Name: O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T In vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a gerar matrizes de alvos fluorescentes para avaliar respostas de células T in vivo usando citometria de fluxo multiparamétrica. Este método permite analisar mais de 250 parâmetros simultaneamente em um único animal.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios do projeto # 1010395 (BQ e PB) e # 525431 (CR), e um Programa de Grant # 455395 (CP) do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália, um Centro Australiano para Hepatite e HIV Virologia EOI 2012 bolsa (CR e RJJ) e uma bolsa da Fundação Bootes Gordon and Gretel (BQ e CR). Queremos agradecer Harpreet Vohra e Michael Devoy por sua excelente manutenção do laboratório JCSMR FACS, a Facilidade Australian Cancer Research Foundation Biomolecular Resource, JCSMR, ANU, para síntese de peptídeos, e Dr. David Boyle, CSIRO Animais Laboratórios de Saúde, Geelong, Austrália por fornecer os estoques de vacinas HIV pais.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
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<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
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<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
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<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

A vantagem de ensaios baseados em TLC é que eles permitem a discriminação de&gt; 250 populações de células alvo viável e completamente funcional a partir de um único animal hospedeiro por citometria de fluxo. Isso proporciona um nível de complexidade para in vivo fluem ensaios baseados citometria de que não foi possível antes. Isto é realçado nas duas experiências com animais mostradas acima, em que as respostas aos epítopos virais 7 distintas em 6 concentrações poderiam ser monitorizadas em replicados de 6, si...

As células T desempenham um papel central na resposta imune adaptativa e são frequentemente alvo de manipulação em imunoterapia. As células CD4 + T efectoras responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas que regulam muitos aspectos da imunidade e também podem ajudar directamente as células B para fabricar anticorpos. As células T citotóxicas CD8 + (CTLs) podem também responder ao antigénio estranho pela secreção de citocinas, bem como desempenha um papel central em matar directamente as células que expressam um antigénio estranho. A interacção fundamental que inicia estas funções efectoras de células T envolve a interacção do receptor de células T (TCR) com peptídeos estranhos apresentados em moléculas de MHC na superfície das células. As células CD4 + T reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe II nas células que apresentam os antigénios e células T CD8 + reconhecem péptidos apresentados em moléculas de MHC de classe I que são normalmente apresentadas em células microbianas infectado. Em ordempara avaliar o papel de células T desempenham na resposta imune, é essencial que as suas funções efectoras são medidos por técnicas fiáveis ​​e sensíveis. Os métodos comuns de avaliação de resposta das células T incluem; MHC class-I/II/peptide tetramer reatividade; produção de citocinas por ELISPOT e coloração de citocinas intracelulares; e matando a capacidade em 51 ensaios de Cr-lançamento. Estes ensaios, no entanto, são tipicamente realizados ex vivo com estimulação in vitro, ou fornecer uma visão limitada em função das células T. Idealmente, ao medir as respostas das células T, seria benéfico para os avaliar in situ, in vivo à medida que ocorrem, sem a manipulação de células T, de modo a evitar alterações nos parâmetros funcionais que podem ocorrer através de estimulação in vitro. Alguns dos mais vulgarmente usados ​​em células T ensaios funcionais in vivo são baseados na medição de morte por CTL mediada de células alvo pulsadas com péptidos do MHC de classe I de ligação, que são enumerados in vivovia sua detecção através de marcação fluorescente com corantes vitais como CFSE. Embora estes tipos de ensaios podem monitorar morte mediada por CTL de metas quando acontecem in vivo, eles já tinham uma capacidade relativamente limitada para avaliar a morte de múltiplos alvos que apresentam diferentes concentrações e tipos diferentes de epítopos peptídicos, que é necessário para permitir que os parâmetros qualitativos, tais avidez tão funcional e variante epítopo reatividade cruzada a ser avaliado. Estes ensaios também não fornece nenhuma informação sobre as respostas mediadas por células T CD4 +. Para superar muitas das limitações com os métodos atuais usados ​​para avaliar as respostas das células T, que recentemente desenvolveu um ensaio multiplex com base em matrizes fluorescentes alvo (ACL), que permite o monitoramento de respostas de células T contra&gt; 250 células alvo simultaneamente em um animal por citometria de fluxo 1, 2. FTAs são compostas de linfócitos marcados com SEVeral concentrações e combinações de corantes vitais como CFSE, CTV e CPD permitindo&gt; 250 grupos de células de fluorescência único a ser gerado. Uma vez que estas células permanecem viáveis ​​e completamente funcional, que pode ser injectado no animal para permitir a monitorização da sua interacção com células T efectoras in vivo 3. Por exemplo, os agregados de células FTA podem ser pulsadas com péptidos do MHC-I de ligação à classe para permitir a avaliação de morte por CTL específica de antigénio mediada por células-alvo 1. Além disso, os agregados de células FTA também podem ser pulsadas com péptidos de MHC de classe II de ligação, permitindo a avaliação do antigénio específico para a célula T auxiliar (T H), avaliando a actividade de activação (por avaliação de marcadores de activação, como CD69, CD44 e / ou CD62L) de células B dentro do FTA rolamento peptídeo cognato 2. Uma vez que mais de 250 alvos pode ser detectado em simultâneo, é possível medir as respostas de CTL e de T H contra muitos grupos de células alvo pulsadas com npeptídeos umerous em diferentes concentrações ea inclusão de muitas repetições. Por isso, o ensaio FTA fornece um nível sem precedentes de avaliação da resposta das células T efetoras in vivo. Aqui, descrevemos em pormenor a construção de um FTA e mostram como podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T in vivo. O processo descreve a construção de um FTA composta de 252 agrupamentos de células discerníveis por meio da utilização de três corantes vitais, composta de seis repetições de 42 conjuntos de células pulsadas com o MHC de classe I e II, os péptidos de ligação. A rotulagem de 42 conjuntos de células ocorre em 10 ml de fundo cónico de tubos e que é útil para colocar estes em um suporte para tubos, conforme ilustrado na Tabela 1. Esse método pode ser ajustado para um número menor de aglomerados discerníveis como requerido ao reduzir a quantidade de rotulagem de cada corante realizada 1. Destaca-se a utilidade do ensaio, mostrando como ele pode medir responses geradas pela vacinação pox-vírus recombinante contra múltiplos epitopos em um pequeno grupo de ratos. Isto mostra como o ensaio de TLC pode ser usado para medir as respostas cumulativas e avidez funcional através de, respectivamente, o uso da área sob a curva (AUC) de avaliações e medições da concentração de péptido eficaz necessária para produzir respostas máximas metade (EC 50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal de bezerro</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anti-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD69 violeta brilhante 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo (Fortessa ou equivalente com fonte de laser azul, vermelha e violeta)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

