Name: Dissecção e Análise de Downstream da Zebra Finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprenda a dissecar embriões de mandarim-da-índia (Taeniopygia guttata) em estágios iniciais com mínimo dano tecidual. Este método preserva a integridade embrionária para análises morfológicas, expressão gênica e estudos toxicológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Os autores agradecem as suas fontes de financiamento, do Instituto Médico Howard Hughes Programa de Educação de Graduação Ciência da College of William and Mary; Patrocinador Grant: NIH (MSS); Número Grant: R15NS067566. Eles também reconhecem o apoio do College of William and Mary, do Departamento de Biologia e Faculdade de Artes e Ciências de assistência com cuidados com os animais.

Declaração de Ética: Os métodos foram realizados com tentilhões-zebra domesticados da colônia de reprodução no College of William and Mary. Todos os procedimentos seguiram as orientações da RSPCA 23 e foram aprovados pelo College of William and Mary OLAW (Office of Laboratory Animal Welfare) Bem-Estar Animal Assurance (# A3713-01) e teve Comitê Institucional Animal Care e Use (IACUC) aprovação (# 2013-06 -02-8721-Dacris). 1. Coleção do ovo e Incubação <ol><li> Estabelecer pares passarinho de zebra em uma luz 14:10: Ciclo escuro. Fornecimento de alimentos, água, feno, e um ad libitum ninho. Nota: Cuidados de rotina e de reprodução de tentilhões-zebra tem sido bem descrita 23. </li><li> Prepare uma incubadora garota normal com prateleiras inclinadas. Nota: Manter a incubadora artificial a 37,5 (+ / - 1) ° C, com 80 - 95% de humidade por adição de água para o fundo da incubadora numa base diária. Permitir que a incubadora a equilibrar durante dois diasantes de usar. <ol><li> Selecione copos de alimentação pequenas (5 x 7,6 cm) de pelo menos 2,5 cm de profundidade para manter os ovos na incubadora. Forre o fundo e as bordas inferiores do copo com duas camadas de papel toalha para que o copo é preenchido, enquanto ainda permitindo que os ovos para rolar com facilidade. Colocar estes copos em prateleiras oscilantes da incubadora. Nota: O excesso de enchimento pode inibir a laminação, o que vai impedir de incubação bem sucedida devido a aderência embrionário para o interior do invólucro. </li></ol></li><li> Recolher os ovos em duas horas após o início do ciclo de luz. Nota: Isso minimiza discrepâncias no desenvolvimento palco para um determinado tempo de incubação devido a incubação dos pais. <ol><li> Pegar ovos suavemente com o polegar eo dedo indicador na ponta e na base ao longo do comprimento do ovo. Use um maçante, lápis macio grafite 4B para rotular a data prevista e do tempo coletados do ninho. Nota: O lápis 4B mais suave reduz o risco do lápis quebra a frágil casca de ovo. </li><li> 1.3.2) Coloque 1-5 ovos rotulados em cada c-se na incubadora de modo que os ovos pode rolar livremente para impedir a adesão embrionário para o interior da concha. Nota: Colocar mais de 5 ovos em um copo pode impedir rolamento dos ovos individuais e reduzir a viabilidade de embriões. </li></ol></li></ol> 2. Remoção de Embrião de ovo <ol><li> Para se preparar para a dissecação, reunir os seguintes materiais: um bisturi limpo, pinças de ponta fina, e duas finas ponta fórceps extras. Colocam-se 10 x 10 cm peso de papel sobre a base do escopo de dissecação para proporcionar uma superfície limpa, não absorvente para dissecção. Nota: O papel pesar é fundamental, pois permite fácil manipulação da gema e é a melhor superfície para cortar as delicadas membranas com um bisturi. </li><li> Prepara-se uma alíquota de solução salina de tampão fosfato (PBS 1X) num tubo de polipropileno de 50 ml, e adquirir, pelo menos, três pipetas de transferência e um pequeno balde de lixo. Se fixar os embriões, prepare uma alíquota de 4% paraformaldeído (PFA) Atenção:. Vapores PFA são tóxicos, umad todas as etapas que envolvem PFA deve ser feito dentro de um exaustor para minimizar a exposição. Se o Flash congelamento dos embriões, obter nitrogênio líquido e mantê-lo perto do escopo dissecar. A esterilidade não é um problema para este protocolo de dissecação, mas garantir que todos os materiais estão limpos. </li><li> Remover os ovos da incubadora no ponto de tempo necessária para a fase desejada, conforme descrito no guia de paragem zebra Finch 22. Nota: Retire os ovos após 36 horas de incubação para dissecar fase 6 embriões (Figura 4A) 22 e remover os ovos após 56 horas de incubação para dissecar palco 12 embriões (Figura 3A) 22. </li><li> Usando uma lâmpada iluminador de fibra óptica, vela do ovo, segurando-o ao longo de seu eixo e brilho de luz vertical através do ovo para iluminar o interior. Colocar a ponta da luz atrás do ovo e da gema e localizar o embrião em desenvolvimento. <ol><li> Posicionar o bisturi no lado oposto da gema e cortar ao longo do ovo a partir de ponta debase com pressão fraca. </li></ol></li><li> Remover o conteúdo do ovo aplicando-se cuidadosamente a pressão na ponta e base do ovo com o polegar e o dedo indicador, ou empurrando com cuidado para além da casca do ovo ao longo do corte com uma pinça. Abra o ovo diretamente sobre o papel pesar para que a gema rola suavemente para fora. </li><li> Examinar a gema para a zona branca de junção, o que é visível como um anel branco fraco circundando o desenvolvimento embrionário e orientar a gema usando extra fino desviado fórceps de modo a que o embrião está localizado no centro. Nota: Se um círculo branco fraco na superfície da gema não for observado, tomar as pinça fina e delicadamente rolar a gema sobre até que o embrião é em cima da gema. Nota: Para as fases 1-9 22, o disco embrionário é menor do que 6 mm de diâmetro e é visível como, um disco ligeiramente opaca fraco na superfície da gema - ver Figura 1 por referência. Para os estágios 10 e mais velhos 22, piscinas de sangue permitem melhorou visibility do embrião, mas tome cuidado para evitar a perfuração do saco vitelino, pois isso faz com que a localização do embrião difícil. </li></ol> 3. Separação de embriões a partir de tecido extra-embrionário <ol><li> Perfurar as bordas da gema para aliviar a pressão (Figura 1B), e fazem cortes individuais em todo o comprimento do diâmetro vitelino ao lado do disco embrionário. Repetir tornando estas linhas diagonais até que a secção da gema contendo o embrião foi separado com sucesso (Figura 1B). Nota: Este passo permite que a massa de gema para permanecer intacta, mas a pressão reduzida na superfície da gema permite uma maior precisão no corte em torno do embrião, a prevenção de danos em estruturas embrionárias. </li><li> Retirar as bordas da gema com uma pipeta de transferência. Nota: Remover o máximo possível de gema, mas deixa uma pequena quantidade de modo a que o embrião não adere à superfície seca do papel de pesar e desgaste. </li><li> Lavar o disco embrionário por dispensing 1X PBS, a um ângulo de 45 ° em direcção ao fundo do embrião. Colocar a ponta da pipeta de transferência próxima para não acima do disco embrionário. Se as necessidades de gema adicionais a serem removidos, separar qualquer gema com o bisturi sobre o papel antes de pesar transferência do embrião para a placa de Petri. Nota: Este método remove o embrião a partir da superfície do papel de pesagem. </li><li> Transferir o embrião usando uma pipeta de transferência, juntamente com um volume mínimo de 1X PBS para uma pequena placa de Petri de plástico. Lavar o embrião adicionando mais 1X PBS para a placa de Petri e pingando 1X PBS próximo, mas não directamente sobre o embrião. Agitar a placa de Petri para lavar e remover gema residual, incline a placa de Petri, e remover resíduos 1X PBS com a pipeta de transferência. Nota: Quando o 1X PBS é removida, o embrião normalmente não aderem ao fundo da placa de Petri de plástico, porque é a superfície escorregadia com residual 1X PBS. No entanto, mais 1X PBS pode ser adicionada se o embrião adere ao prato. Se fixação tele