Transferência de prótons e Proteína Conformação Dynamics em fotossensíveis Proteínas por Time-resolvido Passo-scan-Fourier Transform Infrared Spectroscopy

O objetivo geral deste procedimento é investigar a dinâmica de protonação e as alterações conformacionais de duas proteínas de membrana fotossensíveis utilizando espectroscopia FTIR com varredura STEP resolvida no tempo. Isso é realizado primeiramente formando um filme proteico hidratado cuja absorção no infravermelho será analisada, seja em uma configuração de reflexão total atenuada para bacteriorodopsina, seja em uma configuração de transmissão para canal Rodopsina dois. O segundo passo consiste em excitar a amostra com um flash de laser de nanosegundos em um comprimento de onda adequado, a fim de iniciar uma reação fotocíclica na proteína, detectando assim mudanças resolvidas no tempo na intensidade da luz infravermelha que interage com a amostra.

Em seguida, o processo descrito é repetido em posições distintas do espelho móvel de um interferômetro, que controla a diferença de caminho óptico entre dois feixes divididos, até que um interferograma completo resolvido no tempo seja registrado. O passo final consiste em transformar o interferograma resolvido no tempo em um espectro de absorção no infravermelho resolvido no tempo, utilizando a transformada de Fourier e a lei de Lambert-Beer. Por fim, a evolução temporal das bandas, especialmente na região do MI e na região da ligação dupla CO de grupos carboxílicos, é analisada para obter informações sobre a dinâmica das mudanças conformacionais e de protonação na proteína.

A principal vantagem da técnica em comparação com a maioria dos métodos experimentais existentes é que ela resolve alterações transitórias de protonação em proteínas. Além disso, faz isso em escalas de tempo de micro e milissegundos, a faixa de tempo mais relevante para investigar a funcionalidade proteica. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de biofísica molecular e ciência de proteínas, como quais resíduos se protonam e quando isso ocorre durante o mecanismo funcional de uma proteína ou quando acontecem alterações significativas nas proteínas.

O procedimento será demonstrado por Victor Ria, pesquisador associado do meu laboratório. Primeiro, monte o acessório de reflexão total atenuada, ou acessório ATR, na câmara de amostras do espectrômetro FTIR. Meça um espectro de energia amplo a uma resolução de quatro centímetros inversos na superfície limpa do elemento de reflexão interna por meio de espectroscopia FTIR de varredura rápida convencional. Cubra a superfície do ATR com 20 microlitros do tampão de alta força iônica que será usado posteriormente para reidratar a amostra.

Em seguida, meça a absorção no infravermelho do tampão. Depois, remova o tampão e enxágue a superfície com água sem tocá-la. Remova o líquido residual com um fluxo intenso de ar e espalhe aproximadamente três microlitros de uma solução proteica de seis miligramas por mililitro de bactérias Rodin em membrana roxa sobre a superfície.

Seque a suspensão proteica sob uma corrente suave de ar seco até obter uma película. Em seguida, meça o espectro de absorção da película seca. Após isso, adicione cuidadosamente 20 a 40 microlitros do tampão de alta força iônica para reidratar a película seca.

Cubra o suporte A TR com uma tampa para evitar a evaporação da água e medir o espectro absorvente. Estime a porcentagem de amostra remanescente próxima à superfície após a reidratação do filme subtraindo o espectro de absorção do tampão. Neste ponto, adicione 10 microlitros de canalopsina dois dissolvida em decilsida em um tampão de baixa força iônica no centro de uma janela de fluoreto de bário com diâmetro de 20 milímetros.

Espalhe a solução com a ajuda da ponteira de micropipeta, formando um filme homogêneo de seis a oito milímetros de diâmetro, utilizando um fluxo suave de ar seco aquecido, cujo diâmetro seja aproximadamente igual ao tamanho do feixe de infravermelho na abertura máxima. Em seguida, utilize uma junta de silicone plana com um milímetro de espessura. Hidrate o filme adicionando três a cinco microlitros de uma mistura de glicerol e água, distribuídos em três a cinco gotas ao redor do filme seco, e feche-o firmemente com uma segunda janela.

Insira as janelas de fluoreto de bário em sanduíche em um suporte. Em seguida, coloque o suporte na compartimento da amostra. Meça um espectro de absorção.

