Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

O objetivo geral deste procedimento é extrair veneno e dissecar glândulas de veneno de aranhas para estudos transcriptômicos e proteômicos, o que é realizado primeiramente preparando os equipamentos e reagentes necessários para coletar o veneno por estimulação elétrica. O segundo passo é imobilizar uma aranha anestesiada com pinça sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, aplica-se um pulso de corrente elétrica à aranha e o veneno liberado é coletado com um tubo capilar microscópico.

O passo final é dissecar as glândulas de veneno da aranha dois a três dias depois. Em última análise, a espectrometria de massas ou outras análises proteômicas do veneno são utilizadas para revelar as sequências das proteínas constituintes do veneno. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de coleta do veneno são difíceis de aprender, já que envolvem uma sequência de ações coordenadas que devem ser realizadas rapidamente, mas com cuidado.

Para começar, conecte o cabo de alimentação de um estimulador elétrico a uma tomada e conecte o pedal externo à entrada de sinal externo. Em seguida, certifique-se de que o interruptor de polaridade esteja no modo normal e conecte o eletrodo positivo ao terminal de saída vermelho no estimulador elétrico e o eletrodo negativo ao terminal de saída preto. Depois, configure o estimulador nas seguintes configurações iniciais recomendadas.

Teste a saída do eletrodo conectando clipes de jacaré aos terminais positivo e negativo do voltímetro. Em seguida, ligue o interruptor de energia do estimulador e aplique a corrente com o pedal. Prepare a pinça leve revestindo uma ponta com plástico líquido e aguarde quatro horas para que o revestimento seque; após o plástico secar, enrole firmemente 15 milímetros da ponta oposta da AP com uma única camada de linha de algodão para costura e fixe a linha amarrando a extremidade em um nó.

Em seguida, utilizando tesoura afiada, corte a ponta de uma agulha hipodérmica romba, pequena o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para evitar entupimentos. Alise a abertura com lixa e conecte a agulha a um coletor de resíduos a vácuo. Em seguida, posicione a pinça de peso extremamente leve na posição horizontal, firmemente fechada, usando um grampo bivalve revestido de vinil fixado a uma base magnética sob o campo de visão do microscópio estereoscópico, com a ponta revestida de plástico na parte superior e a ponta revestida com fio na parte inferior.

Em seguida, conecte uma garra do eletrodo positivo ao pino inferior a montante do fio e conecte uma garra negativa à agulha metálica romba de vácuo. Depois, coloque o cabo positivo no pino da pinça entre o fio e a garra de jacaré e o cabo negativo na agulha romba de vácuo. Para testar a corrente do circuito do voltímetro, pressione o pedal do pé para garantir que uma corrente suficiente seja detectada e remova os cabos usando proteção ocular.

Prepare vários tubos capilares microscópicos para a coleta de veneno. Em seguida, coloque uma tira de massa de fixação em uma placa de Petri e apoie os capilares microscópicos sobre a tira. Com uma das mãos, usando luva, segure um único tubo capilar microscópico por uma das extremidades e segure a outra extremidade com pinças metálicas estéreis sobre a chama de um bico de Bunsen; puxe a extremidade da chama para criar uma ponta alongada, mantendo a outra extremidade em posição fixa. Examine as extremidades dos capilares microscópicos ao microscópio estereoscópico e crie uma pequena abertura biselada na extremidade alongada utilizando pinças metálicas esterilizadas.

Feche os tubos e coloque-os sobre gelo. Para iniciar a imobilização da aranha, ligue o gás da câmara de CO2. Em seguida, transfira a aranha com pinças metálicas longas do frasco plástico fechado para a câmara de CO2.

Mantenha a aranha na câmara por cinco a 10 minutos e verifique se ela não está mais se movendo, empurrando-a suavemente com pinças longas. Em seguida, use uma pipeta de transferência com solução salina para umedecer o fio na pinça.

