Name: Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar colangiócitos extra-hepáticos de camundongos neonatos usando dissecação meticulosa e crescimento em géis de colágeno espesso. Este método permite obter populações puras para estudos de biologia do ducto biliar.

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Os autores agradecem à Patologia Molecular e Imagem Núcleo do Centro de NIDDK UPenn para estudos moleculares em Doenças Digestivas e do Fígado (P30 DK50306) para assistência com imagens. Este trabalho foi financiado por concessões do National Institutes of Health (R01 DK-092111) e do Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (para RGW) e por uma bolsa da Liver Disease Research e Rede de Educação Infantil (a SK).

Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado de outra forma. Todo o trabalho animal deve ser realizado em condições humanas no âmbito de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional locais Animal Care e Use (IACUC). 1. Preparação de equipamentos e soluções <ol><li> Configure mesa cirúrgica o mouse em estreita proximidade com a capa de cultura de tecidos e incubadora (Figura 1A). Nota: Equipamento necessário inclui um microscópio de dissecação, uma fonte de luz, 12,5 cm de comprimento tesoura de íris reta, pinça curva de 6 polegadas não serrilhadas com pontas finas e 4 de polegada de fórceps serrilhados, com ponta curva (Figura 1B). </li><li> Coloque instrumentos esterilizados em um copo de vidro de 70% de álcool na mesa cirúrgica. </li><li> Preencha três estéreis 60 milímetros placas de Petri com meios de isolamento estéril (Tabela 1); colocar dois na mesa cirúrgica e um no capô, tudo em gelo. </li><li> Coloque rato colágeno cauda,estéril 10x tampão fosfato salino (PBS), água estéril, estéril NaOH 1 N e biliar de células epiteliais (BEC) mídia (Tabela 1) na capa de cultura de tecidos. Nota: O colagénio deve ser em gelo. </li></ol> 2. Colagoga Isolamento e Cultura <ol><li> Eutanásia ratos neonatal entre 0-3 dias de vida, por exposição ao dióxido de carbono até inconsciente, seguido por deslocamento cervical, por diretrizes IACUC (Figura 1C). Nota: ratos mais velhos podem ser usados, dependendo das necessidades específicas experimental. </li><li> Coloque o animal em decúbito dorsal e fazer uma pequena incisão horizontal cruzando a linha média na região da pelve. Estender esta incisão lateral e os dois lados do abdômen, formando uma ponta em forma de U. Vire aba para cima para expor os órgãos abdominais. Uma vez que o abdômen é aberto, mover cuidadosamente os intestinos para fora da cavidade abdominal para o lado direito do animal para melhor visualização do ducto hepático e biliar comum. Nota: pode ser necessário prolongar os cortes laterais para a caixa torácica para obter uma melhor identificação do fígado. </li><li> Utilizando o microscópio de dissecação, identificar o ducto biliar comum, fígado e intestinos. Identificar o ducto biliar comum em primeiro lugar (Figura 1D), utilizando-se cautela, pois as estruturas são muito delicadas. Com a pinça serrilhadas dentadas e não, meticulosamente limpo e apanhar o tecido conjuntivo, incluindo a gordura em torno do bile. Use uma pinça para segurar a conduta e o outro para limpar. </li><li> Use uma técnica similar para limpar a vesícula biliar. </li><li> Coloque os dutos limpos e vesícula biliar para o primeiro prato de meios de isolamento no gelo. Massageie suavemente as estruturas com a pinça não serrilhadas enquanto nos meios de comunicação para remover mais tecido conjuntivo e remover bile da vesícula biliar. </li><li> Transferência de dutos e da vesícula biliar para o segundo prato de meios de isolamento. </li><li> Após o isolamento de dutos e vesículas biliares de 5 animais, transferir opeças para a terceira placa de Petri, no bairro. Nota: Se as células são para ser isolado a partir de mais de 5 animais, fazer em lotes, usando soluções frescas para cada grupo de 5 animais. </li><li> Prepare géis de colágeno grossas na capa de cultura de tecidos: Nota: todos os tamanhos do prato podem ser utilizados. Uma placa de cultura de 60 milímetros, com um volume final de 3 mL de colagénio para cada grupo de 5 recém-nascidos funciona bem. Isto deve ser preparado fresco, no momento de incorporação de condutas isoladas de fresco. <ol><li> Coloque colagénio de cauda de rato, estéril de 10x tampão fosfato salino (PBS 10x), dH 2 O estéril e estéril de NaOH 1 N em gelo. </li><li> Calcular as quantidades de dH 2 0, 10x PBS, NaOH, e colagénio necessária