Name: Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a extrair veneno de aranhas por estimulação elétrica e dissecar glândulas de veneno para estudos proteômicos e de transcriptoma. Este método permite análises de espectrometria de massa e pesquisa de expressão gênica.

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Agradeço às seguintes pessoas por sua ajuda no desenvolvimento deste protocolo: Chuck Kristensen, Greta Binford, Alex K. Lancaster, Konrad Zinsmaier e Mays Imad. Dados de espectrometria de massa e proteômica foram adquiridas pelo Consórcio Proteômica Arizona apoiada por NIEHS concessão ES06694 ao SWEHSC, NIH / NCI concessão CA023074 ao AZCC e pelo Instituto BIO5 da Universidade do Arizona. O financiamento para este trabalho foi fornecido a partir do National Institutes of Health (Instituto Nacional de Medicina Geral) de subvenções 1F32GM83661-01 e 1R15GM097714-01 para Jessica E. Garb.

1. Preparação da Electro-estimulador Aparelho <ol><li> Conecte o cabo de alimentação eletro-estimulador para a saída e anexar pedal externo para a entrada de sinal externo. Nota: Fios elétricos devem estar bem isolados e atual entregar metal exposto não deve ser tocado. Usar luvas de látex ou borracha nitrílica para proteção. Interruptor de alimentação eletro-estimulador deve estar na posição OFF quando anexar cabo de alimentação e ligar os fios. </li><li> Conecte eletrodo positivo para o terminal de saída vermelho em eletro-estimulador (quando a chave de polaridade está no modo normal) e conectar o eletrodo negativo para o terminal de saída de preto. Nota: Cada fio de eletrodo deve terminar em um jacaré. </li><li> Definir estimulador para as seguintes configurações iniciais recomendadas: Tensão = 7 V, frequência = 1 pulsos por segundo, atraso = 0 milissegundos, duração = 200 milissegundos, pulsos gêmeos mudar = regular, e interruptor mode = off. </li><li> A saída do teste de eletrodos, anexando as garras jacaré voltmeTer pontas de prova positivos e negativos. Ligue o interruptor estimulador e fornecer corrente com pedal. </li></ol> 2. Preparação de imobilizatórias Fórceps e Outros Materiais <ol><li> Mergulhe um pino de fórceps pluma em revestimento plástico líquido e esperar quatro horas para deixar o revestimento seco. Enrole firmemente 15 milímetros da ponta do dente adversária com uma única camada de linhas de costura de algodão, e garantir fio amarrando o fim em um nó. Nota: O fio é utilizado para absorver uma solução salina aplicada que promove a condutividade eléctrica, enquanto o revestimento de plástico proporciona isolamento para retardar a corrente. </li><li> Cortar ponta da agulha hipodérmica sem corte com uma tesoura afiada e suavizar a abertura com papel de areia. Coloque a agulha para uma armadilha resíduos de vácuo (por exemplo, balão de filtração a vácuo) através de tubos. Nota: A agulha vai aspirar a água e afastado regurgitar, e servirá para completar o circuito criado pelos eléctrodos do estimulador. A mu abertura agulhast ser pequeno o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para solução de vácuo sem obstruir (por exemplo, 25 G x 1 ½ no medidor, consulte Lista de Materiais). </li><li> Fórceps posição pluma horizontalmente em uma posição bem fechado com uma braçadeira dupla coberta de vinil preso a uma base magnética ou aparelho estande fixo sob campo de um microscópio de dissecação de vista, com revestimento de plástico pino de fórceps no topo e linha revestido pinos na parte inferior. Nota: A braçadeira de duas pontas é mantido numa posição estacionária para a base magnética por um suporte de fixação (ver Lista de Materiais). Uma banda de borracha pode ser firmemente fixado em torno pontas das pinças pluma, ao lado de suporte da braçadeira, para adicionar uma pressão adicional para manter a pinça pluma numa posição fechada em torno da aranha, uma vez introduzida. </li><li> Anexar positivo clipe jacaré eletrodo de ponta inferior &#39;fórceps a montante da linha e anexar jacaré negativo para diminuir agulha vácuo metal. </li&gt; <li> Circuito de teste atual com voltímetro, colocando liderança positiva sobre fórceps pino entre o fio ea garra jacaré e colocando liderança negativa na agulha vácuo sem corte. Pressione o pedal para garantir corrente suficiente é detectado e remover leads se corrente suficiente é detectado. </li><li> Prepare vários tubos microcapilares para coleta de veneno. Segurar um único tubo microcapilar em uma extremidade com uma mão enluvada e na outra extremidade com uma pinça de metal estéreis, colocando a extremidade fórceps mantidos horizontalmente ao longo de um queimador de chama de Bunsen. Puxe a microcapilar com a pinça de metal longe da chama para criar uma ponta alongada, enquanto segura a outra extremidade em uma posição estacionária. Nota: usar óculos de proteção como microcapilares pode facilmente fratura. </li><li> Descanse microcapilares preparados em uma tira de massa de montagem em uma placa de Petri. Examine microcapilar termina sob um microscópio de dissecação e criar uma abertura pequena, chanfrado na extremidade puxado com uma pinça de metal esterilizados. </li><li> Lanúmero variável de bel estéreis 0,5 ml