embrião, siga os passos 3.5 e 3.6. Se o Flash congelamento do embrião, pule para o passo 3.8 imediatamente. </li><li> Se a fixação do embrião para hibridação in situ, adicionar imediatamente PFA a 4% para a placa de Petri, para submergir o embrião. Gotejamento PFA a 4% directamente sobre o topo do embrião, a fim de achatar; isso impede que o embrião do curling. Corrigir o embrião em PFA a 4% a 4 ° C durante 12 hr. <ol><li> Após a fixação, desidratar embriões em metanol graduada soluções (MeOH) e armazenar a -20 ° C em 100% de MeOH. </li></ol></li><li> Se o embrião está entre as fases 1-8 22, remover a membrana vitelina aderido ao embrião. Nota: Este passo pode ser feito durante ou após fixação. Os embriões com menos de estágio 8 22 não são facilmente visualizados, porque eles aderem à membrana vitelina, obscurecendo estruturas essenciais, como visto na Figura 2A. <ol><li> Segure a borda da membrana que se estende para além da zona de junção com uma pinça extra fino. Carefully virar o embrião sobre várias vezes para lavar grânulos de vitelo residuais e para soltar a aderência do disco embrionário para a membrana vitelina. Nota: Não toque no centro do embrião, pois isso irá danificar estruturas embrionárias. </li><li> Se uma lacuna não aparece entre a zona de junção e a membrana vitelina, gentilmente arranhar a zona de junção com o extra fino ponta fórceps para soltá-lo da membrana vitelina. Segure a membrana vitelina com o extra fino ponta pinça e puxe-o para longe do embrião. Se necessário, puxe o embrião longe da membrana vitelina agarrando a borda periférica do disco embrionário na zona de junção. </li><li> Descarte a membrana vitelina em risco biológico 1 resíduos (nível de biossegurança 1) após a remoção. </li></ol></li><li> Ao realizar um ensaio ISH em jovens estágios embrionários, siga todo protocolos montagem ISH padrão para embriões de galinha 24, 25, mas considere as seguintes sugestões. <ol&gt; <li> Para reduzir os danos aos embriões durante o procedimento ISH, usar um único frasco de vidro 5 ml com tampa de rosca para cada embrião. Apenas encher frascos com 2-3 ml de solução, garantindo que os embriões são totalmente submerso. Frascos nutar verticalmente colocando frascos de 5 ml num suporte de isopor (ou qualquer cremalheira que vai manter os frascos seguros) que é presa a um nutator. Nota: Esta precaução evita o embrião seja rompida, o que pode ocorrer quando se entra em contacto com a tampa do frasco durante nutação horizontal. </li><li> Para os embriões fase 0-6 22, trata-se com 5 ug / ml de proteinase K em 1X PTW durante 5 min à temperatura ambiente. Treat embriões encenado 7 - 12 22 com 10 ug / ml de proteinase K em 1X PTW durante 10 min a 37 ° C para reduzir a coloração de fundo. </li><li> Para produzir uma reacção colorida suficiente para detectar baixos níveis de expressão de genes em fases 1-10 22, incubar com uma concentração de sonda de 10 ng / ml durante 12 horas. Para os estágios mais antigos, incubar com 1 &amp; #956; g / ml de concentração de sonda a 60 ° C. </li></ol></li><li> Se o embrião de congelamento flash, rapidamente adicionar 2-3 ml 1X PBS para a placa de Petri após dissecção e incline a placa de Petri para separar o embrião dos grânulos de vitelo. Remover o líquido e repetir 2 - 3 vezes para remover todos gema. Usando bem cotado fórceps, transferência de embriões para um tubo de microcentrífuga pré-rotulados e congelamento de flash em nitrogênio líquido antes de armazenar a -80 ° C. </li></ol> 4. EdU celular Ensaio de Proliferação. Incorporação e Detecção de EdU em Zebra Finch Embriões. <ol><li> Candle o ovo usando uma lâmpada de iluminador de fibra óptica para localizar o embrião ou gema. </li><li> Marcar o lado oposto do ovo para a localização do embrião ou gema de ovo dentro do para garantir que o embrião não seja danificada durante o processo de microinjecção. </li><li> Linha de um prato de plástico de 60 mm e argila de modelagem e moldá-lo na forma de uma bacia para manter o ovo na orientação desejada. O local marcado deve serorientado para permitir a inserção da agulha de microinjecção utilizando o micromanipulador. Nota: O barro vai estabilizar o óvulo durante a microinjeção e em toda a incubação no passo 4.11. </li><li> Puxe duas agulhas microinjeção capilares de vidro. Blunt uma agulha para fazer um buraco no ovo no local marcado. Prepare a segunda agulha microinjeção para injecção por backloading-lo com óleo mineral e inseri-lo na microinjetor. </li><li> Definir o volume de solução lançado por injecção para 59,8 nl no microinjetor. </li><li> Coloque a agulha de microinjecção com a solução estoque EdU 10 mM. </li><li> Criar um buraco no casco no local marcado com o capilar de vidro, embotada, tomando cuidado para não quebrar a casca ou soltar pedaços da casca do ovo para a cavidade. Orientar o ovo de forma que o furo está a um ângulo de 45 °, permitindo que a agulha de microinjecção para ser inserida directamente na cavidade para a gema ou embrião. </li><li> Usando o micromanipulador, inserir ocarregado agulha aproximadamente 1,0 cm para dentro da cavidade. </li><li> Injectar a quantidade desejada da solução EdU directamente sobre o embrião em desenvolvimento ou gema. Nota: Um máximo de 478 nl Edu pode ser injetado, sem resultar em morte embrionária. </li><li> Imediatamente embrulhar o ovo e o suporte de argila com múltiplas camadas de película de plástico para cobrir o ovo e o recipiente para evitar a dessecação do embrião durante a incubação. Fita as extremidades do plástico moldado para a parte inferior do recipiente para evitar que o plástico se desenrole durante a incubação. Nota: O plástico só deve ser removida imediatamente antes da dissecação. </li><li> Permitir que as células em proliferação recentemente para incorporar o EdU por incubação do ovo, a 37 ° C até à fase desejada seja atingida. Após a injeção, não retorne ovo para inclinar prateleiras na incubadora. Coloque a argila prato forrado envolto em plástico na superfície estável dentro da incubadora. </li><li> Retire o filme plástico e dissecar o embrião seguindo o protocolo acima mencionado.Corrigir o embrião em PFA a 4% e incubar 12 horas a 4 ° C como descrito acima. Após a fixação, lava-se com etanol a 100% (EtOH), durante 5 min e armazenar em fresco EtOH a 100% a -20 ° C até análise posterior. </li></ol> 5. Edu &quot;Clique em&quot; Protocolo de Reação Os seguintes passos são realizados todos em frascos de vidro. <ol><li> Rehidratar embriões com sucessivas lavagens de 5 min a seguinte: </li><li> EtOH, EtOH a 75% e 25% desionizada estéril destilada (sdd) de água, 50% de EtOH e 50% sdd água, 25% de EtOH e 75% 1X PTW, 100% 1X Ptw </li><li> Lavar três vezes em 100% 1X PTW durante 10 min cada. </li><li> Dilui-se o aditivo de tampão de reacção (Kit de componentes F) através da combinação de uma parte da solução de estoque de tampão 10X (10 mL) a 9 partes de sdd água (90 mL). </li><li> Preparar a mistura de reacção num tubo separado, misturando o seguinte: 875 ul de PBS 1X, 20 ul de CuSO 4, 5 ul de azida, 100 ul de tampão de reacção diluída aditivo.Nota: O volume da mistura de reacção pode ser reduzida. A reacção funcionará se o embrião está completamente coberta na mistura de reacção. Adicionar o aditivo de tampão de reacção diluída (passo 5.3) imediatamente antes da utilização. Todos os passos subsequentes são realizados no escuro. Cubra os embriões com papel alumínio para proteger da luz. </li><li> Cobrir os tubos de ensaio com folha de alumínio, e incube-as verticalmente à temperatura ambiente durante duas horas, colocando-os num suporte de isopor ligado a um nutator. </li><li> Lavar os embriões 3 vezes em 1X PBS fresco durante 10 min cada. </li><li> Incubar os embriões em fresco PFA a 4% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Lavar 3 vezes em 1X PBS durante 10 min cada e armazenar em fresco 1X PBS a 4 ° C. Cubra os embriões com papel alumínio até que uma análise mais aprofundada. </li></ol>

