Transferência de prótons e Proteína Conformação Dynamics em fotossensíveis Proteínas por Time-resolvido Passo-scan-Fourier Transform Infrared Spectroscopy

O objetivo geral deste procedimento é sondar a dinâmica da protonação e alterações de confirmação de duas proteínas de membrana fotossensíveis usando a espectroscopia STEP scan FTIR resolvida no tempo. Isso é feito primeiro formando um filme de proteína hidratada cuja absorção infravermelha será sondada em uma configuração de reflexão total atenuada para a opsina da bactéria ou em uma configuração de transmissão para o canal Rodin dois. O segundo passo é excitar a amostra com um flash de laser de nanossegundos de comprimento de onda adequado para iniciar uma reação fotocíclica na proteína, detectando mudanças resolvidas no tempo na intensidade da luz infravermelha interagindo com a amostra.

Em seguida, o processo acima é repetido em posições discretas do espelho móvel de um interferômetro que controla a diferença do caminho óptico entre dois feixes divididos até que um interferograma completo resolvido no tempo seja registrado. A etapa final é transformar o interferograma resolvido no tempo em espectros de absorção de diferença de IR resolvidos no tempo usando a transformada de Fourier e a lei da cerveja de Lambert. Em última análise, a evolução temporal das proibições, especialmente na região MI e nas regiões carboxílicas de ligação dupla CO, é inspecionada para obter a dinâmica de mudanças confirmacionais e de protonação na proteína.

A principal vantagem da técnica de um método experimental mais existente é que ela resolve mudanças transitórias de protonação em proteínas. Além disso, ele faz isso nas escalas de tempo de micro e milissegundos, o intervalo de tempo mais relevante para sondar a funcionalidade da proteína. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biofísica molecular e da ciência das proteínas, como quais resíduos o protonato e quando o fazem durante o mecanismo funcional de uma proteína ou quando ocorrem grandes mudanças nas proteínas.

A demonstração do procedimento será feita por Victor Ria pesquisador associado do meu laboratório Primeira montagem, a refletância total atenuada ou um acessório TR no compartimento de amostra do espectrômetro FTIR. Meça um amplo espectro de energia em quatro centímetros inversos. A resolução da superfície limpa do elemento de reflexão interna por espectroscopia FTIR de varredura rápida convencional cobre a superfície do A TR com 20 microlitros do tampão de alta força iônica usado posteriormente para reidratar a amostra.

Em seguida, meça a absorção de infravermelho do tampão. Em seguida, remova o tampão e enxágue a superfície com água sem tocá-la. Remova o líquido residual por um fluxo de ar intenso espalhe aproximadamente três microlitros de uma solução de proteína de seis miligramas por mililitro da bactéria Rodin em membrana roxa no topo da superfície.

Seque a suspensão de proteínas sob uma corrente suave de ar seco até obter uma película. Em seguida, medir o espectro de absorção do filme seco. Em seguida, adicione suavemente 20 a 40 microlitros do tampão de alta força iônica para reidratar o filme seco.

Cubra o suporte A TR com uma tampa para evitar a evaporação da água, a medida e o espectro absorvente. Estime a porcentagem de amostra restante perto da superfície após a reidratação do filme subtraindo o espectro de absorção do tampão. Neste ponto, adicione 10 microlitros de opsina de canal dois dissolvidos em dec alside em um tampão de baixa força iônica no centro de uma janela de fluoreto de bário de 20 milímetros de diâmetro.

Espalhe a solução com a ajuda da ponta da micropipeta até um diâmetro de seis a oito milímetros usando um fluxo suave de ar seco, filme homogêneo quente que tem um diâmetro aproximadamente igual ao tamanho do feixe IR na maior abertura. Em seguida, use um O-ring de silicone plano de um milímetro de espessura. Hidrate o filme adicionando de três a cinco microlitros de uma mistura de glicerol e água distribuída em três a cinco gotas ao redor do filme seco e feche-o firmemente com uma segunda janela.

Insira as janelas imprensadas com fluoreto de bário em um suporte. Em seguida, coloque o suporte no compartimento de amostras. Meça um espectro de absorção.