tubos. Adicionar água estéril, desionizada estéril para tubos (por exemplo, 5 ul de água desionizada autoclavada). Fechar os tubos e colocar os tubos no gelo. </li><li> Preparar a solução salina numa proveta e preencher um segundo copo com água autoclavada. </li></ol> 3. Imobilização de Aranha em Fórceps <ol><li> Ligue CO 2 tanque e transferir aranha de plástico recolhendo frasco fechado (veja a lista de materiais) em CO 2 câmara usando uma pinça de metal longos. Nota: aranhas viúva-negra tem veneno perigoso; sempre usar luvas durante este protocolo. </li><li> Mantenha aranha na câmara de 5-10 min ou até anestesiado e não se mover quando gentilmente cutucou com uma pinça longa. Use pipeta de transferência para molhar rosca na pinça com solução salina. Nota: Para obter diretrizes sobre CO 2 parâmetros de anestesia para viúvas negras, consulte Spagna e Moore 19. </li><li> Recuperar aranha anestesiado de CO 2câmara por pegá-la pelas suas pernas anteriores usando uma pinça de dissecação contundentes e as mãos enluvadas. Mova aranha anestesiados a pluma aparelho fórceps. Dentes separados de fórceps pluma fechadas e coloque cefalotórax da aranha entre os dentes e permitir que os dentes para fechar fechada para garantir a aranha é mantido firmemente no lugar, mas não está sendo esmagado. Certifique-se de que a aranha é colocado lado carapaça dorso para baixo (ver Foelix 20 para guia de anatomia aranha), descansando em fio revestido pinos, e no lado ventral da carapaça de frente para o revestimento de plástico, enquanto o eletrodo positivo permanece ligado ao pino de fundo. Trabalhe rapidamente ao manusear aranha. </li><li> Ajuste dissecando ampliação do microscópio, foco e fonte de luz até quelíceras de aranha e as presas são claramente visíveis. </li></ol> 4. Venom coleção <ol><li> Ligue vácuo e spray quelíceras aranha com solução de água usando um segundo sem corte da seringa needle. Sucção fora a água com agulha de vácuo para remover as impurezas. </li><li> Toque na agulha de vácuo com eletrodo negativo ligado à tribuna aranha e entregar pulso com pedal uma ou mais vezes. Vacuum longe regurgitar, se necessário. Nota: tribuna aranha é dentro da boca para posterior quelíceras na superfície dorsal entre quelíceras e endites (ver Foelix 20 para anatomia aranha detalhada). Nota: A cada pulso, pernas contrato de aranha, e veneno será visível como gotículas claras emergentes de presas. </li><li> Colete veneno gotas com ponta microcapilar e transferência de ponta capilar em tubo 0,5 ml com água ou solução tampão (solução será sugado para capilar). Nota: evitar a perfuração de aranha com capilar que pode levar à contaminação hemolinfa e morte. Também evitar a contaminação do capilar com seda e cola das fiandeiras. </li><li> Anexar transferência seringa com adaptador tubo para microcapilar (pelo lado oposto à ponta coleção) e dsolução de veneno ispense de volta para dentro do tubo. Colocar o tubo em gelo. Nota: Descarte de capilares de resíduos em um recipiente para objectos cortantes nas proximidades. </li><li> Coloque aberto plástico coleta frasco, juntamente com a sua tampa, perto da aranha. Segure cuidadosamente as pernas de aranha com uma pinça de dissecação sem corte realizado em uma das mãos e dos penas cuidadosamente aberto forceps dentes com a outra mão, deslizando aranha em recolher frasco com uma pinça sem corte e fechar rapidamente cap. Continue com a próxima aranha e armazenar contendo veneno de tubos em freezer -80 ° C quando terminar. Nota: continuar a exercer cuidado ao mover a aranha das pinças para dentro do frasco. Certifique-se o frasco de coleta e boné é perto para a aranha para a sua transferência rápida e usar luvas. </li></ol> 5. Venom Gland dissecções <ol><li> Dois a três dias após a colheita veneno, anestesiar aranha em CO 2 câmara (veja o passo 3.1). Preencha transportador de nitrogênio líquido e coloque ao lado do microscópio de dissecação. Nota: when trabalhar com nitrogênio líquido, proteção ocular e uso luvas criogênicas. </li><li> Área de dissecção limpo e dissecando fórceps com uma solução que elimina RNase e DNA contaminação. Encha uma pequena placa de Petri sob microscópio de dissecação com dissecando tampão (por exemplo, citrato de sódio salino-1x (SSC) buffer). </li><li> Transferência de aranha a partir de CO 2 câmara a placa de petri e utilize uma pinça para separar rapidamente o cefalotórax do abdômen. </li><li> Segure o cefalotórax sob o microscópio de dissecação com uma pinça e posicionar o quelíceras em campo de visão. Use as pontas afiadas de um segundo par de pinças para cortar cutícula juntar a carapaça para os aspectos laterais do quelíceras. Lateralmente apreender o quelíceras usando o segundo par de fórceps, e gentilmente puxar para trás e para frente até glândulas de veneno são puxados para fora. </li><li> Glândulas separado do quelíceras (ou deixe ligados a quelíceras se desejado) e transferir para um tubo cyrosafe 0,5 ml. Coloque clostubo ed em nitrogênio líquido. Nota: cada dissecção não deve demorar mais do que 15 min. </li><li> Repita dissecção com aranhas adicionais até terminar. Tubos de transferência de nitrogênio líquido em freezer -80 ° C. </li></ol>

