Extração de Venom e Venom Gland microdissecações de Aranhas para proteômica e análise do transcriptoma

O objetivo geral deste procedimento é extrair veneno e dissecar glândulas de veneno de aranhas para estudos transcriptômicos e proteômicos, isso é feito primeiro preparando o equipamento e os reagentes necessários para coletar o veneno por estimulação elétrica. O segundo passo é imobilizar uma aranha anestesiada com fórceps sob um microscópio de dissecação. Em seguida, a aranha é pulsada com corrente e o veneno liberado é coletado com um tubo microcapilar.

A etapa final é dissecar as glândulas de veneno da aranha dois a três dias depois. Em última análise, a espectrometria de massa ou outras análises proteômicas do veneno são usadas para mostrar as sequências das proteínas constituintes do veneno. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de coleta do veneno são difíceis de aprender porque envolvem uma sequência de ações coordenadas que devem ser executadas rapidamente, mas com cuidado.

Para começar, conecte um cabo de alimentação do eletroestimulador a uma tomada e conecte o pedal externo a uma entrada de sinal externo. Em seguida, certifique-se de que a chave de polaridade esteja no modo normal e conecte o eletrodo positivo ao terminal de saída vermelho no eletroestimulador e conecte o eletrodo negativo ao terminal de saída preto. Em seguida, defina o estimulador para as seguintes configurações iniciais recomendadas.

Teste a saída do eletrodo conectando garras jacaré aos cabos de teste do voltímetro positivo e negativo. Em seguida, ligue o interruptor de alimentação do estimulador e forneça corrente com o pedal. Prepare a pinça leve revestindo um pino com plástico líquido e espere quatro horas para que o revestimento seque depois que o plástico secar bem embrulhado 15 milímetros da ponta do pino oposto AP com uma única camada de linha de costura de algodão e prenda a linha amarrando a ponta com um nó.

Em seguida, usando uma tesoura afiada, corte a ponta de uma agulha hipodérmica romba, pequena o suficiente para não prejudicar a aranha, mas grande o suficiente para evitar entupimento. Alise a abertura com uma lixa e prenda a agulha a uma armadilha de resíduos a vácuo. Em seguida, posicione a pinça de peso pena horizontalmente em uma posição bem fechada usando uma pinça de duas pontas coberta de vinil presa a uma base magnética sob o campo de visão de um microscópio de dissecação com o pino revestido de plástico na parte superior e o pino revestido de rosca na parte inferior.

Em seguida, prenda um clipe jacaré de eletrodo positivo no pino inferior a montante da linha e prenda um clipe jacaré negativo na agulha de vácuo de metal romba. Em seguida, coloque o fio positivo no pino da pinça entre a linha e o clipe jacaré e o fio negativo na agulha de vácuo sem corte. Para testar a corrente do circuito do voltímetro

Prepare vários tubos microcapilares para coleta de veneno. Em seguida, coloque uma tira de massa de montagem em uma placa de Petri e descanse os microcapilares na tira. Com uma mão enluvada, segure um único tubo microcapilar em uma extremidade e segure a outra extremidade com uma pinça de metal estéril sobre uma chama de bico de bunsen e puxe a extremidade para longe da chama para criar uma ponta alongada enquanto segura a outra extremidade em uma posição estacionária, examine as extremidades microcapilares sob um microscópio de dissecação e crie uma pequena abertura chanfrada na extremidade puxada com pinça de metal esterilizada.

Feche os tubos e coloque-os no gelo. Para iniciar a imobilização da aranha, ligue o gás da câmara de CO2. Em seguida, transfira a aranha com uma pinça de metal longa do frasco coletor de plástico fechado para a câmara de CO2.

Mantenha a aranha na câmara por cinco a 10 minutos e verifique se a aranha não está mais se movendo. Cutucando-o suavemente com uma pinça longa. Em seguida, use uma pipeta de transferência com solução salina para molhar a linha na pinça.