<ol><li>Eng, M. L., Elliott, J. E., MacDougall-Shackleton, S. A., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+exposure+to+2%2C2%27%2C4%2C4%27%2C5-pentabromodiphenyl+ether+%28BDE-99%29+affects+mating+behavior+of+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Early exposure to 2,2',4,4',5-pentabromodiphenyl ether (BDE-99) affects mating behavior of zebra finches.</a> Toxicol Sci. 127, 269-276 (2012).</li>
<li>Winter, V., Elliott, J. E., Letcher, R. J., Williams, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+egg-injection+method+for+embryotoxicity+studies+in+a+small%2C+model+songbird%2C+the+zebra+finch+%28Taeniopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Validation of an egg-injection method for embryotoxicity studies in a small, model songbird, the zebra finch (Taeniopygia guttata).</a> Chemosphere. 90, 125-131 (2013).</li>
<li>Maney, D. L., Goodson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenomic+mechanisms+of+aggression+in+songbirds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurogenomic mechanisms of aggression in songbirds.</a> Adv Genet. 75, 83-119 (2011).</li>
<li>Kirn, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+neurogenesis+and+growth+of+brain+regions+to+song+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+and+Language%22%5BJournal%5D)">The relationship of neurogenesis and growth of brain regions to song learning.</a> Brain and Language. 115, 29-44 (2010).</li>
<li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends in Genetics. 25, 166-167 (2009).</li>
<li>Tokarev, K., Tiunova, A., Scharff, C., Anokhin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+for+Song%3A+Expression+of+C-Fos+and+ZENK+in+the+Zebra+Finch+Song+Nuclei+during+Food+Aversion+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Food for Song: Expression of C-Fos and ZENK in the Zebra Finch Song Nuclei during Food Aversion Learning.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Vargha-Khadem, F., Gadian, D. G., Copp, A., Mishkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP2+and+the+neuroanatomy+of+speech+and+language%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FOXP2 and the neuroanatomy of speech and language.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 131-138 (2005).</li>
<li>Schulz, S. B., Haesler, S., Scharff, C., Rochefort, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FoxP2+alters+spine+density+in+Area+X+of+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FoxP2 alters spine density in Area X of the zebra finch.</a> Genes, Brain and Behavior. 9, 732-740 (2010).</li>
<li>Jarvis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+brains+and+a+new+understanding+of+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution.</a> Nat Rev Neurosci. 6, 151-159 (2005).</li>
<li>Brainard, M. S., Doupe, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+birdsong%3A+songbirds+as+a+model+for+basic+applied+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Translating birdsong: songbirds as a model for basic applied medical research.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 489-517 (2013).</li>
<li>Mayer, U., Watanabe, S., Bischof, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+memory+and+the+avian+hippocampus%3A+Research+in+zebra+finches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol+Paris%22%5BJournal%5D)">Spatial memory and the avian hippocampus: Research in zebra finches.</a> J Physiol Paris. , (2012).</li>
<li>Warren, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+a+songbird%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome of a songbird.</a> Nature. 464, 757-762 (2010).</li>
<li>Agate, R. J., Scott, B., Haripal, B., Lois, C., Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+songbirds+offer+an+opportunity+to+develop+a+genetic+model+for+vocal+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transgenic songbirds offer an opportunity to develop a genetic model for vocal learning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17963-17967 (2009).</li>
<li>Birkhead, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+incubation+and+early+hatching+in+brood+parasitic+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Internal incubation and early hatching in brood parasitic birds.</a> Proceedings of the Royal Society Biological Sciences. 278, 1019-1024 (2011).</li>
<li>Haesler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP2+expression+in+avian+vocal+learners+and+non-learners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners.</a> J Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).</li>
<li>Godsave, S. F., Lohmann, R., Vloet, R. P. M., Gahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptors+in+the+embryonic+zebra+finch+hindbrain+suggest+a+function+for+maternal+androgens+in+perihatchingsurvival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Androgen receptors in the embryonic zebra finch hindbrain suggest a function for maternal androgens in perihatchingsurvival.</a> Journal of Comparative Neurology. 453, 57-70 (2002).</li>
<li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick%3B+a+great+model+system+becomes+even+greater%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The chick; a great model system becomes even greater.</a> Dev Cell. 8, 9-17 (2005).</li>
<li>Kuenzel, W. J., Medina, L., Csillag, A., Perkel, D. J., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+subpallium%3A+new+insights+into+structural+and+functional+subdivisions+occupying+the+lateral+subpallial+wall+and+their+embryological+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The avian subpallium: new insights into structural and functional subdivisions occupying the lateral subpallial wall and their embryological origins.</a> Brain Research. 1424, 67-101 (2011).</li>
<li>Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+chicken+embryology+to+the+understanding+of+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The contribution of chicken embryology to the understanding of vertebrate limb development.</a> Mech Dev. 121, 1019-1029 (2004).</li>
<li>Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rediscovering+the+chick+embryo+as+a+model+to+study+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development.</a> Neural Development. 7, (2012).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Research. 117, 231-239 (2007).</li>
<li>Murray, J. R., Varian-Ramos, C. W., Welch, Z. S., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+staging+of+the+zebra+finch%2C+Taeniopygia+guttata%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Embryological staging of the zebra finch, Taeniopygia guttata.</a> J Morphol. , (2013).</li>
<li>Hawkins, P., Morton, D. B., Cameron, D., Cuthill, I., Francis, R., Freire, R., Gosler, A., Healy, S., Hudson, A., Inglis, I., Jones, A., Kirkwood, J., Lawton, M., Monaghan, P., Sherwin, C., Townsend, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+birds%3A+refinements+in+husbandry+and+procedures.+Fifth+report+of+BVAAWF%2FFRAME+%2FRSPCA%2FUFAW+Joint+Working+Group+on+Refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Laboratory birds: refinements in husbandry and procedures. Fifth report of BVAAWF/FRAME /RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement.</a> Lab Anim. , (2001).</li>
<li>Pearse II, R. V., Esshaki, D., Tabin, C. J., Murray, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+of+intra-+and+extraarticular+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis of intra- and extraarticular connective tissue.</a> Journal of Orthopaedic Research. 27, 427-434 (2009).</li>
<li>Pizard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+in+situ+hybridization+and+detection+of+RNAs+in+vertebrate+embryos+and+isolated+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount in situ hybridization and detection of RNAs in vertebrate embryos and isolated organs.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 66, (2004).</li>
<li>Warren, M., Puskarczyk, K., Chapman, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+proliferation+studies+using+EdUlabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Chick embryo proliferation studies using EdUlabeling.</a> Developmental Dynamics. 238, 944-949 (2009).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+syntesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA syntesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Hoogesteijn, A. L., DeVoogd, T. J., Quimby, F. W., De Caprio, T., Kollias, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+impairment+in+zebra+finches+%28Taeinopygia+guttata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reproductive impairment in zebra finches (Taeinopygia guttata).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 24, 219-223 (2005).</li>
<li>Winter, V., Williams, T. D., Elliott, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-generational+study+of+In+ovo+exposure+to+PBDE-99+in+the+zebra+finch%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A three-generational study of In ovo exposure to PBDE-99 in the zebra finch.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 32, 562-568 (2013).</li>
<li>Kitulagodage, M., Buttemer, W. A., Astheimer, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+fipronil+on+avian+reproduction+and+development%3A+maternal+transfer+of+fipronil+to+eggs+in+zebra+finch+Taeinopygia+guttata+and+in+ovo+exposure+in+chickens+Gallus+domesticus%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of fipronil on avian reproduction and development: maternal transfer of fipronil to eggs in zebra finch Taeinopygia guttata and in ovo exposure in chickens Gallus domesticus.</a> Ecotoxicology. 20, 653-660 (2011).</li>
<li>Hallinger, K. K., Zabransky, D. J., Kazmer, K. A., Cristol, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birdsong+differs+between+mercury-polluted+and+reference+sites%5BTitle%5D)+AND+%22The+Auk%22%5BJournal%5D)">Birdsong differs between mercury-polluted and reference sites.</a> The Auk. 127, 156-161 (2010).</li>
<li>Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+in+situ+Hybridization+for+Detecting+Diverse+Gene+Expression+Patterns+in+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+Avian+Brain+Chimeras+Reveal+That+Large+Brain+Size+Differences+Are+Influenced+by+Cell%E2%80%93Interdependent+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Interspecies Avian Brain Chimeras Reveal That Large Brain Size Differences Are Influenced by Cell–Interdependent Processes.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Chen, C. C., Winkler, C. M., Pfenning, A. R., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+the+developing+avian+telencephalon%3A+Regional+timing+and+brain+subdivision+continuities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of the developing avian telencephalon: Regional timing and brain subdivision continuities.</a> The Journal of Comparative Neurology. 521, 3666-3701 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O recente desenvolvimento de um guia de preparo embrionário 22 e anotação do genoma fazer o tentilhão um organismo modelo para estudos de desenvolvimento desejável. No entanto, o pequeno tamanho e fragilidade dos embriões zebra passarinho, que variam entre 3 e 7 mm de estágios 1 - 10 22, pode tornar difícil dissecções 11, 14. Localizando e de forma limpa retirar embriões a partir da superfície da gema pode ser um desafio. Este protocolo fornece detalhes suficientes para realizar o procedimento com facilidade. Este protocolo demonstra as etapas críticas que não são tipicamente conhecidos, mas são necessárias para garantir uma dissecção de sucesso. Por exemplo, é essencial para deixar uma pequena camada de gema de entre o embrião e a folha de papel de pesagem para evitar que adere. Tanto a identificação e remoção do embrião pode ser difícil. Para solucionar a identificação do embrião sobre a superfície da gema, brilho de luz directamente por cima da gema após temfoi removido do ovo, e olhar para a gema de um ângulo de 45 ° para encontrar o embrião. Uma vez que o embrião está localizado, a gema de corte em peso de papel, tendo o cuidado de não destruir o embrião. Se outras aplicações incluem imagiologia por diferenças anatómicas, hibridação in situ, ou de ensaios de proliferação celular, é importante remover a membrana vitelina em fase 1-8 22 para uma melhor visualização das estruturas. Se passando por dificuldades ao remover a gema ou a membrana vitelina em estágios iniciais, fixe o embrião em PFA 4% antes de lavá-lo em 1X PBS para reduzir a fragilidade embrionário. Ao primeiro remover a membrana vitelina durante a dissecção, como descrito, as estruturas são claramente visíveis e intacto em embriões tentilhão após a realização de uma hibridização in situ. Uma limitação do Edu é que a administração de volumes de dosagem sobre 478 ligações nl a fatalidade embrionário. No entanto, a vasta gama de dosagem permite varyinníveis de g de marcação de proliferação celular. A reação &quot;click&quot; utilizado neste kit é o de cobre (I)-catalisada por Alcino-Azida-cicloadição (Cu (I) AAC). Nesta reacção especifica, uma molécula de análogo da timidina contendo alcino (EdU) é constituída por células em divisão activa. O grupo alcino no EdU se projecta a partir da estrutura helicoidal do ADN, e é detectada pela exposição a uma molécula de azida conjugado com uma molécula de verde, fluorescente que se liga ao grupo alcino livre. A fluorescência verde indica que as células em proliferação recentemente no embrião. A bio-ortogonalidade da azida e os grupos alcino impede a coloração não específica, porque estas espécies reactivas não estão naturalmente presentes nos organismos. Além disso, porque o ADN não necessita de ser desnaturado de modo a que a reacção ocorra, uma análise posterior dependente de DNA podem ser facilmente realizados 27. Uma limitação inerente do método é o tamanho pequeno e fragility de embriões passarinho de zebra. Retirar a membrana vitelina de embriões encena 1-15 22 pode resultar em estruturas embrionárias prejudiciais se não for realizado com cautela. No entanto, este protocolo simplifica o método de dissecação, permitindo aos investigadores utilizar estágios embrionários iniciais para analisar anomalias estruturais e expressão de genes que não foram anteriormente estudadas em profundidade. Este protocolo abre o caminho para uma infinidade de ensaios celulares-molecular que permitirá que os investigadores a determinar as origens do desenvolvimento de fenótipos adultos. Por exemplo, será possível analisar a expressão de genes implicados na aprendizagem vocal sob diversas condições ambientais ou após tratamentos farmacológicos nas primeiras fases de desenvolvimento 28, 29,30,31. Apesar de não demonstrado neste trabalho, este método potencialmente permite a outros procedimentos, como radioativa em hibridização in situ em cortes de tecidos passarinho de zebra e eletroporação / in ovo Cirurgia 32, 33,34. Dado que o tentilhão foi estabelecida como um organismo modelo importante dentro de um vasto corpo de literatura, esses estudos fornecem oportunidades inexploradas para ligar mecanismos de desenvolvimento com a fisiologia eo comportamento adulto, em especial, o desenvolvimento da linguagem 7, 9.