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</ol>

O autor não tem nada a divulgar e sem interesses financeiros concorrentes.

Venenos representam uma fonte importante de proteínas fisiologicamente reactivos, peptídeos e outras moléculas com aplicações para a descoberta de medicamentos, bem como para a pesquisa de aspectos fundamentais celular e ecológico 1-3. No entanto, a coleta de veneno, principalmente de animais perigosos ou pequenos, é uma tarefa desafiadora. Este protocolo demonstra como veneno e veneno de glândulas podem ser coletadas de aranhas viúva-negra, e confirma o sucesso desta abordagem através de uma combinação de análise mudpit do veneno e um banco de dados de proteínas derivadas de cDNAs clonados a partir de veneno de glândulas 21. Embora este protocolo funciona bem para as viúvas negras e médio porte, as aranhas têm sido empregadas outras técnicas de coleta de veneno para maior migalomorfas aranhas (tarântula-like), como a aspiração direta do veneno das presas em vidro pipetas por exemplo, 24. Esta última abordagem, no entanto , não vai funcionar bem para as aranhas de menor porte que não são aggressive. Um aspecto especialmente crítico do protocolo de coleta de veneno aqui descrito é a fase inicial de preparação e otimização do processo de coleta para que se torne mais rotineira, consistente e mais rápido. O protocolo é inicialmente difícil de dominar, mas com tentativas repetidas, torna-se mais fácil e mais rápido. Atenção também é impelida em todas as fases críticas que envolvem a manipulação de aranhas perigosas, a utilização de corrente eléctrica, de ponta fina de vidro micro-capilares, e agulhas de seringa. É importante usar equipamentos de proteção individual apropriado, como luvas de borracha nitrílica, um jaleco, calças compridas e sapatos fechados, assim como óculos de moldar micro capilares. Outro aspecto desafiante para recolha de veneno é a pequena quantidade de veneno produzido por qualquer uma aranha, particularmente espécies Latrodectus, a partir do qual as quantidades recolhidas podem ser liMITED para 1-2 microlitros por indivíduo na melhor das hipóteses. A obtenção de veneno suficiente para aplicações a jusante, tais como géis de proteína ou ensaios funcionais podem exigir a combinação de veneno de várias pessoas em um tubo. Nesses casos, o veneno só deve ser combinada de indivíduos do mesmo sexo, estágio ontogenético e população dado o reconhecimento da variabilidade intersexual, desenvolvimento e geográfica em alguns venenos de 25, 26. Aranhas também podem apresentar uma variação considerável na quantidade de veneno produzido entre os indivíduos, onde poucas quantidades podem refletir a recente destruição da glândula. Assim, pode ser conveniente proceder à recolha de veneno de vários dias após a sua última alimentação. Se pouco veneno é libertado, corrente excessiva não devem aplicado à aranha, o que pode causar a ruptura da cutícula, que conduz à contaminação do veneno com hemolinfa ou morte. A contaminação das amostras de veneno com si aranhalk ou humanos fontes também devem ser evitados através da utilização de material estéril ou limpo. Apesar destes desafios, coleção de puro veneno, deixando a aranha viva, é preferível a métodos que obtêm veneno de homogeneizados glândula (que não se separam componentes do veneno de outras proteínas celulares) e matar a aranha. É também crítico para assegurar que as amostras são rapidamente congeladas para prevenir a degradação de proteína. A extração de veneno promove a produção de veneno posterior, estimulando a expressão de genes de veneno na glândula de veneno. Assim, porque este protocolo permite aranhas para sobreviver depleção veneno, suas glândulas podem ser dissecados vários dias mais tarde (matando a aranha) num ponto em que a expressão do gene veneno se espera que seja suficiente para estudos genéticos, tais como clonagem de transcrição 10,11. Várias precauções importantes também devem ser levados em dissecções de glândulas de veneno. A ênfase deve ser colocada sobre o uso do laboratório de equipament e reagentes que são livres de RNases que degradam RNA. Assim, recomenda-se limpe fórceps e outro equipamento não descartável e superfícies com soluções que eliminam RNase e contaminação de ADN. As dissecções deve ser realizado tão rapidamente quanto possível e directamente congeladas para garantir ainda mais a integridade de ARN do tecido. Finalmente, dissecções só deve ser realizado em aranhas anestesiados, após a sua cefalotórax e abdômen são separadas rapidamente. Em conclusão, este artigo fornece um protocolo verificado para obter veneno de aranha e veneno de glândulas. Venom e glândulas de veneno para permitir o isolamento e caracterização de proteínas e de péptidos seus componentes, utilizando abordagens de proteómica e transcriptomic. Além disso, as amostras de veneno pode representar o ponto de ensaios funcionais, os quais determinam o potencial farmacológico biomédica e das suas moléculas constituintes de partida. Quase todas as aranhas produzem veneno, ea grande mergulhadorsidade de componentes do veneno sintetizados por espécies individuais sugere uma vasta diversidade de moléculas de veneno estão ainda a ser descoberto 13. Assim, este protocolo fornece ferramentas para investigar a rica fonte de moléculas biologicamente ativos presentes em venenos de aranha.

