Métodos para caracterizar espontânea e surpreender-induzida Locomotion em um modelo de doença de Parkinson induzida por Rotenone de
17 de agosto de 2014
A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa que resulta da degeneração dos neurónios dopaminérgicos no sistema nervoso central, causando defeitos de locomoção. Modelos rotenona doença de Parkinson em Drosophila. Este documento descreve dois ensaios que caracterizam as deficiências de locomoção tanto espontâneas e induzidas por assustar causadas por rotenona.
O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a locomoção induzida por estímulo sonoro e a locomoção espontânea de longo prazo em um modelo de doença de Parkinson induzido por rotenona em drosófila, o que é alcançado criando drosófilas em alimento suplementado com rotenona para induzir o fenótipo. Como segundo passo, as moscas são submetidas ao ensaio de resposta ao susto e a um aparato de dois frascos, bem como ao ensaio de locomoção espontânea de longo prazo. Em um monitor de atividade de drosófila, os resultados mostram que a exposição à rotenona causa defeitos na locomoção em drosófila com base na quantificação da resposta ao susto e da locomoção espontânea de longo prazo.
Esses métodos podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de drosófila, modelos de distúrbios neurodegenerativos e de locomoção, como defeitos na locomoção induzida por estímulo súbito e locomoção espontânea de longo prazo. Para começar, adicione 1,5 grama de meio instantâneo para drosófila. Em um frasco padrão para moscas, prepare o meio com cinco mililitros de água desionizada contendo a dose apropriada de rotenona.
A seguir, sede de oito a 12 moscas machos com idade entre um e três dias usando dióxido de carbono e transfira-as para frascos contendo a droga. Deixe a comida suplementada para que as moscas se recuperem da sedação por 20 minutos com o frasco na posição horizontal. Em seguida, coloque o frasco na posição vertical em um incubador com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro a 25 graus Celsius pelo restante do experimento.
Em seguida, inverta um frasco padrão para moscas sobre outro frasco e feche a junção com fita adesiva para criar um aparato com dois frascos. Em seguida, divida o aparato duplo em três seções iguais de 6,33 centímetros, marcando círculos ao redor dos frascos com uma caneta permanente. Após três dias de exposição à droga, transfira as moscas para o aparato com dois frascos.
Substitua a fita sobre a emenda para permitir que as moscas se aclimatizem ao novo ambiente por 15 minutos. Em seguida, coloque os frascos sobre um fundo branco e posicione a câmera digital. Certifique-se de que todo o aparato seja visível em um único quadro de imagem e que o aparato com os dois frascos e o cronômetro estejam à vista, com todas as moscas em foco.
Marque a posição da câmera e do frasco para manter quadros consistentes entre os ensaios e exiba claramente o número do ensaio e o tratamento com o fármaco na imagem da câmera. Em seguida, bata firmemente o aparato com os dois frascos contra a bancada três vezes, certificando-se de que todas as moscas caiam para o fundo do frasco, e inicie imediatamente o cronômetro. Tire uma foto do aparato a cada cinco segundos durante um minuto.
Em seguida, deixe as moscas recuperarem-se sem perturbação por um minuto. Repita o ensaio mais duas vezes com intervalos de recuperação de um minuto entre cada ensaio. Revise as imagens e registre o número de moscas em cada seção ao longo do tempo para realizar os cálculos: reconstitua três gramas do meio instantâneo oph com 15 mililitros de água deionizada e a dose apropriada de rotenona.
Após cinco minutos, coloque cuidadosamente os tubos verticalmente em frascos transparentes e carregue o alimento firme até uma altura de um centímetro girando o tubo. Em seguida, empurre suavemente a tampa de plástico na extremidade do tubo, evitando a formação de bolhas de ar. Sedar moscas machos de um dia de idade com dióxido de carbono e inserir cuidadosamente uma mosca em cada tubo com um pincel.
Em seguida, tampe a extremidade do tubo com uma pequena bola de algodão. Deixe as moscas se recuperarem do dióxido de carbono com os tubos em posição horizontal por 15 minutos e certifique-se de que todas as moscas estejam vivas e ativas. Insira os tubos no monitor de atividade de drosófila ou DAM e verifique se todos os tubos estão na mesma posição em relação ao DAM.
Coloque o DAM em um incubador com ciclo de 12 horas de luz e escuridão a 25 graus Celsius. Em seguida, conecte o DAM ao sistema de coleta de dados. Depois, abra o software do DAM em preferências.
Selecione um comprimento de bin de 10 minutos para iniciar a coleta de dados e permita que o programa colete dados durante sete dias. Em seguida, abra o programa de análise de arquivo DAM e acesse os dados do monitor clicando em selecionar dados de entrada. Depois, selecione o intervalo do monitor apropriado e defina o comprimento do bin em intervalos de 10 minutos.
Em seguida, no tipo de arquivo de saída, escolha os arquivos de canal e mantenha todas as outras opções nos valores padrão. Depois, clique em escanear dados e salve os arquivos em uma pasta designada. Por fim, importe os dados para um software de análise de dados circadianos para obter as contagens por minuto.
Após três dias de exposição a diferentes dosagens de roone, moscas do tipo selvagem Canton s expostas a dosagens aumentadas apresentaram deficiência na resposta a susto. Um percentual menor de moscas estava na seção superior e um percentual maior na seção inferior do aparelho após 30 segundos, indicativo de uma deficiência na resposta saral; uma tendência semelhante foi observada para as moscas no ensaio de locomoção espontânea. As contagens por minuto foram medidas no monitor de atividade de drosófila ou DAM.
No quarto dia após a exposição, moscas expostas a 250 micromolares e 500 micromolares de rotenona exibem uma redução significativa nas contagens por minuto. Esses ensaios podem ser convenientemente adaptados para caracterizar defeitos na locomoção em outros modelos esofágicos de doenças e na eficácia de agentes terapêuticos.