Confirme que a absorção máxima na região da amida um está na faixa de 0,6 a 1,0 para o conjunto A TR. Use uma fibra óptica colocada sobre a tampa do A TR para acoplar o laser à amostra. Ajuste a densidade de energia do laser na amostra para dois a três milijoules por centímetro quadrado por pulso.

Usando um medidor de potência ou os experimentos de transmissão, utilize espelhos para direcionar o laser até a amostra e, se necessário, lentes para colimar ou desviar o feixe a um diâmetro ligeiramente maior que o tamanho do filme da amostra. Sincronize o pulso do laser com a gravação dos dados utilizando o disparo Q. Use o pulso TTL de saída de sincronização da eletrônica do laser de neodímio dopado em ítrio alumínio garneto para acionar o conversor analógico-digital do espectrômetro.

Defina a taxa de excitação do laser para realizar medidas de varredura no domínio do tempo na faixa espectral de 1800 a 850 centímetros inversos. Coloque um filtro óptico de passagem baixa no trajeto óptico que seja opaco acima de 1.950 centímetros inversos e com boa transmissão abaixo de 1800 centímetros inversos.

Em seguida, mude o detector do modo AC para o modo acoplado DC. Neste momento, ajuste o nível DC do INTERFEROGRAMA a zero aplicando uma polarização de corrente ao detector. Reajuste o ganho eletrônico para aproveitar melhor a faixa dinâmica do conversor analógico-digital.

Em seguida, inicie o menu de varredura por etapas do espectrômetro de FTIR. Defina a largura de banda espectral alvo para um oitavo do número de onda do laser de hélio-neônio. Defina a resolução espectral e a resolução de fase como oito centímetros inversos e 64 centímetros inversos, respectivamente.

Selecione uma função appe. Em seguida, configure o modo de aquisição do INTERFEROGRAMA para avanço unilateral. Defina a taxa de amostragem do conversor analógico-digital para a mais alta disponível no espectrômetro.

Defina o gatilho do experimento como externo. Em seguida, defina o número de pontos de dados linearmente espaçados a serem registrados, incluindo 100 pontos pré-gatilho. Depois, defina o número de repetições ou número de médias da foto-reação por posição do espelho e inicie o experimento.

Por fim, repita o experimento 10 vezes para bactérias, redsin, e 35 vezes em três filmes de amostra diferentes para o canal redsin dois, a fim de obter aproximadamente 200 coadições por posição do espelho. Bandas características provenientes de vibrações da ligação peptídica de amidas são distinguíveis no espectro de absorção do filme seco de redsin bacteriano. Ao utilizar tampões de baixa força iônica, o filme se expande excessivamente, reduzindo a quantidade de proteína analisada pelo campo evanescente. A dependência exata entre o inchamento do filme e a força iônica do tampão dependerá, entre outros fatores, da natureza dos lipídios.

A expansão do filme após a hidratação exige tempo para atingir a estabilização para bactérias de dosin. Na membrana roxa, o processo é monoexponencial com uma constante de tempo de 12 minutos. Um gráfico 3D de uma varredura típica resolvida no tempo, experimento FDIR em bactérias.

A redsina é mostrada aqui. Os espectros podem ser extraídos em momentos específicos. Por exemplo, quando se espera que os estados intermediários no ciclo fotoquímico da redsina bacteriana atinjam sua maior população.

No ciclo fotoquímico da bactéria bastonete Dossin, os traços temporais mostram mudanças na absorbância a 1.762 centímetros inversos, indicando a dinâmica de protonação e desprotonação do aspartato 85, e a 1.741 centímetros inversos, indicando mudanças na ligação de hidrogênio e a dinâmica de desprotonação e reprotonação do ácido aspártico 96. Os traços temporais a 1.670 e 1.555 centímetros inversos.

Relate alterações nas vibrações MI um e dois, que são ambas sensíveis à confirmação da estrutura principal do peptídeo. Após o desenvolvimento deste método, outras técnicas, como neurogênese direcionada a sítios específicos ou espectroscopia enzimática da retina, podem ser realizadas para atribuir bandas vibracionais a resíduos específicos da proteína. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biofísica molecular explorarem o mecanismo funcional de diversas proteínas acionadas pela luz.