O objetivo geral desta técnica é obter zebra Finch (Taeniopygia guttata) embriões desde os primeiros estágios da embriogênese para uso em uma ampla gama de estudos de desenvolvimento. Passarinho de zebra tornaram-se o modelo predominante songbird organismo e têm sido amplamente utilizados em uma variedade de campos, incluindo toxicologia 1,2, 3 comportamento, memória e aprendizagem 4,5,6, neuroanatomia comparativa 7,8 e desenvolvimento da linguagem 9,10 . Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão permite o estudo molecular e genética da ordem Passeriformes, o que representa mais de 50% das espécies de aves conhecidas 11, 12,13. Apesar do uso de adulto e tentilhão juvenil em uma diversificada gama de campos, poucos estudos foram realizados em embriões zebra passarinho, especialmente durante os estágios iniciais de desenvolvimento. Isto pode ser atribuído ao tamanho pequeno do seu ovos umª embriões, e seu status como uma nova 14,15,16 organismo modelo para estudos em que o frango (Gallus gallus domesticus) já foi usado como um sistema de 17,18,19,20,21 modelo predominante. No entanto, como os alunos não-vocais, as galinhas não são um sistema modelo adequado para estudar a base genética da aprendizagem vocal, desenvolvimento da aprendizagem vocal, herdabilidade, comportamento, eo circuito córtico-basal gânglios envolvidos na aprendizagem de motor 10. É importante notar que os embriões zebra passarinho são muito mais delicada e mais facilmente danificadas do que embriões de galinha durante a dissecção e procedimentos moleculares. Em particular, o maior cuidado é necessário ao executar passos permeabilização de embriões passarinho de zebra. Detergentes fortes e enzimas que não iria prejudicar um embrião de galinha pode danificar embriões passarinho de zebra. Em termos de cuidados gerais, é necessário colocar ovos passarinho de zebra em pequenos copos antes da colocação em uma incubadorapara evitar que se quebre rolando durante a incubação. Passarinho de zebra são passíveis de estudos comportamentais, de forma fácil e prolífica raça durante todo o ano em cativeiro, e são aprendizes vocais. Estas características permitem o uso de passarinho de zebra para atender à necessidade de um organismo modelo que integra o desenvolvimento, genética e aspectos comportamentais da linguagem. Os métodos de dissecções detalhadas abaixo, combinadas com um guia de preparação desenvolvido recentemente específico para zebra finch 22, fazer o tentilhão um modelo de desenvolvimento padronizado organismo cada vez mais útil. No entanto, a obtenção de embriões em estágios iniciais pode ser assustador. Este protocolo permite aos investigadores obter facilmente embriões em fase inicial. Estudos que investigam o desenvolvimento inicial ea base molecular do desenvolvimento de comportamentos complexos em zebra passarinho, ou os efeitos toxicológicos de desenvolvimento em outros pequenos, aves passeriformes vai encontrar esta metodologia dissecção útil.