Confirme se a absorção máxima na região da amida um está na faixa de 0.6 a 1.0 para a configuração A TR. Use uma fibra óptica colocada em cima da tampa A TR para acoplar o laser à amostra. Ajuste a densidade de energia do laser na amostra para dois a três milijoules por centímetro quadrado por pulso.

Usando um medidor de potência ou os experimentos de transmissão, use espelhos para levar o laser à amostra e, se necessário, lentes para agrupar ou desviar o feixe de laser para um diâmetro ligeiramente acima do tamanho do filme da amostra. Sincronize o pulso de laser com a gravação de dados usando a chave Q. Sincronize o pulso TTL da eletrônica do laser granada de alumínio do átrio de neodímio para acionar o conversor analógico para digital do espectrômetro.

Defina a taxa de excitação do laser para executar o tempo resolvido. Medições de varredura em etapas na faixa espectral de centímetros inversos de 1800 a 850. Coloque um filtro óptico passa-baixa no caminho óptico que seja opaco acima de 1.950 centímetros inversos e com boa transmissão abaixo de 1800 centímetros inversos.

Em seguida, mude o detector do modo acoplado CA para CC. Neste ponto, zere o nível CC do INTERFEROGRAMA aplicando uma polarização de corrente ao detector. Reajuste o ganho eletrônico para fazer melhor uso da faixa dinâmica do conversor analógico para digital.

Em seguida, inicie o menu de varredura de etapas do espectrômetro FTIR. Defina a largura de banda espectral alvo para a medição de varredura em etapas para um oitavo do número de onda do laser de hélio neon. Defina a resolução espectral e de fase para oito centímetros inversos e 64 centímetros inversos, respectivamente.

Selecione uma função appe. Em seguida, defina o modo de aquisição do INTERFEROGRAMA para um lado para frente. Defina a taxa de amostragem do conversor analógico para digital para a mais alta disponível no espectrômetro.

Defina o gatilho do experimento como externo. Em seguida, defina o número de pontos de dados linearmente espaçados a serem registrados, incluindo 100 pontos de disparo de pret. Em seguida, defina o número de co-edições ou o número de médias da reação fotográfica por posição do espelho e inicie o experimento.

Finalmente, repita o experimento 10 vezes para bactérias, redsin, e 35 vezes em três filmes de amostra diferentes para o canal redsin dois para ter aproximadamente 200 adições de co por posição do espelho proibições características de vibrações de amite de ligação peptídica são distinguíveis no espectro de absorção de espuma seca de bactérias redsin. Ao usar tampões de baixa força iônica, o filme se expande excessivamente, reduzindo a quantidade de proteína sondada pelo campo evanescente. A dependência exata entre o inchaço do filme e a força iônica do tampão dependerá, entre outros fatores, da natureza dos lipídios.

O inchaço do filme após a hidratação requer tempo para atingir a estabilização das bactérias da dosina. Na membrana roxa, o processo é monoexponencial com uma constante de tempo de 12 minutos. Um gráfico 3D de uma varredura de etapa resolvida no tempo típico, experimento FDIR em bactérias.

Redsin é mostrado aqui. Os espectros podem ser extraídos em momentos específicos. Por exemplo, quando se espera que estados intermediários no ciclo fotográfico de bactérias redsin atinjam sua população mais alta.

Na haste de bactérias Dossina tempo de ciclo fotográfico traços de absorbância mudam em 1.762 centímetros inversos. Relatórios sobre a dinâmica de desprotonação da protonação do aspartato 85 e a 1.741 centímetros inversos sobre as mudanças nas ligações de hidrogênio e a dinâmica da reprodução da desprotonação do ácido aspártico.96. O tempo traça em 1.670 e 1.555 centímetros inversos.

Relate as alterações nas vibrações MI um e dois, que são sensíveis à confirmação da estrutura do peptídeo. Seguindo este método, outras técnicas, como neurogênese dirigida ao local ou espectroscopia enzimática da retina, podem ser realizadas para atribuir banda vibracional a resíduos específicos na proteína após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biofísica molecular explorarem o mecanismo funcional de muitas proteínas diferentes impulsionadas pela luz.