para géis com uma concentração final de colagénio de 2 mg / mL em 1x PBS, utilizando um volume de NaOH a 1 N igual a 0,023 vezes o volume de colagénio adicional. Nota: Se é usada fonte alternativa de colágeno, siga as instruções do fabricante para a neutralização e formação de gel. </li><li> Misture dH 2 0, 10x PBS, e NaOH 1 N, em seguida, adicionar o colagénio e pipeta bem para assegurar uma mistura uniforme. </li></ol></li><li> Depois solução de colagénio engrossou para um gel de consistência semelhante à temperatura ambiente, imediatamente inserir as condutas do colagénio. </li><li> Colocar na incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 minutos para permitir que o colagénio para solidificar. </li><li> Depois de gel ter solidificado (a cor muda de transparente para branco), sobreposição com 3,5 ml de meio de BEC (Tabela 1) e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Remova a mídia BEC 3 vezes por semana e substituir com 3,5 ml de mídia fresco. </li></ol> 3. Isolando primárias cholangiocytes de Thick Colágeno Gel Nota: dentro de 3 semanas, folhas de cholangiocytes (células com núcleos grandes estender diretamente de dutos embutidos) será visível no colágeno de espessura. Se houver um grande número de fibroblastos no prato, ele deve ser descartado. Se algumas regiões do prato temde crescimento de fibroblastos, estes podem ser cortados com um bisturi e removido antes da divisão das cholangiocytes. <ol><li> Prepare géis finas de colágeno: <ol><li> Dilui-se o colagénio a uma concentração de 1 mg / ml com PBS estéril. Nota: utilizar 1 ml para placa de 100 mm; ajustar em conformidade para outros pratos de tamanho. </li><li> Espalhe a solução de colágeno de forma uniforme com um espalhador de celular (pratos grandes) ou ponta de pipeta (pequenos pratos), deixe em temperatura ambiente por 10 min. </li><li> Espelho com DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min. </li><li> Retire a placa da incubadora e lave com 1x PBS. Imediatamente a aspirar 1x PBS. </li><li> Revestimento com uma segunda camada de colagénio finas, espalhando por rotação da placa de colocação ou de placa num agitador. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 10 min. </li><li> Depois de colagénio tenha solidificado, a placa de cobertura com DMEM/F12 e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 30 min. </li></ol></li><li> Dividir células a partir de diagéis de colágeno ick: <ol><li> Com uma espátula de cultura de células ou um raspador de células, raspar gel de colagénio suavemente a placa a fim de que ele está a flutuar. </li><li> Preparar a solução de colagenase diluindo XI Tipo de colagenase (ver lista de materiais) para 10 mg / ml com meio DMEM/F12. Misturar bem e filtro estéril. </li><li> Adicionar 1 ml de solução de colagenase (acima) por 60 milímetros prato de células no colagénio de espessura. Não remova a mídia BEC (que deve ser de 3 ml). Incubar prato durante 30 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Remover solução contendo as células, e coloque no tubo de 15 ml. </li><li> Gire para baixo a 2.200 xg por 5 min. Desprezar o sobrenadante e re suspender pellet em volume similar de DMEM/F12. </li><li> Rotação solução novamente a 2.200 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 3 ml de 0,5% de tripsina e incubação a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min. Após a incubação, pipetar a solução para cima e para baixo para quebrar as folhas de cholangiocytes. Adicionar 5 ml de BEC mídia umasolução de spin ª a 1.500 xg por 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em DMEM/F12, em seguida girar a solução 1.500 xg durante 5 min. </li><li> Remover o sobrenadante e re suspender pellet em mídia BEC (Tabela 1). Células placa na feitas anteriormente géis de colágeno finas. </li></ol></li></ol> 4. Passage e Armazenamento de Células Nota: as células em géis de colagénio finas pode ser dividido conforme necessário. <ol><li> Lavar as placas com PBS estéril, antes da incubação em 0,25% de tripsina, a 37 ° C durante 10-15 min. </li><li> Neutraliza-se com um volume igual de meio de BEC, e sedimentar a 1500 x g durante 5 min. Lavar pelete com DMEM/F12, então sedimentar a 1500 x g durante 5 min. </li><li> Ressuspender as células em meios BEC para a distribuição de colágeno revestido placas de cultura de células. Observação: Como alternativa, as células podem ser novamente suspensas em meios de armazenamento e armazenado num congelador a -80 ° C ou azoto líquido (Quadro 1). </li></ol>