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td></td><td></td> de ovos de galinha <td>Usamos uma Incubadora Hova-Bator de Janela de Imagem, Modelo de Ar Circulado&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de imagem</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Detecção de proliferação celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Usamos Olympus SZ61</td></tr><tr><td>7 '' Drummond capilar para injetor Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-00-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject II microinjetor</td><td>Pinça Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 55</td><td>World Precision Instruments</td><td>14099</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50 ml Tubo Falcon (polipropileno)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FastPrep Lysis Matrix H</td><td>MP biomedicals</td><td>6917-100</td><td>Usado para extração de RNA, usado para homogeneizar embriões</td></tr><tr><td>Lâmpadas de iluminação de fibra óptica (Iluminador de Alta Intensidade)</td> <td>Dolan-Jenner Industries&nbsp;</td><td>Fiber-Lite MI-150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro com tampa de rosca (tratados com DEPC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de eppe de microcentrífuga (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8410</td><td></td></tr><tr><td>Argila</td><td></td><td></td> de modelagem <td>Qualquer marca</td></tr><tr><td>Narshige PB-7 extrator de agulhas</td><td>Narshige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omni Bead Homogeneizador Ruptor</td><td>OMNI International</td><td>19-010</td><td>Usado para extração de RNA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeído (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g de paraformaldeído, 350 ml sdd H2O, ajuste o pH para 7,6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x</td><td>PBS Fixação de embriões. Cuidado, é prejudicial e não inalar.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1.800 ml Barnstead H2O, ajuste o pH para 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2,013 g KCL, 80,063 g NaCl, 2,722 g KH2PO4 monobásico, 14,196 g de Na2HPO4 dibásico, 200 ml Barnstead H2O, ajuste o pH para 6,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato com 0,1% de Tween-20 (1x PTw): 1.800 ml de Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, ajustar o pH para 7,4, 2 ml Tween-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 ml Placa de Petri de plástico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>plástico plástico de qualquer</td><td></td><td></td><td>marca</td></tr><tr><td>Prepease RNA Spin Kit</td><td>PrepEase, Affymetrix</td><td>78766 1 KT</td><td>Usado para extração de RNA, usado para homogeneizar embriões</td></tr><tr><td>Mistura de Reação: 875 &mu; l 1xPBS, 100 mM 20 &mu; l CuSO4 (Kit Componente E), 5 &mu; l Alexa Fluor 488 azida (Kit Componente B), 100 &mu; l aditivo tampão de reação diluído (Kit Componente F)</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Detecção de proliferação celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>sdd H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Copo de sementes&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Nós o usamos como um recipiente para incubar ovos</td></tr><tr><td>Bisturi de aço inoxidável&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caixa</td><td></td><td></td> de ninho padrão <td>Usamos Abba Plastic Finch Nestboxes</td></tr><tr><td>4 ml, Tampa Revestida de Teflon, Frascos de Vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-912-352</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferência (polietileno)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Papel de pesagem 4 x 4</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

dissecção e análise de downstream da zebra finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento

Dissection and Downstream Analysis of Zebra Finch Embryos at Early Stages of Development

O passarinho de zebra (Taeniopygia guttata) tornou-se um modelo cada vez mais importante organismo em muitas áreas de pesquisa, incluindo toxicologia 1, 2, 3 comportamento e memória e aprendizagem 4,5,6. Como a única ave canora com um genoma seqüenciado, o tentilhão tem um grande potencial para o uso em estudos de desenvolvimento; No entanto, as fases iniciais de desenvolvimento da zebra Finch não ter sido bem estudado. A falta de pesquisa em desenvolvimento Finch zebra pode ser atribuída à dificuldade de dissecção do ovo pequeno e embrião. O seguinte método de dissecação minimiza os danos do tecido embrionário, o que permite a investigação da morfologia e a expressão do gene em todos os estádios de desenvolvimento embrionário. Isto permite que ambos campo brilhante e as imagens de embriões qualidade de fluorescência, a utilização em procedimentos moleculares, tais como hibridação in situ (ISH), ensaios de proliferação celular, e a extracção de ARN para ensaios quantitativos, tais como rea quantitatival-time PCR (qtRT-PCR). Esta técnica permite que os investigadores a estudar estágios iniciais de desenvolvimento que antes eram de difícil acesso.

Os passos no diagrama da Figura 1 indica a aparência do embrião, enquanto ligado à membrana vitelina (A) e demonstrar o método adequado para separar o embrião da gema (B). O embrião pode ser identificado por a zona de junção, o que é muito mais leve do que a membrana vitelina. O embrião é em si, muitas vezes difíceis de distinguir até que a gema é cortado. Uma vez que o embrião é dissecado a partir do ovo, que pode ser fixo ou flash congelado para uso futuro. Se uma hibridização in situ está prevista para o embrião dissecado, que é necessário para remover a membrana vitelina que é aderida ao embrião através da zona de junção. Figura 2 ilustra o melhor visibilidade do embrião uma vez que este é removido da membrana (C), ea maneira correta de descascar a membrana vitelina (A, B). Após a dissecção e fixação, toda montagem de hibridação in situ foi efectuada tal como visto na Figura 3 (A, A &#39;, B, B&#39;) E Figura 4 (A, A&#39;, B, B &#39;) e Figura 5 (A, B, C) ​​para detectar diferenças em orthodenticle homeobox 2) expressão (OTX2 em embriões developmentally expostos a doses baixas de metilmercúrio. Figura 5 mostra resultados da sonda sentido, demonstrando falta de fundo. Na Figura 4, apesar de ter sido dissecada do ovo ao mesmo ponto de tempo, o embrião developmentally expostos ao metil-mercúrio (metilmercúrio) progrediu para a fase 5 22 (B, B &#39;), enquanto que o embrião de controlo desenvolvida para a fase 6 22 (A, A &#39;). O grupo de embriões dissecados e mostrado na Figura 4 foram recolhidas a partir do ninho e retirado da incubadora nos mesmos tempos. Embora alguma variação natural está presente em desenvolvimento, com base em dados anteriores de dissecção, é pouco provável que as variações de temperatura na incubadora causaria apenas os embriões de metilmercúrio 2,4 ppm ser desenpmentally retardada. As diferenças de estágios indicam mudanças na proliferação celular em embriões developmentally expostas ao metilmercúrio. Antes de dissecção, EdU foi injectada num ovo dia 2 e deixou-se incubar durante a noite. Após a dissecção e a fixação da fase 16 22 embrião, EdU foi visualizada usando o &quot;clique&quot; química, permitindo a detecção de células que proliferam como pode ser visto na Figura 6 (A, B, C). É importante acompanhar atentamente os momentos ao colocar ovos na incubadora e durante dissecações, como a exposição ao metilmercúrio ou da realização do ensaio EdU pode interromper a progressão do desenvolvimento. Os primeiros injecção foi efectuada no dia 0, que foi o dia da colheita, tal como especificado no passo 1.3. Este embrião foi dissecado aproximadamente 38 horas depois (fase 7 22). A taxa de sobrevivência foi encontrada em cerca de 90% (o mesmo ritmo que os embriões de controlo), enquanto a quantidade de injecção foi de 478 nl sob. 22 embriões, uma extracção de RNA foi feita de acordo com o protocolo do fabricante, com nenhuma optimização necessário, como pode ser visto na Figura 7. A remoção da membrana vitelina é desnecessária para a extracção de ARN e posteriores aplicações de qRT-PCR. Nota: Todos os valores de embriões são orientadas de modo que as regiões anterior e posterior são na parte superior e na parte inferior da imagem, respectivamente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig1highres.jpg" /> Figura 1. Procedimento para localizar e dissecar embriões zebra passarinho, encena 1-10 22. Localize embrião por suavemente ondulado a gema até que o disco branco fraco é aparente (A). Uma vez que oembrião está localizado no centro da gema, a gema é dissecado de uma forma passo a passo (B), onde o primeiro corte alivia a pressão da membrana vitelina (1) e os cortes posteriores (2) limitam a zona de junção (zj) que está aderidas à membrana vitelina. Barras de escala representam um milímetro. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig2highres.jpg" /> Figura 2. Remoção de membrana vitelina e visibilidade de estruturas embrionárias. Após remoção do embrião da gema, lugar de embriões em uma placa de Petri contendo 4% de PFA. Se uma hibridização in situ tem de ser realizada, a visibilidade das estruturas embrionárias é essencial e pode ser conseguido pela remoção da membrana vitelina (A). Segure a membrana vitelina com extra fino ponta fórceps e delicadamente descascar-lo longe do embrião ao manipular o embrião diretamente na borda mais externa, se necessário(B). Remoção da membrana vitelina aumenta a clareza de estruturas embrionárias, embriões e permite a ser trabalhada ou processado com hibridação in situ (C). Barras de escala representam 1 ​​mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig3highres.jpg" /> Figura 3. Whole montagem de hibridização in situ realizada em embriões tentilhão developmentally expostos ao metilmercúrio. Padrões de expressão de orthodenticle homeobox 2 (OTX2) foram caracterizados em embriões expostos a 0,0 ppm metilmercúrio (A, A &#39;) e 2,4 ppm metilmercúrio (B, B &#39;) através da alimentação parental. O doRsal (A) e ventral (A &#39;) a expressão de OTX2 é visível em todas as vesículas do mesencéfalo e ópticas durante o estágio 12 22. Os embriões do grupo de tratamento foram dissecados no mesmo ponto de tempo, mas foram desenvolvimento retardado, como visto na dorsal (B) e vista ventral (B &#39;) das estruturas da cabeça, que são característicos da etapa 11 22 Abreviaturas:. mb, mesencéfalo; op, vesícula óptica. Barras de escala representam um milímetro. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig4highres.jpg" /> Figura 4. Whole montagem &#160; in situ &#160; hibridização realizada em embriões zebra passarinho developmentally expostos ao metilmercúrio. padrões de expressão de orthodenticle homeobox 2 (OTX2) foram caracterizados em fase 6 22 embry<html> OS expostas a 0,0 ppm de metilmercúrio (A, A &#39;) e fase 5 22 embriões expostos ao metil-mercúrio 2,4 ppm (B, B&#39;), através de dieta parental. Abreviaturas: AM, margem anterior da mesoderme; não, notocorda, mesoderme notocorda; po, proamnion, blastopore anterior; ps, linha primitiva 22. Barras de escala representam um milímetro. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5. Whole mount in situ &#160; hibridização realizada em embriões tentilhão usando sonda sentido. (A) Fase 5 22 embrião. (B) Fase inicial 6 22 embrião. (C) Stage 11 22 embrião. Barras de escala representam um milímetro. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg &quot;/&gt; Figura 6. EdU incorporação e de proteção em embriões de passarinho de zebra. Edu &quot;clique em&quot; química foi usado para detectar células em proliferação em um estágio embrionário 16 22 (A, B, C). EdU é incorporado no ADN em vez de timidina 26, 27 e é detectada através de clique química 27. A proliferação é claramente visível nas bordas laterais dos somitos e do tailbud. O painel A mostra a proliferação ocorre exclusivamente na parte posterior do embrião e também mostra as células proliferativas individuais. O painel B mostra os locais de proliferação em todo o embrião. O painel C mostra a região anterior, e mostra a telencéfalo altamente proliferativo (te) em maior detalhe. Abreviaturas: af, dobra amniótico; FLB, membro anterior botão; hlb, hindlimb botão; le, vesícula do cristalino; ms, mesencéfalo; mt, Metencéfalo; OPC, copo óptica; pa, arco da faringe; sm, mesoderme somite; tb, tailbud; te, telencéfalo. Barras de escala representam 1 ​​mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51596/51596fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/51596/51596fig7highres.jpg" /> Figura 7. Qualidade de RNA extraído de embriões dissecados zebra Finch. Controlo (0,0 ppm) e 1,2 ppm de metilmercúrio embriões foram dissecadas e rapidamente congelados como descrito no passo 3.8. Cada pista apresenta RNA extraído a partir de dois embriões homogeneizados de cada grupo de tratamento.

