Name: DNA-RNA combinado fluorescente Em situ A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 54 s
Description: Aprenda a técnica de hibridização in situ fluorescente combinada de DNA-RNA para estudar a inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias femininas de rato. Este método permite detectar simultaneamente ácidos nucleicos no ambiente celular nativo.

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Os autores agradecem a todos os membros anteriores e atuais do departamento de Reprodução e Desenvolvimento do Erasmus MC pelas discussões úteis e estimulantes durante os últimos anos. Também queremos agradecer aos três revisores anônimos por fornecerem feedback útil. O trabalho no laboratório de Gribnau é apoiado por financiamento do conselho de pesquisa holandês (NWO-VICI) e uma bolsa inicial do ERC.

1. Indução de Diferenciação no feminino as células estaminais embrionárias para induzir inativação do cromossomo X NOTA: células-tronco embrionárias de mulher (disponíveis mediante solicitação) são cultivadas em condições normais de células ES em placas de cultura gelatinizadas revestidas com fibroblastos de rato embrionárias (MEFs). Nós aqui assumimos que o leitor está familiarizado com as técnicas de cultura de células normais 39-41. Para induzir a diferenciação de células ES cultivadas em pratos T25 será separada das MEFs, e vai ser plaqueadas em meio de diferenciação. <ol><li> Remova o meio ES a partir da cultura de células ES, e lavar duas vezes com PBS de cultura de células. </li><li> Adicionar 1,5 ml de tripsina-EDTA (pré-aquecido a 37 ° C), e incuba-se as células a 37 ° C durante 7 min. Depois de 3,5 min, agitar o prato delicadamente para quebrar as colônias. </li><li> Inactivar a tripsina-EDTA, adicionando 3,5 ml de meio de diferenciação das células. Células de pipeta cima e para baixo para obter uma solução única célula, e recolherem um tubo de 15 ml. Centrifugação durante 5 minutos a 200 xg, e recolher as células em 10 ml de meio de diferenciação. </li><li> Adicionar a suspensão de células para um prato de cultura não gelatinizado, e incubar durante 1 hora numa incubadora de cultura de células. NOTA: MEFs serão capazes de aderir à placa de cultura não gelatinizado, enquanto que as células ES irão permanecer em suspensão. </li><li> No entanto, adicionar lamelas de vidro esterilizado (24 x 24 mm) em placas de 6 poços, adicionar 0,2% de gelatina, e incubar durante um mínimo de 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Depois de 1 hora, recolher o sobrenadante da cultura de células ES de pré-banhado, que consistem principalmente de não-aderentes células-tronco embrionárias. Placa células-tronco embrionárias para placas de 6 poços contendo lamínulas. NOTA: Use ⅙ º de um prato confluente T25 por 6 poços de uma placa de 6 poços. Isto irá permitir uma diferenciação bem confluentes depois de 3 dias de diferenciação. Mudança de meio, numa base diária. Para cursos mais longos de tempo diferenciação, placa pré-banhado células-tronco embrionárias em meio de diferenciação em pratos bacterianas e incubcomi num agitador célula integrada na incubadora de cultura de células. Isto irá permitir que as células de modo a formar corpos embrióides, que podem ser plaqueadas a lamelas 1-2 dias antes da fixação. </li></ol> 2. Fixação de células diferenciadas ES para posterior análise FISH DNA-RNA <ol><li> Remova o meio de diferenciação de culturas de diferenciação, e lavar duas vezes com cultura de células PBS. NOTA: Adicionar PBS com cuidado para evitar que as células serem lavados. </li><li> Retirar cultura celular PBS e fixar as células pela adição de 4% de paraformaldeído (PFA) / PBS, e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. CUIDADO: PFA é tóxico e pode causar risco significativo para a saúde ao ser inalado ou em contato com a pele ou olhos. Além disso, PFA é cancerígeno. </li><li> Retirar 4% PFA / PBS, e lavar 3x lamelas com etanol a 70%. NOTA: lavagem correta é importante, pois qualquer traço de PFA irá interferir com passos PEIXES subseqüentes. As lamelas podem ser armazenados em etanol a 70% a -20 ° C durante vários meses antes de FAnálise ISH. </li></ol> 3. Rotulagem de DNA Sondas para Experimentos PEIXES NOTA: obter um fragmento de DNA do gene de interesse (comprimento mínimo&gt; 2 kb de RNA FISH, ou&gt; 20 kb de DNA FISH) ou a BAC cobrindo o gene de interesse. Para a detecção de ARN, uma sonda de menor pode ser suficiente em comparação com a detecção de ADN, uma vez que a transcrição provavelmente irá resultar em múltiplos transcritos, que podem ser detectadas simultaneamente. Para um sinal forte na única cadeia de ADN exemplar, uma sonda