Venenos são secreções animais predominantemente injetadas em outro animal para efeitos de predação ou defesa, e também tem aplicações biológicas importantes com relevância biomédica 1-3. Apenas certos animais sintetizar veneno, mas sua produção é taxonomicamente difundida através invertebrados (por exemplo, cnidários, caracóis cone, escorpiões e aranhas) e vertebrados (eg, cobras, alguns peixes e mamíferos), porque ela evoluiu independentemente várias vezes 1,4 . A caracterização bioquímica de venenos tipicamente mostram que eles são constituídos por uma grande variedade de proteínas e péptidos, que em grande parte actuar sobre os sistemas circulatório e nervoso de animais injectados para entregar rapidamente toxinas constituintes 1. Uma pequena fração dos animais peçonhentos podem representar uma ameaça para os seres humanos, em particular as espécies com distribuições sinantrópicos 5. O estudo da composição do veneno e atividades funcionais tem desempenhado um papel importante naa caracterização funcional dos componentes celulares de vertebrados (especialmente canais iônicos neuronais) 6 e na elucidação dos processos celulares fundamentais (por exemplo neurosecreção) 7. Além disso, selecione peptídeos do veneno ter propriedades úteis em contextos biomédicos, incluindo seus usos como tratamentos para o câncer e dor 8,9, e são minados para candidatos leads de drogas e desenvolvimento antiveneno. Venenos também desempenham papéis importantes na ecológico e evolutivo pesquisa 1,4,10,11, assim, a coleta dessas secreções perigosos tem muitas utilidades. Há&gt; 40.000 espécies descritas de aranha (Araneae da ordem), e todos, mas uma das mais de 100 famílias de aranhas possuem glândulas de veneno emparelhados que terminam em presas 12. A alta diversidade de espécies de aranhas sugere que eles representam o maior clade de organismos peçonhentos. No entanto, a caracterização bioquímica de venenos de aranha tem largely concentrada num pequeno número de espécies mais frequentemente associados com o envenenamento humano. Estudos de proteômica e transcriptomic recentes de venenos de aranha indicam que eles normalmente contêm muitas proteínas e peptídeos únicos 2,13,14. Advances in high-throughput sequenciação de ADNc e de espectrometria de massa dos péptidos fingerprinting facilitou enormemente a descoberta destas proteínas do veneno 15. No entanto, esse trabalho começa com a coleta de veneno suficiente e / ou glândulas de veneno das aranhas e documentação detalhada para tais técnicas são poucos 16. Este trabalho apresenta um protocolo para a recolha de veneno e veneno de glândulas de aranhas viúva-negra, que pode ser aplicado às aranhas de tamanho similar. A recolha de veneno separadamente a partir das glândulas permite a identificação de proteínas que são segregadas para o veneno em oposição às proteínas que executam outras funções celulares. As viúvas negras e outra Lespécies atrodectus são amplamente reconhecidos como estando entre as aranhas mais perigosas devido ao seu veneno altamente neurotóxico, o que provoca dor severa em humanos, o que às vezes é acompanhada de sudorese profusa, contrações musculares, hipertensão arterial, dificuldade respiratória e paralisia desigual 5. O protocolo de coleta de veneno aqui apresentada utiliza electro-estimulação de fornecer corrente elétrica para aranhas anestesiados para provocar contrações musculares e liberação de veneno. Gotas de veneno são rapidamente recolhidos com micro-capilares e em tubos para armazenamento congelador. Como o protocolo envolve procedimentos perigosos, que só deve ser realizado por indivíduos bem treinados e cautela é instado a passos fundamentais. O veneno coletado tem inúmeras utilizações, como a caracterização e isolamento de moléculas constituintes 2, para experimentos fisiológicos ou ensaios funcionais 18, e estimular a expressão do gene veneno 11. O protocolo termina com uma description de dissecção glândula de veneno e preservação útil para a clonagem de genes específicos de veneno, a expressão de que foi demonstrado que ocorrem 2-3 dias seguintes depleção veneno em diferentes aranhas 10,11.