O tentilhão-zebra (Taeniopygiaguttata) é um organismo modelo valioso; no entanto, os estágios iniciais do desenvolvimento do tentilhão-zebra não foram extensivamente estudados. O protocolo descreve como dissecar embriões precoces para aplicações moleculares e de desenvolvimento.

Dissecção e Análise de Downstream da Zebra Finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) has become an increasingly important model organism in many areas of research including toxicology1,2, behavior3, and ...

O objetivo geral deste procedimento é dissecar embriões intactos de tentilhão-zebra em estágios embrionários muito precoces, para aplicações moleculares e de desenvolvimento subsequente. Isso é realizado primeiramente cortando o casco do ovo no sentido longitudinal e, cuidadosamente, esvaziando o conteúdo do ovo sobre papel WHE. Em seguida, localiza-se a zona de junção e o vitelo circundante é cortado, deixando o embrião intacto.Então, o embrião é transferido para uma placa de Petri e lavado antes de ser fixado ou congelado rapidamente para análises posteriores. Por fim, a membrana vitelina é removida do embrião fixado para aumentar a clareza das estruturas embrionárias. Em última instância, em C, a hibridização e o tratamento com EDU mostram, respectivamente, a expressão gênica e as células em proliferação nas fases iniciais do desenvolvimento embrionário do tentilhão-zebra em resposta ao tratamento com metilmercúrio.A principal vantagem desta técnica é que ela minimiza os danos ao tecido embrionário. Isso permite a investigação da morfologia e da expressão gênica em todas as fases do desenvolvimento. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na biologia comparativa do desenvolvimento e na toxicologia, como os efeitos de várias toxinas nas fases iniciais do desenvolvimento.A demonstração visual desta técnica é fundamental, pois localizar a junção zno e remover a membrana vilina durante a dissecação pode ser difícil, já que as estruturas embrionárias iniciais são frágeis e difíceis de observar. Após coletar os ovos de tentilhão-zebra e incubá-los conforme o protocolo descrito, monte os seguintes materiais para dissecação: um bisturi limpo, pinças de ponta fina, duas pinças de ponta extrafina, três pipetas de transferência, um XPBS e paraformaldeído 4%.Se você for fixar os embriões, coloque um pedaço de papel ondulado de 10 por 10 centímetros na base do microscópio estereoscópico para fornecer uma superfície limpa e não absorvente para a dissecação. Remova o ovo do incubador no momento desejado, conforme determinado pelo guia do tentilhão-zebra. Em seguida, utilizando uma lâmpada iluminadora de fibra óptica, examine o ovo com luz transmitida segurando-o ao longo de seu eixo vertical e iluminando seu interior com luz.Coloque a ponta da luz atrás do ovo e localize a gema e o embrião em desenvolvimento. Em seguida, posicione o bisturi no lado oposto à gema e, com pressão suave, corte ao longo do ovo do ápice até a base. Remova o conteúdo do ovo usando o polegar e o indicador para aplicar cuidadosamente pressão na extremidade do ápice da base do ovo, ou use pinças para abrir suavemente a casca do ovo ao longo do corte.Examine a gema em busca da zona branca de junção, que é visível como um anel branco tênue. Circunde o embrião em desenvolvimento e use pinças de ponta fina para orientar a gema de modo que o embrião fique localizado no centro, a fim de separar o embrião do tecido extraembrionário. Fure as bordas da gema para aliviar a pressão e faça cortes únicos ao longo do diâmetro da gema, paralelamente ao disco embrionário.Continue fazendo linhas diagonais até que a seção da gema com o embrião tenha sido separada com sucesso. Usando uma pipeta de transferência, remova as bordas da gema, deixando uma pequena quantidade para lubrificar o embrião no papel filtro, evitando que ele se rompa. Lave o disco embrionário colocando a ponta de uma pipeta de transferência com um XPBS ao lado dele em um ângulo de 45 graus voltado para a base do embrião e dispensando o tampão usando uma pequena quantidade de um XPBS.Transfira o embrião para uma pequena placa de Petri de plástico. Lave o embrião adicionando mais PBS à placa e gotejando PBS próximo ao embrião. Gire a placa para lavar e remover o vitelo residual.Em seguida, incline o recipiente para aspirar o tampão residual. Se for fixar o embrião para hibridização in loco imediatamente, adicione PFA a 4% para submergir o embrião, depois goteje o PFA diretamente sobre o embrião para achatá-lo e evitar que ele enrole. Incube por 12 horas a quatro graus Celsius após desidratar o embrião em uma série de metanol.Se o embrião estiver entre as fases um e oito, remova a membrana vitelínica, aderida ao embrião, utilizando pinças extrafinas para segurar as bordas da membrana que se estendem para além da zona de junção. Vire cuidadosamente o embrião várias vezes para remover os grânulos residuais de vitelo e soltar o disco embrionário da membrana vitelínica. Se uma lacuna não aparecer entre a zona de junção e a membrana vitelínica, use pinças de ponta extrafina para arranhar suavemente a zona de junção e soltá-la da membrana.Em seguida, segure a membrana vitelina e a borda periférica do disco embrionário na zona de junção e puxe suavemente a membrana vitelina para longe do embrião. Se for necessário congelar rapidamente o embrião após a dissecação, adicione dois a três mililitros de PBS 1X à placa de Petri e incline a placa para separar o embrião dos grânulos OK. Após remover o líquido e repetir a lavagem duas a três vezes, use pinças de ponta fina para transferir o embrião para um tubo de microcentrífuga previamente rotulado e congele rapidamente em nitrogênio líquido antes de armazenar a menos 80 graus Celsius.Para realizar o ensaio de proliferação celular por EDU utilizando a lâmpada do iluminador de fibra óptica, vela e ovo. Para localizar o embrião ou a gema, marque o lado do ovo oposto ao embrião ou à gema para garantir que o embrião não seja danificado durante a microinjeção. Em seguida, com massa de modelar, forre um recipiente plástico de 60 milímetros moldando-a em formato de tigela, para manter o ovo na orientação desejada.Ajuste a direção do ponto marcado para permitir a inserção da agulha de microinjeção. Após puxar duas agulhas capilares de vidro com ponta rombuda, uma para fazer um orifício no ovo e com óleo mineral ao contrário, carregue a segunda agulha e insira-a no microinjetor. Defina o volume de solução por injeção em 59,8 nanolitros no microinjetor e, em seguida, com a solução estoque de EDU a 10 milimolar, carregue a agulha de microinjeção utilizando a capilar de vidro com ponta rombuda para cuidadosamente perfurar um orifício na casca no ponto marcado, tomando cuidado para não quebrar a casca ou deixar cair pedaços dela na cavidade do ovo.Oriente o ovo de modo que o orifício fique em um ângulo de 45 graus, alinhado com a agulha de microinjeção a ser inserida. Em seguida, utilizando o micromanipulador, insira a agulha carregada aproximadamente um centímetro na cavidade e injete a quantidade desejada de solução EDU na gema ou no embrião. Imediatamente, use várias camadas de plástico para envolver o ovo e o suporte de argila, e fixe as bordas do envoltório com fita adesiva ao fundo do recipiente para evitar deslocamento durante a incubação.Incube o ovo a 37 graus Celsius sobre uma superfície estável até que o estágio desejado seja alcançado, antes de remover a película plástica e dissecar o embrião de acordo com o protocolo descrito no texto. Esta figura mostra uma hibridização NC dois em embriões dissecados e fixados expostos a doses baixas de metilmercúrio para detectar a expressão da caixa homeo orto idêntica. Como observado nas vistas dorsal e ventral das estruturas da cabeça, os embriões tratados apresentaram desenvolvimento mental retardado no estágio 11 em comparação com os embriões não tratados. No estágio 12, o grupo de quatro embriões mostrado à esquerda foi incubado pelo mesmo período de tempo.No entanto, os dois embriões não tratados na parte superior esquerda progrediram até a fase seis, enquanto os dois embriões tratados com mercúrio na parte inferior esquerda apenas progrediram até a fase cinco. Esses embriões foram tratados com uma sonda sense para demonstrar a ausência de coloração de fundo. Aqui são mostradas células em proliferação em um embrião do segundo dia, que foi injetado com EDU e então incubado durante a noite. A reação de química por clique revela proliferação nas bordas laterais dos somitos e na região da cauda, bem como no cefalono.Este gel contém amostras de RNA extraídas de embriões de tentilhão-zebra na fase 16 dissecados, não tratados ou tratados com 1,2 partes por milhão de cloreto de metilmercúrio, indicando que o método de dissecação demonstrado neste vídeo permite a extração de RNA de alta qualidade. A dissecação pode ser realizada em menos de um minuto, se realizada corretamente durante este procedimento. É importante examinar a gema em um ângulo para localizar o embrião, pois embriões jovens podem ser difíceis de observar após a realização deste procedimento.Outros métodos, como hibridização in situ, proliferação celular, ensaios e extração de RNA para análises qualitativas, podem ser realizados para responder perguntas adicionais em estudos de desenvolvimento e toxicológicos.