não é necessário, para ser capaz de detectar um número suficiente de haptenos incorporadas. De preferência, uma região genómica não transcrita é escolhido para a concepção da sonda de ADN. Além disso, quando se usa uma sonda para detectar o mais pequeno ARN, que vai ser impedido que o locus genómico a partir do qual o ARN é transcrito está a ser detectado na abordagem PEIXES DNA-RNA, combinados, apesar de este não pode ser totalmente excluído. Para detectar rato Xist, foi utilizada uma sonda de cDNA de 5,5 kb. Para detexão do cromossoma X, várias sondas BAC pode ser usado. Bons resultados têm sido obtidos com uma mistura de BAC RP23-100E1 e BAC CT7-474E4, que estão localizados em estreita proximidade com o locus Xist. Dependendo do gene ou cromossomo de interesse, várias sondas diferentes podem ser necessários para obter os melhores resultados. Sempre que trabalhar com materiais que serão utilizados para o RNA-FISH, utilize pontas estéreis filtro, RNAse livre H 2 O, e trabalhar em um ambiente limpo. <ol><li> Tomar 1 ug de ADN e dilua em H 2 O para um volume total de 16 ul. Adicione 4 mL de solução de etiquetagem digoxigenina ou biotina (ver reagentes), misture por vórtex e incubar a 16 ° C por 90 min. NOTA: A biotina ou nucleotídeos marcados com digoxigenina serão agora incorporadas por nick-translation. </li><li> Enquanto isso, prepare colunas G50 para remover nucleotídeos não-integrados. Tomar uma seringa de 2 ml, remover o batedor, e adicionar de algodão esterilizado para dentro da seringa. Adicionar bolas G50 em solução to preenchimento da seringa, seringa colocar num tubo de 15 ml e centrifugar a 642 xg durante 1 min. NOTA: Cerca de 80% da seringa deve agora ser preenchido com G50. Repita quando menos G50 está presente. </li><li> Após 90 min, adicionar 40 mL de H2O à mistura de reacção de tradução de nick-, e adicionar a reacção para a coluna G50. Adicionar um tubo vazio na coluna, e centrifugar a 642 xg durante 2 min. Recolhe-se o fluxo através de um tubo de reacção. </li><li> Medir o volume do fluxo através de uma pipeta, e adicionar H 2 O para atingir um volume total de 200 ul. Precipitar o fluxo através de adição de 13,3 ul de ADN de esperma de salmão (10 mg / mL), 13,3 mL de tRNA de levedura (10 mg / ml), 26,7 ul de rato Cot-1 DNA (1 mg / ml) e 28 ul de 2 M de NaAc, pH 5.6. Misture em vortex, e adicionar 533 mL de gelo frio etanol 100%. Agitar o tubo, e centrifuga-se a 16.200 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Retirar o sobrenadante, e lave o peletizado duas vezes com etanol a 70%. Centrifugar a 16.200 xg durante 5 min a4 ° C, e o ar seco do sedimento. Adicionar 50 ul de solução de hibridação de 50, e incuba-se a 37 ° C durante 30 minutos para facilitar a dissolução. NOTA: sonda marcada podem ser armazenadas durante vários anos a -20 ° C. ATENÇÃO: 50 + solução de hibridização contém formamida, que é tóxico, pode irritar a pele, os olhos eo sistema respiratório, e também é um teratogênico. </li></ol> 4. Permeabilização, pré-tratamento e de hibridação de células fixas para Combined DNA-RNA FISH <ol><li> Rehidratar células fixadas em lamelas, por remoção de etanol a 70% e a adição da cultura de células de PBS para as placas de 6 poços. Incubar durante 5 min. Repita no total de três vezes. </li><li> Retirar a cultura de células de PBS, e adicionar 0,2% de pepsina para as placas de 6 poços, para permeabilizar as células. Incubar as placas de 6 poços em um banho de água a 37 ° C durante 4 min. Remover pepsina, e inativar com RNAse livre H 2 O. </li><li> Células pós-fixas por incubação com PFA a 4% / PBS durante 5 min à temperatura ambiente. Após FIXAÇÃOem, lavar duas vezes com PBS de cultura de células durante 5 min. </li><li> Desidratar as células por incubação com etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Transferência de lamelas de placas de 6 poços e lamelas secos ar por vários minutos. </li><li> Idade células por incubação de lamelas a 65 ° C durante 1 hora numa placa de calor. </li><li> Pré-sonda hibridizar FISH com rato Cot-1 DNA pela adição de cada lamela para ser analisado, 25 ul de solução de hibridação de 50, 0,5 mL rato Cot-1 DNA, 1 ul de sonda marcada com biotina Xist e 1 ul de digoxigenina sonda BAC rotulado detectar o cromossomo X. Misturar em vortex, e desnaturadas a 99 ° C durante 5 min. Incubar imediatamente a 37 ° C durante 45 minutos, para permitir que Cot-1 DNA que hibridizam para repetir sequências presentes nas sondas. </li><li> Após o envelhecimento, manchar 50 ul de tampão de desnaturação (consistindo de 70% tampão fosfato formamide/2x SSC/10 mM) numa lâmina de vidro, e colocar na parte superior com lamelas de células virada