o uso de fluorescentes alvo matrizes para a avaliação de respostas de células t<em&gt; in vivo</em

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

A capacidade de monitorar as respostas das células T in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune e da criação de imunoterapias. Aqui nós descrevemos o uso de tecnologia de matriz alvo fluorescente (FTA), que utiliza corantes vitais, tais como éster carboxifluoresceína succinimidyl (CFSE), corantes excitáveis ​​a laser violeta (violeta CellTrace: CTV) e corantes excitáveis ​​de laser vermelho (celular Proliferação Dye eFluor 670: CPD ) para combinatorialmente linfócitos etiqueta rato em&gt; 250 agrupamentos de células fluorescentes discerníveis. Aglomerados de células dentro dessas ACL pode ser pulsada com histocompatibilidade principal (MHC) de péptidos de ligação de classe I e MHC de classe II e assim actuar como células-alvo para as células CD8 + e células T CD4 +, respectivamente. Estas células FTA permanecer viável e totalmente funcional, e pode, portanto, ser administrado em ratos para permitir a avaliação de CD8 + T mediada por células morte de células alvo FTA e CD4 + T hel meditado-cellp de TLC células B alvo de células em tempo real in vivo, por citometria de fluxo. Desde&gt; 250 células alvo pode ser avaliada de uma só vez, a técnica permite o monitoramento de respostas de células T contra vários epítopos de antígeno em várias concentrações e em múltiplas repetições. Como tal, a técnica pode medir as respostas das células T, tanto a um (por exemplo, a magnitude da resposta cumulativa) quantitativa e um (por exemplo, avidez funcional. Eo epitopo de reactividade cruzada da resposta) qualitativa nível. Aqui, nós descrevemos como esses TLCs são construídos e dar um exemplo de como eles podem ser aplicados para avaliar as respostas de células T induzidas por uma vacina de vírus da varíola recombinante.