<table><tbody><tr><td>Estimulador de nervos e músculos (eletroestimulador)&nbsp;</td>Voltímetro <td>http://www.grasstechnologies.com/products/stimulators/stimsd9.html</td><td>SD9</td> <td>da Grass Technologies</td></tr><tr><td></td><td>RadioShack</td><td>22-223</td><td>qualquer voltímetro/multímetro genérico pode ser substituído</td></tr><tr><td>Pinça Featherweight Pontiaguda</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td></td></tr><tr><td>Plasti Dip</td><td>Performix</td><td></td><td>Disponível na Ace Hardware</td></tr><tr><td>25 G x 1&#189; em Precision Glide agulha de seringa hipodérmica</td><td>BD Medical</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de filtro de vácuo 1 L</td><td>Nalgene</td><td>DS4101-1000</td><td>tamanhos de frasco menores também podem funcionar</td></tr><tr><td>Buchner Funil de duas peças, 90 mm</td><td>Nalgene</td><td>4280-0900</td><td></td></tr><tr><td>5 &#956; l Furos Capilares (Micro capilares)</td><td>VWR</td><td>53508-375</td><td></td></tr><tr><td>Tira de massa de montagem&nbsp;</td><td>Loctite</td><td></td><td>Disponível na Ace Hardware</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pinça Extra-Longa de Uso Geral Comprimento: 11-13/16 in.</td><td>Fisher</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>SSC Buffer, 20x (pH 7,0), Molecular Grade</td><td>Promega</td><td>V4261</td><td>pode ser feito de produtos químicos de estoque (150 mM NaCl, 15 mM de citrato de sódio)</td></tr><tr><td>Eppendorf safe-lock tubes 0,5 ml tubos (criogênico seguro)</td><td>Eppendorf</td><td>22363611</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Dewar, 1 L, HDPE, frasco de bancada de nitrogênio líquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>4150-1000</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>VWR</td><td>53225-514</td><td></td></tr><tr><td>pinças ultrafinas (pinças de dissecação)</td> <td>EMS</td><td>78310-0</td><td>pinças de ponta fina de alta qualidade semelhantes podem ser substituídas</td></tr><tr><td>Pedal / pedal</td><td>Linemaster Switch Corp.</td><td>491-S</td><td></td></tr><tr><td>Grampo de extensão de duas pontas, com mangas revestidas a vinil, 8,5 polegadas</td><td>VWR</td><td>21570-007</td><td>modelos semelhantes podem ser substituídos</td></tr><tr><td>Suporte de grampo</td><td>VWR</td><td>89084-746</td><td>modelos semelhantes podem ser substituídos, deve acomodar o diâmetro da haste do grampo de extensão</td></tr><tr><td>Base magnética (segura o grampo de extensão através do suporte do grampo)</td> <td>VWR</td><td>300042-270</td><td>aparelho semelhante capaz de segurar com segurança a braçadeira de extensão na posição fixa pode ser substituído por</td></tr><tr><td>frascos coletores de plástico (grande / 40 dram)</td> <td>Bioquip</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>Linha de costura de algodão</td><td>Joann tecido e loja de artesanato</td><td>7245855</td><td>produto similar pode ser substituído</td></tr></tbody></table>

extração de venom e venom gland microdissecações de aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

Extraction of Venom and Venom Gland Microdissections from Spiders for Proteomic and Transcriptomic Analyses