towards o tampão de desnaturação. Incubar a 65 ° C durante 2 min. </li><li> Adicionar lamelas de volta para placas de 6 poços e as células pós-fix, incubando em gelo frio etanol 70% por 5 min. </li><li> Desidratar as células por incubação subsequente em etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Remover lamelas de placas de 6 poços, e deixe secar por alguns minutos. </li><li> Manchar sonda pré-hibridizados em uma lâmina de vidro, e incubar lamela por cima. Colocar as lâminas em uma câmara humidificada cheio com 50 ml de 50% formamide/2x SSC, e incubar durante a noite a 37 ° C. </li></ol> 5. Lavagens pós-hibridação e o anticorpo de detecção da sonda mediada <ol><li> Preencha placas de 6 poços com 2x SSC, e pré-quente até 42 ° C. Adicionar lamelas após incubação durante a noite, e incuba-se a 42 ° C durante 5 min. </li><li> Retirar 2x SSC, e incubar lamelas com 50% formamide/2x SSC durante 10 min a 42 ° C. Repetir um total de 3 vezes (30 min de lavagem completamente). </li&gt; <li> Retirar 50% formamide/2x SSC, e lavagem das lâminas com Tris-salino-Tween (TST) em 2 x 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Mancha 50 ul de Tris-salino-BSA (TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o bloqueio durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado. </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Mancha 50 ul de anticorpo de ovelha anti-DIG (1:500 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o primeiro passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado. </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Mancha 50 ul de anticorpo de coelho anti-ovelha conjugado com FITC (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o segundo passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificada . </li><li> Transfer lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Mancha 50 ul de anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com FITC (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o terceiro passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificada . </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Mancha 50 ul de rato-anti-biotina anticorpo (1:200 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o quarto passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara escura TST-humidificado. </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Mancha 50 ul de anticorpo de burro anti-ratinho conjugado com rodamina (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o quinto passo de incubação durante 30 min à temperatura ambiente em um chamb escuro TST-humidificadoer. </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. </li><li> Ponto 50 ul de anticorpo de cabra anti-cavalo conjugado com rodamina (1:250 em TSBSA) por lamela em novas lâminas de vidro, e incubar lamelas de cabeça para baixo para o sexto passo de incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente em câmara escura TST-umidificado . NOTA: o anticorpo de cabra anti-cavalo vai reconhecer o anticorpo anti-burro-rato; quando disponível para o pesquisador, um anticorpo de cabra anti-burro vai funcionar tão bem. </li><li> Transferência de lamelas de volta para placas de 6 poços e lavar 2 x 5 min com TST. Lavar mais 5 min com Tris-salino (TS). </li><li> Desidratar as células por incubação subsequente em etanol a 70% durante 3 min, 90% de etanol durante 3 minutos e etanol a 100% durante 3 min. Remover lamelas de placas de 6 poços, e deixe secar por alguns minutos. </li><li> Manchar uma gota de meio de montagem com DAPI (ver reagentes) em uma lâmina de vidro, e adicionar lamela de cabeça para baixo em cima. Selar os slides com esmalte de unha eavaliar os resultados de FISH por microscopia fluorescente (Figura 1). </li></ol>

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<li>Chaumeil, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+immunofluorescence%2C+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization%2C+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes%2C+transcriptional+activity%2C+nuclear+organization%2C+and+X-chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Combinado DNA-RNA FISH pode ser tecnicamente desafiadora, como condições adequadas para DNA FISH pode ser muito dura para moléculas de RNA menos estáveis. Várias abordagens têm sido aplicadas para estudar ambos o ADN e ARN na mesma célula, evitando a necessidade de incubação simultânea com as sondas de detecção, tanto o ADN e ARN. Por exemplo, numa abordagem de sobreposição, primeiro RNA FISH é realizada, e as células são gravadas, e as coordenadas sejam tomadas. Subsequentemente, os mesmos são utilizados para lâminas d...