Como um exemplo da utilização do ensaio de TLC, um ratinho BALB / c foi imunizado com vírus vaccinia recombinante (VV) expressando epítopos de HIV-I (VV-HIV) e as respostas aos epítopos de CTL de VIH-I, Gag, mut Gag Env e Pol, o VV epitopos CTL F2L e F2L mut, e o epitopo de célula T de HIV-I H, Gag Th (tal como descrito em 2) foram avaliados utilizando um ensaio de TLC parâmetro 252 (Figura 1B). Variantes de epitopos de mordaça (mut Gag) e F2L (F2L mut) não são expressos no vector ...

A capacidade de monitorar as respostas das células T em detalhe, in vivo é importante para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta imune. Aqui nós descrevemos o uso de matrizes alvo fluorescentes (ACL) em um ensaio in vivo de células T em que avalia&gt; 250 parâmetros simultaneamente por citometria de fluxo.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar uma matriz de até 252 células-alvo fluorescentes distintamente marcadas para ensaios imunológicos utilizando citometria de fluxo multiparamétrica. Isso é realizado primeiramente marcando linfócitos-alvo com combinações únicas e diferentes intensidades de corantes vitais, como CFSE e CTV. A próxima etapa consiste em sensibilizar cada população distinta de linfócitos-alvo com epítopos de peptídeos candidatos que se ligam às classes I e II do MHC.Em seguida, realiza-se uma lavagem extensiva das células para manter a especificidade dos epítopos, depois as células são reunidas em pool e injetadas em um animal. Os passos finais consistem em coletar as células com matriz de marcação fluorescente de tecidos específicos, rotulá-las e avaliar as respostas específicas a peptídeos de MHC. Em última análise, os resultados de citometria de fluxo podem demonstrar respostas de LTC ao medir a morte celular alvo e podem mostrar respostas de células T auxiliares CD4 positivas ao medir a superexpressão de marcadores de ativação em células B. Uma das principais vantagens dessa técnica em relação aos ensaios convencionais de LTC in vivo é que ela permite a medição simultânea de mais de 250 células-alvo em um único animal. A demonstração do procedimento será realizada por Ben Quire, pesquisador colaborador em meu laboratório.O procedimento exige linfócitos coletados do baço isolado e/ou dos linfonodos de camundongos, filtrados e ressuspendidos em até 200 milhões de células por mililitro em 11,5 mililitros de RPMI contendo 5% de soro fetal bovino. O preparo do FDA começa com a marcação. 42 tubos plásticos cônicos de 10 mililitros, numerados de um a 42, terão todas as células pulsadas com sete diferentes epítopos peptídicos em seis concentrações distintas, repetidas seis vezes, para gerar 252 agrupamentos celulares discerníveis.Agora, ressuspenda completamente os linfócitos invertendo o tubo várias vezes. Em seguida, adicione 1,9 mililitro de suspensão celular aos tubos de 10 mililitros identificados de 37 a 42, tomando cuidado para não molhar a metade superior dos tubos.Agora remova a tampa do tubo 38 e coloque-o horizontalmente sobre a parte superior do tubo 38. Adicione 83 microlitros de PBS. Em seguida, adicione 17 microlitros do estoque apropriado de CTV conforme apresentado na tabela dois do protocolo textual.Uma vez que o tubo estiver carregado, agite-o em vórtex. Repita isso com os tubos 39 a 42. Certifique-se de que cada tubo receba um estoque diferente de CTV conforme listado na tabela dois.Agora, incube as células por pelo menos cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco mililitros de RPMI contendo 5% de FCS a cada tubo. Suspender bem as células por vortexagem em cada tubo. Transfira um mililitro da suspensão para outros seis tubos seguindo o padrão de carregamento sugerido no protocolo descrito no texto; durante cada transferência, é importante não molhar a parte superior do tubo carregado. Para marcar as células com CFSE, remova as tampas dos tubos 31 a 36, que contêm um mililitro de células, e coloque os tubos na posição horizontal ao lado de cada um dos tubos.Primeiro, adicione 103 microlitros de PBS, ejetando-o na parede superior seca. Em seguida, adicione sete microlitros do estoque apropriado de CFSE conforme a tabela três do protocolo textual e vórtex imediatamente o tubo. Repita este procedimento com os tubos conforme agrupados na tabela três.Certifique-se de que cada tubo receba um estoque diferente de CFSE. Incube todos os tubos por pelo menos cinco minutos à temperatura ambiente. Após aguardar cinco minutos, lave as células para concluir a marcação.Dilua cada suspensão com nove mililitros de RPMI à temperatura ambiente contendo 5% de FCS. Peline as células a 300 ×g por 10 minutos à temperatura ambiente e remova os sobrenadantes por aspiração usando uma pipeta de transferência. A preparação de peptídeos ligantes para a classe I e classe II do MHC é apresentada no protocolo textual. Esta seção mostra como pulsar as células com esses peptídeos.Primeiro, ressuspenda o pellet celular no meio residual, por exemplo, passando os tubos por uma grade. Em seguida, ajuste o volume total da suspensão celular para 250 microlitros em nosso PMI contendo 5% de FCS. Cada pellet celular deve necessitar de cerca de 200 microlitros de meio.Em seguida, adicione 250 microlitros das soluções estoque de peptídeos previamente preparadas