<ol><li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lab.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li>
<li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li>
<li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Liver%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li>
<li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li>
<li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+bile+ducts%3A+Essentials+for+the+clinical+hepatologist%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li>
<li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes%2C+periportal+hepatocytes%2C+and+adult+liver+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li>
<li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li>
<li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li>
<li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium%3A+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

Descrito aqui é uma técnica para isolar cholangiocytes puros das vias biliares extra-hepáticas de ratos de ratos de todas as idades, incluindo recém-nascidos. A técnica oferece a vantagem de que cholangiocytes extra-hepáticas podem ser estudadas separadamente cholangiocytes intra-hepática, e pode facilitar a estudos para identificar as principais diferenças entre estas populações de células. Publicamos recentemente um estudo demonstrando diminuição cílios em cholangiocytes extra-hepáticos isolados por este método e infe...

A origem eo desenvolvimento da intra e extra-hepáticos cholangiocytes são marcadamente diferentes. O fígado se desenvolve a partir de um divertículo do intestino anterior endoderme ventral 5. A região caudal do divertículo forma a árvore biliar extra-hepática, enquanto que a região craniana gera a árvore biliar intra-hepática 5. Cholangiocytes duto intra-hepática são derivadas de células progenitoras em torno da placa ductal nas regiões peri portal 6. Estas células têm a capacidade de se diferenciar em qualquer hepatócitos ou cholangiocytes 6. Isto tem implicações clínicas significativas, dado que cholangiopathies podem objetivar especificamente uma categoria de cholangiocytes. Por exemplo, atresia biliar afeta inicialmente os ductos extra-hepáticos do recém-nascido, enquanto a Síndrome de Alagille afeta ductos intra-hepáticos. Há várias descrições do isolamento de cholangiocytes intra e unidades biliares de camundongos e ratos. Emvestigators isolaram células individuais pelo isolamento do duto e conseqüência subseqüente, ou por digestão do fígado e do anticorpo puxar para baixo de cholangiocytes expressam marcadores de superfície celular específicos 1-4. Unidades biliares funcionais e polarizadas foram isoladas por digestão do fígado e tamanho filtração 7. Unidades de ductos biliares são capazes de responder a estímulos secretora e demonstram a secreção de fluido 7, ao passo que cholangiocytes isolados têm sido mostrados para desenvolver estruturas ductulares in vitro 1,2. Limitações destes métodos incluem a necessidade de conhecimento técnico especializado e equipamento especial para perfusão de fígado com enzimas digestivas. Além disso, existe o risco de contaminação com células mesenquimais 3. Um método para isolar extra-hepáticos cholangiocytes do ducto biliar, especificamente a partir das vias biliares extra-hepáticos neonatal, não foi anteriormente descrito. Este artigo descreve uma técnica simplificada para isolar um neonatalé bem como as células dos ductos biliares extra-hepáticos adultos em altos níveis de pureza. Esta técnica irá facilitar o estudo das diferenças entre cholangiocytes e pesquisas sobre mecanismos de doenças como atresia biliar que envolvem os ductos extra-hepáticos e extra-hepáticos intra.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td></td><td>FBS Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>MEM com aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Insulina-transferrina-selênio</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Concentrado lipídico quimicamente definido</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, usado em meio BEC e 500 &#956; l no isolamento</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0,2 ml, usado em meio BEC e 500 &#956; l no isolamento</td></tr><tr><td>Etanolamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0,13 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>MEM solução vitamínica</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Inibidor de tripsina de soja</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, usado em meio BEC. O solvente é PBS, misture a 5 mg / ml de concentração estoque</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Extrato de hipófise bovina</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1,1 ml, usado em meio BEC</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0,5 ml, usado em meio BEC, Stock conc 393 &# 956; g/ml diluir com etanol</td></tr><tr><td>3 3',5-triiodo-L-tironina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0,5 ml, usado em meio BEC, Estoque conc 3,4 mg/ml diluído com etanol</td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0,5 ml, usado em meio BEC, 25 &#956; g/ml diluir com DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml, utilizado em meio BEC, utilizar na concentração estoque de 0,411 mg/ml e diluir com DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, utilizado em meio BEC e 500 &#956; l no isolamento</td></tr><tr><td>Colágeno de cauda de rato</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variável dependendo da concentração de colágeno</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>uso em 10x, esterlina, usada para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração</td></tr><tr><td>de colágeno dH2O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>estéril, usado para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração de colágeno</td></tr><tr><td>NaOH 10</td><td>N Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Diluir a 1 N, estéril, usado para fazer colágeno, a quantidade usada depende da concentração de colágeno</td></tr><tr><td>colagenase tipo XI de Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>diluir em DMEM e filtro estéril antes de usar</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (1x) 0,25%</td> <td>Gibco / Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incubar max 10 min</td></tr><tr><td>tripsina-EDTA (10x) 0,5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubar no máximo 10 min</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Outros modelos aceitáveis</td></tr><tr><td>Fonte de luz (iluminador de fibra óptica)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Outros modelos aceitáveis</td></tr><tr><td>Tesoura de íris reta de 12,5 cm</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Outros modelos aceitáveis</td></tr><tr><td>Pinça curva não serrilhada de 6" com pontas finas</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td></td><td>Outros modelos aceitáveis</td></tr><tr><td>4" pinça de aço inoxidável serrilhada com pontas finas</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td></td><td>Outros modelos aceitáveis</td></tr></tbody></table>