Em seguida, recupere a aranha anestesiada da câmara de CO2, pegando-a pelas pernas anteriores. Usando uma pinça de dissecação romba e as mãos enluvadas, mova a aranha anestesiada para o aparelho de pinça peso-pena. Em seguida, separe as pontas da pinça peso-pena fechada e coloque o thax cefálico da aranha entre as pontas.

Deixe os pinos fecharem para garantir que a aranha seja mantida firmemente no lugar, mas não esteja sendo esmagada Certifique-se rapidamente de que a aranha seja colocada com o dorso do cárcere voltado para baixo, apoiado no pino revestido com rosca, e o lado ventral do carro esteja voltado para o revestimento de plástico enquanto o eletrodo positivo permanece preso ao pino inferior. Em seguida, ajuste o foco de ampliação do microscópio de dissecação e a fonte de luz até que as aranhas e as presas estejam claramente visíveis. Para iniciar a coleta de veneno, ligue o aspirador e borrife a mina de carvão com água.

Usando uma segunda agulha de seringa de ponta romba, aspire a água com uma agulha de vácuo para remover as impurezas. Em seguida, toque a agulha de vácuo com o eletrodo negativo no rostro da aranha e forneça um pulso com o pedal. As pernas da aranha se contrairão e o veneno será visível como gotículas claras emergindo das presas.

Aspire e regurgite, se necessário. Em seguida, colete as gotículas de veneno com a ponta microcapilar e transfira a ponta capilar para um tubo de 0,5 mililitro com água, que será sugado para dentro do capilar. Evite perfurar a aranha com o capilar e contaminar o capilar com seda e cola dos pintos.

Em seguida, conecte a seringa de transferência com adaptador de tubo ao microcapilar na extremidade oposta à ponta de coleta e dispense a solução de veneno de volta no tubo e coloque o tubo no gelo armazene o veneno contendo tubos a 80 graus Celsius negativos. Quando terminar, quando terminar de coletar veneno, coloque um frasco coletor de plástico aberto junto com sua tampa perto da aranha. Para uma transferência rápida, segure cuidadosamente as pernas da aranha com uma pinça de dissecação sem corte segurada em uma mão e abra cuidadosamente a pinça de penas com a outra mão.

Em seguida, deslize a aranha para dentro do frasco coletor com uma pinça romba. E feche rapidamente a tampa dois a três dias após a coleta do veneno, anestesie a aranha em uma câmara de CO2, encha um transportador de nitrogênio líquido e coloque-o ao lado de um microscópio de dissecação. Limpe a área de dissecção e a pinça com RNA.

Em seguida, encha uma pequena placa de Petri com um citrato de sódio salino e coloque-a sob o microscópio de dissecação. Em seguida, transfira a aranha da câmara de CO2 para a placa de Petri e use uma pinça para separar rapidamente o táx cefálico do abdômen. Em seguida, segure o táx cefálico sob o microscópio de dissecação com uma pinça e posicione a mina de carvão no campo de visão.

Use as pontas afiadas de um segundo par de pinças para cortar a cutícula que une a carabase aos aspectos laterais da mina de carvão lateralmente. Segure a mina de carvão com o segundo par de pinças e puxe suavemente para frente e para trás até que as glândulas de veneno sejam retiradas. Não levando mais de 15 minutos.

Separe as glândulas da mina de carvão e transfira-as para um tubo criogênico de 0,5 mililitro. Colocar o tubo fechado em nitrogênio líquido, integrando técnicas de espectrometria de massas com bancos de dados de sequências geradas a partir da glândula de veneno CD NA. As bibliotecas permitiram a identificação de proteínas do veneno. O peptídeo inepto Laro foi uma das 36 proteínas identificadas a partir do veneno da viúva negra usando espectrometria de massa.

Não se esqueça de que trabalhar com aranhas como viúvas negras pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas de proteção devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.