Venenos de secreções são quimicamente complexas que compreendem tipicamente numerosas proteínas e péptidos com as actividades fisiológicas variadas. Caracterização funcional de proteínas do veneno tem aplicações biomédicas importantes, incluindo a identificação de leads de drogas ou sondas para receptores celulares. As aranhas são os mais ricos em espécies do clado organismos venenosos, mas os venenos de apenas algumas espécies são bem-entendido, em parte devido à dificuldade associada com a coleta de pequenas quantidades de veneno de animais de pequeno porte. Este trabalho apresenta um protocolo para a coleta de veneno de aranhas, usando estimulação elétrica, o que demonstra o procedimento no viúva negra ocidental (hesperus Latrodectus). O veneno coletado é útil para análises jusante variadas, incluindo a identificação direta proteína através de espectrometria de massa, testes funcionais, e estimulação da expressão do gene veneno para estudos transcriptomic. Esta técnica tem a vantagem sobre os protocolos que isoveneno tarde a partir de homogenatos de glândulas integrais, que não se separam componentes do veneno genuínos de proteínas celulares que não são secretadas como parte do veneno. Os resultados representativos demonstrar a detecção de peptídeos do veneno conhecido da amostra coletada, utilizando espectrometria de massa. O procedimento de recolha de veneno é seguido por um protocolo para dissecar glândula de veneno de aranha, com resultados demonstrando que isto conduz à caracterização de proteínas e péptidos expressos-venom ao nível da sequência.

A coleção de veneno e glândula de veneno dissecções são realizados com freqüência para caracterizar proteínas do veneno e peptídeos no nível seqüência 10,11,15. Recolhidas veneno também podem ser utilizados em ensaios fisiológicos para determinar as suas actividades funcionais 18. A recolha de veneno irá estimular a expressão do gene glândula de veneno, facilitando, assim, a clonagem de transcritos específicos de toxina através de RT-PCR 10,11. Identificação de proteínas do veneno também pode ser conseguida de uma maneira de alto rendimento, integrando técnicas de espectrometria de massa padrão com bases de dados de sequências geradas a partir de bibliotecas de cDNA da glândula de veneno 15,21. Um exemplo deste tipo de trabalho, a partir de veneno de glândulas e recolhidos utilizando o protocolo detalhado acima, demonstrando a sua eficácia, é ilustrada na Figura 1. Venom coletadas de L. fêmeas adultas hesperus foi digerida com tripsina e sujeita a uma solução deAnálise mudpit, que liga HPLC (cromatografia líquida de alto desempenho) a espectrometria de massa em tandem (MS / MS). Aqui, a análise mudpit foi realizada pela Universidade do Arizona Proteomics Consortium. Massas de peptídeos detectados e seus fragmentos dissociados (íons filha, inferidas a partir de espectros) foram comparadas com sequências de peptídeos teoricamente previstos a partir de traduções de seqüências de DNA obtidos a partir de uma biblioteca de expressão de genes construídos a partir de L. hesperus glândulas de veneno (glândulas foram adquiridos pelo protocolo de dissecação descrito acima) 21. Nesta experiência, 36 proteínas foram detectadas a partir de todos os espectros recolhidos, no limiar de probabilidade de 99,9%, e continha pelo menos um péptido detectado. Uma das proteínas detectadas é suportado por 43 espectros total (espectros exemplar mostrada na Figura 1A), correspondente a três peptídeos exclusivos, cobrindo 35% da sequência da proteína (Figura 1B). A proteína detectada (traduzido a partir de um collecte<html> d cDNA) tem um hit BLASTp cima para latrodectin de L. tredecimguttatus (número de acesso GenBank P49125.1), com uma pontuação de e-2e-46, e partes de 80% de identidade ao nível da sequência de aminoácidos com a proteína detectado nesta experiência. Latrodectin, que é também conhecida como proteína de baixo peso molecular, alfa-latrotoxina, é um componente do veneno reconhecido de viúva negra aranhas 22, 23, a verificação da eficácia do protocolo apresentado. Algumas proteínas identificadas a partir do veneno correspondem a sequências para as quais não hit BLAST é encontrado. Não está claro se tal resultado é devido aos recursos limitados disponíveis para genômicas aranhas, bem como a informação funcional limitada de suas proteínas, ou porque a proteína desconhecida representa um contaminante veneno. No entanto, a expressão do gene ou proteína analisa examinando a abundância de uma nova proteína, tais glândulas de veneno em relação a outros tecidos deveria revelar se se trata de um componente do veneno genuína. ent &quot;fo: manter-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51618/51618fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: peptídeo Latrodectin identificados a partir de veneno de viúva negra usando espectrometria de massa (A) espectros Representante (um de 43) detectado via MS / MS porção de análise mudpit de L.. hesperus veneno que foi atribuído a tradução predita de uma sequência de cDNA mostrada na parte recolhido B. Spectra mostra razão massa por carga (m / z) de iões filha detectados no eixo horizontal produzido por fragmentação de péptido progenitor (CGEEDFGEEIVK), com as letras no topo indicando a sequência de péptido com base em massas de iões filha. (B) Sequência de proteína para a qual os espectros na parte A foi atribuído, mostrando em vermelho, negrito e sublinhado texto correspondente sequência de espectros a mostrada na parte A, texto vermelho adicional (não negrito) representa um outro péptido nesta proteína detectada com outro sp recolhidoectra. A sequência proteica é traduzido a partir de uma sequência de cDNA obtido a partir de glândulas de veneno dissecados.