listadas na tabela cinco aos tubos designados. Siga o padrão apresentado na tabela um e certifique-se de incluir um tubo controle contendo apenas PBS para o cálculo das respostas de células T. É fundamental que cada epítopo peptídico e cada concentração de peptídeo sejam atribuídos a um único tubo e que isso seja registrado claramente com base na fluorescência esperada das células neste tubo.Como a assinatura fluorescente deste grupo definirá este peptídeo, misture cada suspensão celular por vortex e, em seguida, incube as células a 37 graus Celsius por uma hora. Após a incubação, prossiga com a lavagem das células. Primeiro, adicione cinco mililitros de RPMI gelado com 5% de FCS a cada suspensão celular e ressuspenda as células invertendo os tubos.Em seguida, sobrepõe cuidadosamente cada suspensão celular com três mililitros de FCS gelado sedimentado, mantendo as células com 10 minutos de centrifugação a 300 G a quatro graus Celsius. Utilize aceleração e frenagem lentas para garantir que a interface da solução seja mantida em cada tubo. Aspire cuidadosamente o RPMI e, em seguida, aspire o FCS, deixando o pellet celular lavado intacto.Após isolar os pellets, lave as células novamente até os pellets celulares lavados duas vezes serem ressuspendidos. Suspenda-os em 10 mililitros de RPMI gelado com 5% de FCS e repita a centrifugação; após a centrifugação, remova os sobrenadantes. Em seguida, reúna todas as populações em um novo tubo de 10 mililitros com seis mililitros de RPMI gelado contendo 5% de FCS, sedimente as células agrupadas por centrifugação e aspire o sobrenadante com uma pipeta de transferência neste ponto de todo o procedimento.Pode-se gerar seis réplicas intraensaio marcando as células com peptídeos usando seis concentrações diferentes de CPD. Primeiro, adicione 11,4 mililitros de RPMI à temperatura ambiente contendo 5% de FCS ao pellet celular agrupado e re-suspenda completamente por pipetagem. Em seguida, adicione 1,9 mililitro de suspensão celular a seis novos tubos de 10 mililitros rotulados de A a F, tomando cuidado para não molhar a metade superior do tubo.Para começar a marcar as células, utilize o tubo B sem tampa CPD e posicione o tubo horizontalmente ao longo da parede seca. Primeiro, adicione 92 microlitros de PBS seguidos de um volume do estoque CPD conforme a tabela quatro. Em seguida, vortexe a mistura. Repita este passo com o tubo C dois F, garantindo que cada tubo receba um estoque diferente de CPD, conforme indicado na tabela quatro.Após misturar todos os tubos, deixe-os em incubação por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, lave as células duas vezes: primeiro, re-suspenda-as em 10 mililitros de meio à temperatura ambiente. Segundo, centrifugue-as e, terceiro, aspire os sobrenadantes com uma pipeta de transferência.Em seguida, repita o processo. Agora, reúna todas as células dos tubos A a F em um único tubo com oito mililitros de meio frio sobre gelo.Recolha as células por centrifugação e prossiga com a injeção das células nos animais e com a subsequente análise de citometria de fluxo. Os detalhes são fornecidos no protocolo textual. Um camundongo BC foi imunizado com vírus vaccínia recombinante expressando epítopos de HIV V1 e as respostas a diversos epítopos foram avaliadas utilizando um ensaio FTA de 252 parâmetros.Duas variantes de epítopos, gag mute e FTL mute, não foram expressas no vetor, e camundongos ingênuos também foram injetados com o FTA. O TA foi discriminado de células hospedeiras de camundongo pela marcação com PKH26, e as células FTAB foram discriminadas pela coloração com anticorpo B220 por citometria de fluxo. Cada uma das seis réplicas intra-animais foi selecionada com base na fluorescência do CPD; alvos de FTA expressando as várias concentrações de epítopos foram selecionados com base na fluorescência de CFSE e CTV.A fração de morte celular específica de cada replicata foi avaliada comparando a morte celular em aglomerados FTA em animais previamente sensibilizados em relação aos aglomerados FTA correspondentes em animais ingênuos. A atividade das células T auxiliares foi avaliada comparando a upregulação de CD69 em células B FTA em animais previamente sensibilizados em relação aos aglomerados correspondentes de células B FTA em animais ingênuos. A partir dessa análise, a infecção por V-V-H-I-V gerou as respostas CTL mais fortes contra o epítopo imunodominante de VV, F two L, com 100% das células-alvo FDA pulsadas com 0,001 micromolar ou mais do epítopo sendo removidas do baço.Além das respostas CTL, o ensaio FTA também mediu respostas de células T auxiliares ao avaliar a ativação de células FTAB, expressando o epítopo de ligação à classe II do MHC-HIV gag th. Isso demonstrou que a ativação de células B específicas por antígeno ocorreu em animais previamente sensibilizados, sugerindo a geração de efetores de células T auxiliares específicas para HIV gag. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar uma matriz fluorescente de alvos com mais de 250 células-alvo.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Tregs são potentes supressores do sistema imune. Há uma falta de marcadores de superfície única para defini-los, portanto, definições de Tregs são principalmente funcionais. Aqui nós descrevemos um...