isolamento de neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Os ductos biliares intra e extra-hepáticos do fígado são developmentally distinta, e podem ser diferencialmente afectada por certas doenças. No entanto, as diferenças entre intra e extra-hepáticos cholangiocytes, e entre as células recém-nascidos e adultos, não são bem compreendidos. Os métodos para o isolamento de cholangiocytes de ductos biliares são bem estabelecida 1-4. Isolamento de células ductais extra-hepáticos, particularmente a partir do neonato, ainda não foi descrito, embora este seria de grande benefício para a compreensão das diferenças entre as populações distintas cholangiocyte e no estudo de doenças tais como a atresia biliar que aparecem para atingir os canais extra-hepáticos. Descrito aqui é uma técnica otimizada para isolar as células dos ductos biliares extra-hepáticas, tanto neonatal e adulto do rato. Esta técnica produz uma população de células pura com contaminação mínima entre as células mesenquimais como fibroblastos. Este metodod é baseado na remoção dos ductos extra-hepáticos e da vesícula biliar, seguida por dissecação meticulosa e raspagem para remover as camadas de gordura e de fibroblastos. As estruturas são incorporados em camadas de espessura de colagénio e cultivadas durante aproximadamente 3 semanas para permitir o crescimento de cholangiocytes em monocamadas, que pode, então, ser tratadas com tripsina e re-plaqueadas para o uso experimental.

A utilização destes resultados do protocolo para o isolamento de uma população de rato cholangiocytes extra-hepáticos neonatais com uma pureza excelente, como demonstrado por coloração de imunofluorescência K19 (Figuras 2A e 2B); se conseguir resultados semelhantes isolamento de células a partir de ratinhos adultos. Temos observado que leva 3 semanas para as células dos ductos biliares recém-isoladas para formar monocamadas em géis de colágeno de espessura. Os cholangiocytes crescer de forma linear ao l...

