graus Celsius por 10 minutos.

Lave as células com um mililitro de tampão de marcação por duas vezes 10 elevado à sexta células. Em seguida, centrifugue a suspensão celular por 10 minutos a 300 ×g. A seguir, aspire o sobrenadante e re-suspenda o pellet celular em 80 microlitros de tampão de marcação por duas vezes 10 elevado à sexta células.

Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas marcadas com anti-PE por dois vezes 10 à sexta células. Misture bem e incube por 15 minutos a quatro graus Celsius. Adicione um mililitro de tampão de marcação por dois vezes 10 à sexta células, centrifugue por 10 minutos a 300 ×g e aspire o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 500 microlitros de tampão de marcação e separe as células negativas para TRA-1-60 em um separador magnético de células conforme descrito no protocolo de texto complementar. Lise as células passando cada amostra por uma coluna de microcentrífuga homogeneizadora comercialmente disponível, do tipo mini spin, projetada para mini-preparações de ácidos nucleicos. Em seguida, extraia o RNA total das células IPS, I-P-S-R-P-E e RPE fetal utilizando um kit comercialmente disponível de extração de RNA, projetado para preservar moléculas de RNA pequenas.

Utilize um espectrofotômetro NanoDrop para determinar as concentrações totais de RNA, podendo criar um arquivo Excel com uma lista dos microRNAs que foram identificados com níveis de expressão diferentes em pelo menos duas vezes entre os grupos de amostras. Em seguida, acesse o programa online de análise de vias de RNA e faça o upload do arquivo Excel. Selecione o formato flexível para o formato do arquivo e selecione Agilent na lista suspensa para o identificador.

Digite no cabeçalho de dados brutos. Atribua ID à coluna de ID da sonda e atribua observação um e razão logarítmica à coluna de razão logarítmica. Selecione ignorar para todas as outras colunas.

Selecione os parâmetros para análise da seguinte forma: confiança, observado experimentalmente, incluir apenas relações diretas e indiretas e incluir produtos químicos endógenos. Selecione a base de conhecimento Ingenuity como conjunto de referência. Em seguida, escolha a base de dados de moléculas de referência.

Isso inclui dados de todas as espécies, todas as linhagens celulares e tecidos e todas as mutações. Após selecionar todos os parâmetros, execute a análise de rede selecionando redes. Em seguida, selecione as redes sobrepostas e clique em uma rede de interesse para visualizar os resultados.

Células iPS que foram diferenciadas em células I-P-S-R-P-E exibiram o fenótipo clássico de RPE, com morfologia celular pigmentada hexagonal, semelhante às células de RPE fetais. A comparação do perfil de expressão de microRNAs entre células iPS indiferenciadas e células I-P-S-R-P-E revelou uma superexpressão de 47 microRNAs e 36 foram subexpressos, enquanto as células de RPE fetais mostraram 61 microRNAs superexpressos em comparação com as células I-P-S-R-P-E e 49 subexpressos. A análise de vias com o software Ingenuity IPA indicou que os genes-alvo dos microRNAs diferencialmente expressos estavam envolvidos em processos celulares, incluindo desenvolvimento celular, crescimento e ciclo celular. Essa análise também indicou que microRNAs expressos em tecidos oculares in vivo estavam enriquecidos nas células I-P-S-R-P-E e nas de RPE fetal em comparação com células iPS. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de prevenir contaminação e degradação das amostras de RNA após a realização deste procedimento.

Outros métodos, como a R-T-P-C-R, podem ser realizados para confirmar o nível de expressão de microRNA em cada tipo celular após sua implementação. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa da visão explorarem o papel do microRNA na diferenciação e na progressão do ciclo celular em rrp. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como derivar RPE de IPS e comparar o perfil de expressão de microRNA de RPE derivado de IPS com células IPS e RPE fetal.