dissection-downstream-analysis-zebra-finch-embryos-at-early-stages

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usando Monte Whole In situ Hibridação a ligação de Biologia Molecular e Organísmicos

Processos de desenvolvimento, tais como a proliferação, a modelagem, diferenciação, e a orientação do axónio pode ser facilmente modelada na medula espinal do peixe-zebra. Neste artigo, nós descrevemos um procedimento de montagem para os embriões de peixe-zebra, que otimiza a visualização destes eventos.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

Time-lapse confocal de imagem é uma poderosa técnica útil para caracterizar o desenvolvimento embrionário. Aqui, descrevemos a metodologia e caracterizar morfogênese craniofacial no tipo selvagem, bem como PDGFRA, smad5, e SMO embriões mutantes.

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

O embrião de peixe-zebra é um excelente modelo para investigação em biologia do desenvolvimento. Durante a embriogênese, peixe-zebra desenvolver com uma massa de gema, que apresenta desafios tridimensionais para observação de amostras e análise. Este protocolo descreve como criar bidimensionais planas montagem preparações de toda montagem in situ (desejo) manchadas espécimes embrião de peixe-zebra.

Monte Preparação Plano de observação e análise de amostras de embriões Zebrafish manchado por inteiro Monte<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização

O método descrito aqui permite a análise de lapso de tempo de desenvolvimento de órgãos em embriões de peixe-zebra, usando um microscópio de dissecação de fluorescência capazes de realizar seccionamento óptico e estratégias simples de reajuste para corrigir desvio focal e planar.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

A mitose é crítica para todos os organismos vivos e os defeitos geralmente levam ao câncer e distúrbios do desenvolvimento. Usando este protocolo de imagem e o peixe-zebra como sistema modelo, os pesquisadores podem visualizar a mitose em um organismo vertebrado vivo e a infinidade de defeitos que surgem quando os processos mitóticos são defeituosos.

Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Aqui, apresentamos o protocolo para a cultura tecidual 3D do eixo corporal posterior do zebrafish, possibilitando o estudo ao vivo da segmentação de vertebrados. Este modelo de explant fornece controle sobre o alongamento do eixo, alteração de fontes de morfógeno e imagem viva de nível de tecido de resolução subcelular.

Uma cultura de explanta de cauda 3D para estudar segmentação de vertebrados em zebrafish

Uma estratégia de preparação de amostras para imagens de embriões iniciais de peixe-zebra dentro de um córion intacto usando um microscópio de folha de luz é descrita. Ele analisa as diferentes orientações que os embriões adquirem dentro do córion nos estágios de 70% de epibólia e gema e detalha estratégias de imagem para obter resolução em escala celular em todo o embrião usando o sistema de folha de luz.

Imagem de microscopia de folha de luz e estratégias de montagem para embriões iniciais de peixe-zebra

Aprenda a dissecar embriões de mandarim-da-índia (Taeniopygia guttata) em estágios iniciais com mínimo dano tecidual. Este método preserva a integridade embrionária para análises morfológicas, expressão gênica e estudos toxicológicos.

Dissecção e Análise de Downstream da Zebra Finch embriões em estágios iniciais de desenvolvimento

Explorar mais vídeos