Uma técnica para isolar cholangiocytes das vias biliares extra-hepáticos de ratos neonatais é descrito. As condutas são meticulosamente dissecados, e, em seguida, as células são isoladas por crescimento em géis de colagénio espessas. Este método fornece uma ferramenta útil para estudar o desenvolvimento do ducto biliar extra-hepática e patologia.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e cultivar colangiócitos extra-hepáticos de neurônios neonatais. Isso é realizado primeiramente expondo cirurgicamente os órgãos abdominais para permitir o acesso ao fígado e aos ductos biliares. O segundo passo do procedimento consiste em remover meticulosamente o tecido conjuntivo e as gorduras que envolvem os ductos biliares e a vesícula biliar.Os ductos biliares e a vesícula biliar limpos são então colocados sobre géis espessos de colágeno e cultivados por três semanas. Os colangiócitos migrarão dos ductos e serão repicados para géis finos de colágeno para cultivo adicional. Em última análise, os resultados mostram monocamadas de colangiócitos puros por meio de microscopia de imunofluorescência.Em geral, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades devido a problemas técnicos com a técnica de dissecação, bem como com a limpeza dos pequenos ductos biliares. Para este procedimento, monte uma mesa cirúrgica para camundongo próxima à cabine de cultura de tecidos e ao incubador. Coloque todas as ferramentas cirúrgicas esterilizadas em um béquer contendo etanol a 70%.Coloque três placas de 60 milímetros com meio de cultura sobre gelo. Duas placas são necessárias na mesa cirúrgica, mas mantenha os outros materiais na câmara de fluxo laminar. O colágeno deve ficar sobre gelo.Inicie colocando um camundongo neonato eutanasiado, com idade entre zero e três dias, em posição supina sobre a placa de dissecação. Faça um pequeno corte horizontal ao longo da linha média, próximo à pelve. Estenda o corte em ambas as direções, formando uma aba em formato de U e exponha os órgãos.Agora, desloque cuidadosamente os intestinos para o lado direito do abdômen. Para visualizar o fígado e o ducto biliar, estenda as incisões na pele para ampliar a aba, se necessário. Sob o microscópio de dissecação, identifique e limpe cuidadosamente o ducto biliar comum.Remova o tecido conjuntivo e a gordura ao redor. Em seguida, repita o mesmo procedimento. Para limpar a vesícula biliar, retire o ducto biliar e a vesícula biliar e coloque-os em um dos recipientes preparados ali.Massageie as estruturas usando pin&ccedil;as n&atilde;o graduadas para remover mais tecido conjuntivo e expelir a bile. Em seguida, transfira os tecidos limpos para o segundo recipiente. Repita este procedimento at&eacute; que o tecido seja coletado de exatamente cinco neonatos.Comece preparando um gel de colágeno espesso. Sempre prepare isso fresco inicialmente. Reúna todas as soluções esterilizadas em gelo.Calcule os volumes necessários para dois miligramas de colágeno por mililitro de um XPBS. Adicione 0,023 partes de hidróxido de sódio a cada parte de colágeno. Misture as alíquotas juntas à temperatura ambiente por pipetagem.É essencial misturar o hidróxido de sódio em PBS e água destilada antes de adicionar o colágeno. O estoque de colágeno deve ser o último componente adicionado ao gel, e a solução final precisa ser pipetada. Isso evita que o colágeno forme aglomerados.Quando a solução começar a apresentar uma consistência semelhante à de um gel, imediatamente incorpore os tecidos isolados e, em seguida, transfira os tecidos incorporados para a estufa durante 30 minutos para solidificação. Após a solidificação, recubra o gel com 3,5 mililitros de meio BEC e continue a incubação. Troque o meio BEC três vezes por semana. Em até três semanas, formar-se-ão lâminas de células com núcleos grandes estendendo-se a partir dos ductos incorporados.Estas são as colangiócitos. Se a placa apresentar uma população significativa de fibroblastos, a menos que possam ser removidos, a placa deve ser descartada. Agora, prepare géis finos de colágeno com um miligrama de colágeno por mililitro de PBS, recubra um mililitro em uma placa de 100 milímetros e espalhe o colágeno uniformemente, aguardando 10 minutos.Após 10 minutos, cubra a placa com sete mililitros de DM EMF 12 e incube por 10 minutos. Após a breve incubação, lave rapidamente o colágeno com um XPBS. Remova todo o PBS por aspiração e, em seguida, adicione uma segunda camada de colágeno da mesma forma que foi feito para montar a primeira camada.Uma vez solidificado, cubra a placa com DMF 12 e incube por 30 minutos. Agora, separe as células dos géis espessos. Primeiro, usando uma espátula ou raspador, desprenda suavemente o colágeno da placa para que ele fique flutuando.Em seguida, prepare uma solução filtrada de colagenase e adicione um mililitro a cada placa de 60 milímetros com colágeno espesso. Em seguida, transfira as placas para o incubador. Após uma incubação de 30 minutos, remova toda a solução que contém as células e transfira-a para um tubo de 15 mililitros.Centrifugue o tubo e remova o sobrenatante por aspiração. Ressuspenda o pellet em 4,5 mililitros de meio DM F 12 e centrifugue novamente. Ressuspenda o pellet em três mililitros de tripsina 0,5% e incube as células a 37 graus Celsius por cinco minutos, período durante o qual as camadas de células se soltarão.Após cinco minutos, passe os agregados por uma pipeta de cinco ou 10 mililitros até que se desagreguem. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio BEC e centrifugue as células. Resuspenda pela terceira vez.Suspenda o pellet em meio DMM F 12 como etapa de lavagem e reprecipite as células novamente. Agora, reuspenda as células em meio BEC e plaque-as na camada fina preparada. Os géis de colágeno cultivam as células e as dividem nos géis de colágeno conforme necessário.Utilizando o protocolo descrito, uma população de colangiócitos extra-hepáticos de camundongos neonatos com excelente pureza foi isolada e corada por imunofluorescência para a queratina 19. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar uma população pura de colangiócitos extra-hepáticos de camundongos neonatos por meio de uma combinação de dissecação meticulosa dos ductos e crescimento sobre géis espessos de colágeno.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Aqui nós descrevemos o isolamento de células do fígado CD133 expressando-tronco e células-tronco do câncer de fígado murino todo, um processo que requer a digestão dos tecidos, o enriquecimento de células eo isolamento de citometria de fluxo. Nós incluem métodos para o isolamento de células avançado única e expansão clonal.