Este artigo fornece um protocolo para a extração de veneno de aranhas, usando estimulação elétrica, a fim de 1) realizar a caracterização proteômica, 2) estimular a expressão de genes da glândula de veneno, e 3) realizar estudos funcionais de venenos. Isto é seguido por uma descrição de microdissecações glândula de veneno para estudos de expressão gênica.

Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

Venoms are chemically complex secretions typically comprising numerous proteins and peptides with varied physiological activities. Functional ...

O objetivo geral deste procedimento é extrair veneno e dissecar glândulas de veneno de aranhas para estudos transcriptômicos e proteômicos, o que é realizado primeiramente preparando os equipamentos e reagentes necessários para coletar o veneno por estimulação elétrica. O segundo passo é imobilizar uma aranha anestesiada com pinça sob um microscópio estereoscópico. Em seguida, aplica-se um pulso de corrente elétrica à aranha e o veneno liberado é coletado com um tubo capilar microscópico.O passo final é dissecar as glândulas de veneno da aranha dois a três dias depois. Em última análise, a espectrometria de massas ou outras análises proteômicas do veneno são utilizadas para revelar as sequências das proteínas constituintes do veneno. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de coleta do veneno são difíceis de aprender, já que envolvem uma sequência de ações coordenadas que devem ser realizadas rapidamente, mas com cuidado.Para começar, conecte o cabo de alimentação de um estimulador elétrico a uma tomada e conecte o pedal externo à entrada de sinal externo. Em seguida, certifique-se de que o interruptor de polaridade esteja no modo normal e conecte o eletrodo positivo ao terminal de saída vermelho no estimulador elétrico e o eletrodo negativo ao terminal de saída preto. Depois, configure o estimulador nas seguintes configurações iniciais recomendadas.Teste a saída do eletrodo conectando clipes de jacaré aos terminais positivo e negativo do voltímetro. Em seguida, ligue o interruptor de energia do estimulador e aplique a corrente com o pedal. Prepare a pinça leve revestindo uma ponta com plástico líquido e aguarde quatro horas para que o revestimento seque; após o plástico secar, enrole firmemente 15 milímetros da ponta oposta da AP com uma única camada de linha de algodão para costura e fixe a linha amarrando a extremidade em um nó.Em seguida, utilizando tesoura afiada, corte a ponta de uma agulha hipodérmica romba, pequena o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para evitar entupimentos. Alise a abertura com lixa e conecte a agulha a um coletor de resíduos a vácuo. Em seguida, posicione a pinça de peso extremamente leve na posição horizontal, firmemente fechada, usando um grampo bivalve revestido de vinil fixado a uma base magnética sob o campo de visão do microscópio estereoscópico, com a ponta revestida de plástico na parte superior e a ponta revestida com fio na parte inferior.Em seguida, conecte uma garra do eletrodo positivo ao pino inferior a montante do fio e conecte uma garra negativa à agulha metálica romba de vácuo. Depois, coloque o cabo positivo no pino da pinça entre o fio e a garra de jacaré e o cabo negativo na agulha romba de vácuo. Para testar a corrente do circuito do voltímetro, pressione o pedal do pé para garantir que uma corrente suficiente seja detectada e remova os cabos usando proteção ocular.Prepare vários tubos capilares microscópicos para a coleta de veneno. Em seguida, coloque uma tira de massa de fixação em uma placa de Petri e apoie os capilares microscópicos sobre a tira. Com uma das mãos, usando luva, segure um único tubo capilar microscópico por uma das extremidades e segure a outra extremidade com pinças metálicas estéreis sobre a chama de um bico de Bunsen; puxe a extremidade da chama para criar uma ponta alongada, mantendo a outra extremidade em posição fixa. Examine as extremidades dos capilares microscópicos ao microscópio estereoscópico e crie uma pequena abertura biselada na extremidade alongada utilizando pinças metálicas esterilizadas.Feche os tubos e coloque-os sobre gelo. Para iniciar a imobilização da aranha, ligue o gás da câmara de CO2. Em seguida, transfira a aranha com pinças metálicas longas do frasco plástico