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Visão Geral
Este estudo investiga deficiências na locomoção em um modelo de Drosophila da doença de Parkinson induzida por rotenona. A pesquisa concentra-se tanto na locomoção espontânea quanto na induzida por estímulo súbito, fornecendo insights sobre distúrbios neurodegenerativos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Análise Comportamental
- Distúrbios Neurodegenerativos
Antecedentes
- A doença de Parkinson é caracterizada pela degeneração de neurônios dopaminérgicos.
- Drosophila serve como organismo modelo para o estudo de defeitos na locomoção.
- A rotenona é usada para induzir sintomas semelhantes aos da Parkinson nesses insetos.
- Compreender a locomoção pode fornecer insights sobre os mecanismos de neurodegeneração.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a locomoção induzida por sobressalto em Drosophila.
- Avaliar a locomoção espontânea de longo prazo em um modelo induzido por rotenona.
- Explorar o impacto da rotenona no comportamento locomotor.
Métodos Utilizados
- Drosophila foram criadas em alimento suplementado com rotenona.
- As moscas foram submetidas a um ensaio de resposta ao susto.
- Um aparato com dois frascos foi utilizado para avaliação da locomoção.
- A locomoção espontânea de longo prazo foi medida usando um monitor de atividade de Drosophila.
Resultados Principais
- A exposição à rotenona resultou em defeitos significativos na locomoção.
- A quantificação revelou locomoção induzida por estímulo assustador prejudicada.
- A locomoção espontânea de longo prazo também foi afetada pela exposição à rotenona.
- Esses achados contribuem para a compreensão dos distúrbios de locomoção em modelos neurodegenerativos.
Conclusões
- O estudo fornece uma estrutura para avaliar a locomoção em modelos de Drosophila da doença de Parkinson.
- Os resultados destacam a utilidade da rotenona no estudo de distúrbios neurodegenerativos.
- Pesquisas futuras podem se basear nestes métodos para explorar outras questões neurobiológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este estudo fornece uma abordagem escalonável e de alto rendimento para quantificar déficits locomotores em um modelo de Drosophila da doença de Parkinson, permitindo a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas para terapêuticas neurodegenerativas. Ao capturar fenótipos de movimento espontâneos e induzidos por estímulo súbito, os ensaios oferecem confiança preditiva em campanhas de triagem fenotípica e modulação de vias. A metodologia oferece continuidade translacional desde a descoberta até a avaliação pré-clínica, facilitando a priorização ajustada ao risco de compostos que afetam a integridade dos neurônios dopaminérgicos e a função mitocondrial.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas à sobrevivência de neurônios dopaminérgicos e à inibição do complexo I mitocondrial.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para a elucidação de vias e a redução de riscos biológicos de alvos mitocondriais.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir compostos que resgatam a função locomotora daqueles sem efeito sobre os déficits induzidos por rotenona.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece sistemas biológicos validados para avaliação de compostos em ensaios direcionados à neurodegeneração.
- Valor Operacional: Garante padronização do ensaio e compatibilidade com alto rendimento por meio do aparato de frasco duplo e do monitor de atividade de Drosophila.
- Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diversas doses de rotenona e diferentes origens genéticas para fenotipagem locomotora consistente.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao modelar o estresse oxidativo induzido por rotenona e a diminuição da locomoção, paralelos à progressão humana do Parkinson.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal da locomoção espontânea ao longo de sete dias para avaliar os efeitos crônicos de compostos.
- Valor Preditivo: Apoia decisões de avanço com ajuste de risco, vinculando respostas agudas de sobressalto e atividade de longo prazo aos mecanismos neurodegenerativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao estabelecer linhas de base locomotoras antes da triagem de compostos e prossegue até a otimização de compostos líderes para confirmação do mecanismo de ação.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre disfunção mitocondrial e vias de estresse oxidativo na neurodegeneração.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas de locomoção por intervalos adequadas para análise automatizada de imagens e perfilagem de resposta à dose.
- Análises: Gera dados de contagens por minuto e distribuição posicional, permitindo comparação estatística dos efeitos de tratamentos ao longo do tempo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona defeitos agudos de resposta ao susto e perda crônica de atividade espontânea com declínio motor progressivo observado em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de fenotipagem locomotora adaptável a outros modelos de doenças em Drosophila e ao teste de eficácia terapêutica.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista nos fenótipos locomotores.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização entre laboratórios por meio de protocolos definidos de estimulação tátil, intervalos de recuperação e parâmetros de imagem.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de avanço ou interrupção ao fornecer biomarcadores precoces e quantificáveis da integridade neuronal e função mitocondrial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em risco de compostos que modificam a diminuição locomotora induzida por rotenona, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manejo, sedação e configuração de ensaios comportamentais com Drosophila.
- Depende da infraestrutura de imagem (câmera digital, iluminação) e de sistemas de monitoramento de atividade de Drosophila para a coleta de dados.
- Necessita padronização entre equipes quanto à marcação de frascos, força de batida e tempo de recuperação para garantir consistência entre ensaios.
- Envolve considerações de adaptação ao estender os ensaios a diferentes origens genéticas ou condições ambientais.
- Limitado pela necessidade de revisão manual de imagens em ensaios de sobressalto, a menos que seja implementado rastreamento automatizado.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Startle-induced Locomotion Assay and Setup
3:11
Startle-induced Locomotion Experimentation and Data Analysis
4:04
Spontaneous Locomotion Assay Setup
5:19
Spontaneous Locomotion Data Collection and Analysis
6:36
Results: Rotenone-induced Response Deficiency
7:35
Conclusion