Em seguida, retire a aranha anestesiada da câmara de CO2 pegando-a pelas patas anteriores. Usando pinças de dissecação rombudas e as mãos com luvas, transfira a aranha anestesiada para o aparelho de pinças leves. Em seguida, separe as pontas das pinças leves fechadas e posicione o tórax cefálico da aranha entre as pontas.

Permita que as pontas se fechem completamente para garantir que a aranha seja mantida firmemente no lugar, sem ser esmagada. Em seguida, assegure-se rapidamente de que a aranha esteja posicionada com o dorso do carapaço voltado para baixo, apoiado na ponta revestida com fio, e que seu lado ventral esteja voltado para o revestimento plástico, enquanto o eletrodo positivo permanece preso à ponta inferior. Ajuste, então, o aumento, o foco do microscópio estereoscópico e a fonte de luz até que as quelíceras e as presas da aranha sejam claramente visíveis. Para iniciar a coleta do veneno, ligue o vácuo e pulverize a colheita da aranha com água.

Usando uma segunda agulha de seringa de ponta romba, aspire a água com uma agulha de vácuo para remover impurezas. Em seguida, encoste a agulha de vácuo, conectada ao eletrodo negativo, no rostro do aranha e aplique um pulso com o pedal do pé. As pernas da aranha contrairão e o veneno será visível como gotículas transparentes emergindo das presas.

Remova o regurgitado com vácuo, se necessário. Em seguida, colete as gotículas de veneno com a ponta de uma micropipeta e transfira a ponta para um tubo de 0,5 mililitro contendo água, que será sugada para dentro da micropipeta. Evite perfurar a aranha com a micropipeta e a contaminação da micropipeta com seda e cola provenientes das fiandeiras.

Em seguida, acople a seringa de transferência com o adaptador de tubo ao microcapilar na extremidade oposta à ponta de coleta e reabra a solução de veneno no tubo, colocando o tubo sobre gelo; armazene os tubos contendo veneno a menos 80 graus Celsius. Ao finalizar, após concluir a coleta do veneno, posicione um frasco plástico aberto de coleta juntamente com sua tampa próximo à aranha. Para transferência rápida, segure cuidadosamente as pernas da aranha com pinças anatômicas rombas seguradas em uma das mãos e abra cuidadosamente as pinças leves com a outra mão.

Em seguida, deslize a aranha para o frasco de coleta com pinça de ponta romba. E feche rapidamente a tampa. Dois a três dias após a coleta do veneno, anestesie a aranha em uma câmara de CO2, depois encha um recipiente com nitrogênio líquido e coloque-o próximo a um microscópio estereoscópico. Limpe a área de dissecação e a pinça com RNA away.

Em seguida, preencha um pequeno recipiente de Petri com um x de cloreto de sódio salino, e coloque-o sob o microscópio estereoscópico. A seguir, transfira a aranha da câmara de CO2 para o recipiente de Petri e use pinças para separar rapidamente o tórax cefálico do abdômen. Em seguida, segure o tórax cefálico sob o microscópio estereoscópico com pinças e posicione a colônia no campo de visão.

Use as pontas afiadas de um segundo par de pinças para cortar a cutícula que une o carapá aos aspectos laterais do cólise lateralmente. Segure o cólise com o segundo par de pinças e puxe suavemente para frente e para trás até que as glândulas de veneno sejam extraídas. Faça isso em não mais de 15 minutos.

Sequencie as glândulas da colônia e transfira-as para um tubo criogênico seguro de 0,5 mililitro. Coloque o tubo fechado em nitrogênio líquido, integrando técnicas de espectrometria de massas com bancos de dados de sequências gerados a partir do CD NA da glândula de veneno. As bibliotecas permitiram a identificação de proteínas do veneno. O peptídeo laro inepto foi uma das 36 proteínas identificadas do veneno da viúva-negra utilizando espectrometria de massas.

Não se esqueça de que trabalhar com aranhas como a viúva-negra pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.