Isolamento de CD133 + células tronco do fígado de Expansão Clonal

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Este protocolo descreve a produção de um sistema de 3-dimensional organoides biliar extra-hepática do mouse. Estes organoids biliares podem ser mantidas em cultura para estudar Biologia cholangiocyte. Organoids biliares expressar marcadores do progenitor e células biliares e são compostos de células epiteliais polarizadas.

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Aqui descrevemos e demonstramos um protocolo para o isolamento da célula endotelial do fígado do camundongo primário (LSEC). O protocolo é baseado na perfusão da colagem hepática, purificação celular não parenquimal por centrifugação de baixa velocidade e seleção de contas magnéticas CD146. Também fenótipo e caracterizamos esses LSECs isolados usando citometria de fluxo e microscopia eletrônica de varredura.

Isolamento e Caracterização de Células Endoteliais Hemorlicais do Fígado Primário do Rato

Para a observação de distúrbios do ducto biliar neonatal murino, um ducto biliar intacto e uma preparação eficiente são necessários. Portanto, uma nova abordagem para isolar todo o sistema do ducto biliar extra-hepático em neonatos murinos foi desenvolvida com sucesso, mantendo a integridade do ducto biliar.

Dissecção do ducto biliar extra-hepático e da vesícula biliar em neonatos de camundongos com nove dias de idade

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Aprenda a isolar e cultivar colangiócitos extra-hepáticos de camundongos neonatos usando dissecação meticulosa e crescimento em géis de colágeno espesso. Este método permite obter populações puras para estudos de biologia do ducto biliar.

Isolamento de Neonatal extra-hepáticas cholangiocytes

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