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A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

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Este vídeo demonstra a triagem de compostos imunomoduladores por meio de ensaio baseado em fluorescência. Linfócitos T derivados de camundongos transgênicos com de expressão de proteína fluorescente verde são tratados com esses compostos. Os sinais GFP aprimorados e reduzidos permitem a identificação dos efeitos estimulatórios e inibitórios dos compostos, respectivamente.

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Este vídeo demonstra uma técnica de imagem multiespectral de fluorescência in-situ para analisar diferentes subpopulações de células T infiltrantes no tecido tumoral. Uma criossecção tecidual de carcinoma de células renais é tratada com anticorpos para marcar células T CD8+ que expressam receptores inibitórios específicos e exibem um fenótipo resistente à imunoterapia. A seção marcada é visualizada usando um microscópio multiespectral para identificar as subpopulações distintas de células T...

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Descrevemos um protocolo para monitorar a mobilidade radial de células imunes não aderentes in vitro usando um aparelho coletor/slide de sedimentação celular. A migração celular é rastreada em monocamadas de células tumorais ou em proteínas da matriz extracelular. O exame por microscopia de luz e fluorescência permite a observação da mobilidade celular e da funcionalidade citotóxica.

Radial Mobilidade e função citotóxica de Retroviral Replicando Vector transduzidas, Alloresponsive não aderentes Linfócitos T

Aqui descrevemos um ensaio de cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa em tandem (HPLC-MS/MS) para quantificar o imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco usando uma etapa de precipitação de proteína manual simples e extração em coluna online.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Apresentamos aqui um pedido de uma norma técnica imunológica (CFSE manchado OT-eu proliferação) destinados a monitorar rapidamente mediada por adjuvante T linfócitos citotóxicos (CTL) geração in vivo. Esta estimativa rápida das capacidades CTL é útil para o desenvolvimento de vacinas profiláticas contra patógenos intracelulares, bem como as vacinas terapêuticas do câncer.

Rápida na Vivo avaliação dos recursos de geração de linfócitos de T citotóxicos do adjuvante para desenvolvimento de vacinas

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O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T

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