fechado para a câmara de CO2.Mantenha a aranha na câmara por cinco a 10 minutos e verifique se ela não está mais se movendo, empurrando-a suavemente com pinças longas. Em seguida, use uma pipeta de transferência com solução salina para umedecer o fio na pinça.Em seguida, retire a aranha anestesiada da câmara de CO2 pegando-a pelas patas anteriores. Usando pinças de dissecação rombudas e as mãos com luvas, transfira a aranha anestesiada para o aparelho de pinças leves. Em seguida, separe as pontas das pinças leves fechadas e posicione o tórax cefálico da aranha entre as pontas.Permita que as pontas se fechem completamente para garantir que a aranha seja mantida firmemente no lugar, sem ser esmagada. Em seguida, assegure-se rapidamente de que a aranha esteja posicionada com o dorso do carapaço voltado para baixo, apoiado na ponta revestida com fio, e que seu lado ventral esteja voltado para o revestimento plástico, enquanto o eletrodo positivo permanece preso à ponta inferior. Ajuste, então, o aumento, o foco do microscópio estereoscópico e a fonte de luz até que as quelíceras e as presas da aranha sejam claramente visíveis. Para iniciar a coleta do veneno, ligue o vácuo e pulverize a colheita da aranha com água.Usando uma segunda agulha de seringa de ponta romba, aspire a água com uma agulha de vácuo para remover impurezas. Em seguida, encoste a agulha de vácuo, conectada ao eletrodo negativo, no rostro do aranha e aplique um pulso com o pedal do pé. As pernas da aranha contrairão e o veneno será visível como gotículas transparentes emergindo das presas.Remova o regurgitado com vácuo, se necessário. Em seguida, colete as gotículas de veneno com a ponta de uma micropipeta e transfira a ponta para um tubo de 0,5 mililitro contendo água, que será sugada para dentro da micropipeta. Evite perfurar a aranha com a micropipeta e a contaminação da micropipeta com seda e cola provenientes das fiandeiras.Em seguida, acople a seringa de transferência com o adaptador de tubo ao microcapilar na extremidade oposta à ponta de coleta e reabra a solução de veneno no tubo, colocando o tubo sobre gelo; armazene os tubos contendo veneno a menos 80 graus Celsius. Ao finalizar, após concluir a coleta do veneno, posicione um frasco plástico aberto de coleta juntamente com sua tampa próximo à aranha. Para transferência rápida, segure cuidadosamente as pernas da aranha com pinças anatômicas rombas seguradas em uma das mãos e abra cuidadosamente as pinças leves com a outra mão.Em seguida, deslize a aranha para o frasco de coleta com pinça de ponta romba. E feche rapidamente a tampa. Dois a três dias após a coleta do veneno, anestesie a aranha em uma câmara de CO2, depois encha um recipiente com nitrogênio líquido e coloque-o próximo a um microscópio estereoscópico. Limpe a área de dissecação e a pinça com RNA away.Em seguida, preencha um pequeno recipiente de Petri com um x de cloreto de sódio salino, e coloque-o sob o microscópio estereoscópico. A seguir, transfira a aranha da câmara de CO2 para o recipiente de Petri e use pinças para separar rapidamente o tórax cefálico do abdômen. Em seguida, segure o tórax cefálico sob o microscópio estereoscópico com pinças e posicione a colônia no campo de visão.Use as pontas afiadas de um segundo par de pin&ccedil;as para cortar a cut&iacute;cula que une o carap&aacute; aos aspectos laterais do c&oacute;lise lateralmente. Segure o c&oacute;lise com o segundo par de pin&ccedil;as e puxe suavemente para frente e para tr&aacute;s at&eacute; que as gl&acirc;ndulas de veneno sejam extra&iacute;das. Fa&ccedil;a isso em n&atilde;o mais de 15 minutos.Sequencie as glândulas da colônia e transfira-as para um tubo criogênico seguro de 0,5 mililitro. Coloque o tubo fechado em nitrogênio líquido, integrando técnicas de espectrometria de massas com bancos de dados de sequências gerados a partir do CD NA da glândula de veneno. As bibliotecas permitiram a identificação de proteínas do veneno. O peptídeo laro inepto foi uma das 36 proteínas identificadas do veneno da viúva-negra utilizando espectrometria de massas.Não se esqueça de que trabalhar com aranhas como a viúva-negra pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas de proteção, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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