Estudando as células e tecidos por meio de hibridação in situ fluorescente (FISH) tem, desde a sua introdução no final de 1970 um, permitiu aos pesquisadores estudar genes, organização da cromatina e expressão gênica em nível subcelular. PEIXES DNA é freqüentemente usada em citogenética, cariótipo 2, diagnósticos de câncer 3 e rastreamento genético pré-implantação 4, e tem um papel importante na investigação molecular 5-6, uma vez que permite a detecção de ácidos nucleicos em seu ambiente nativo. Análise de expressão de célula única de RNA FISH pode detectar transcrições primárias nativas e RNAs não-codificantes sendo transcrita de cromossomos, e oferece vantagens a outras técnicas que avaliam a expressão de genes em nível populacional, incluindo, por exemplo, RT-PCR quantitativo, o genoma análise de expressão larga ou Northern blotting . Ao visualizar transcrições de RNA originários diretamente de seus locais de origem, tem sido, por exemplo,notado que a expressão do gene é estocástico 7, e às vezes pode ser alelo específico 8. Melhorias na técnica têm ainda permitiu a detecção e quantificação de moléculas de mRNA de células individuais dentro de 9-11. O princípio básico de FISH consiste de hibridização de ácidos nucleicos no interior da célula a uma sonda de ácido nucleico, por meio de altamente específica de Watson e Crick emparelhamento de bases. A sonda pode estar directa ou indirectamente detectado, resultando num sinal que pode ser visualizado microscopicamente. As tentativas iniciais consistiam de sondas radioativamente marcados, que tiveram inconvenientes com base em questões de segurança, limitada resolução espacial ea capacidade de detectar um único alvo de cada vez 12-14. O subsequente desenvolvimento de marcadores não radioactivos, incluindo fluorocromos, haptenos e enzimas, permitiu o uso generalizado de FISH como uma técnica de biologia molecular de rotina. A sonda de FISH pode ser diretamente rotulados com fluorochromes por ligação química de moléculas fluorescentes para sequências de ácido nucleico e 15 a integração de nucleótidos marcados com fluorescência 16-19, ou a sonda pode ser indirectamente visualizadas após integração de haptenos (incluindo biotina e digoxigenina) e detecção imunológica de haptenos por anticorpos específicos de hapteno conjugado com repórter fluorescente moléculas 20-21. A última abordagem permite a amplificação do sinal, utilizando várias camadas de anticorpos marcados com fluorescência que são usados ​​para melhorar o sinal original, e permite a detecção de espécies de ARN que são expressos em níveis baixos. Através da combinação de técnicas de rotulagem diretos e indiretos e vários haptenos, vários alvos podem ser visualizadas simultaneamente na mesma célula. Um dos passos mais importantes protocolos de peixe é a hibridização da sonda ao seu alvo. Embora, em teoria, uma sonda vai ligar especificamente apenas com o seu alvo, na prática, esta especificidadenão é sempre conseguido, como sondas podem ligar-se a regiões homólogas, e as condições de hibridização não será sempre ideal para uma determinada espécie de região de DNA ou de RNA. As lavagens pós-hibridação são, portanto, de particular importância, uma vez que podem aumentar o rigor do procedimento FISH, e pode impedir a ligação não específica de sondas FISH, o que resultaria num elevado nível de ruído de fundo. Como moléculas de ARN são de cadeia simples que pode ser facilmente hibridado com uma sonda de FISH. Em contraste, a molécula de ADN de cadeia dupla deve em primeiro lugar um passo de desnaturação, após o que uma sonda pode hibridizar. Isto é geralmente conseguido por meio de aquecimento da amostra, o que resulta em desnaturação do ADN. No entanto, sob essas condições adversas, frágeis, único moléculas de ARN de cadeia pode ser perdida. Portanto, o ADN-ARN combinados FISH requer optimização significativo das condições, e é tecnicamente mais difícil em comparação com a detecção separada de apenas RNA ou DNA. Aqui nós apresenta protocolo detalhado do combinado, simultânea FISH DNA-RNA, que nos permitiu estudar inativação do cromossomo X (ICX) na diferenciação de rato fêmea células-tronco embrionárias 22-24. XCI é um mecanismo epigenético crucial para o desenvolvimento embrionário fêmea 25, e os resultados em heterochromatinization e, portanto, o silenciamento de um dos dois cromossomas X em indivíduos do sexo feminino 26-27. Essencial para esse processo é a não-codificante RNA Xist 28-30, que é regulada pelos 24 proteínas RNF12 22-23 e Rex1. Expressão Xist torna-se regulada no futuro cromossomo X inativo (Xi) durante o desenvolvimento embrionário ou a diferenciação de células ES in vitro , e pode se espalhar ao longo do cromossomo X e, assim, atrair cromatina remodelação enzimas que resultam na paralisação da transcrição do cromossomo X 31. Esta propagação de Xist ARN pode ser visualizado por FISH ARN como revestimento de cromo Xalguns, que também é referida como uma nuvem Xist. Como as células ES femininos pode perder um de seus cromossomos X, devido à instabilidade genômica, nós e outros têm utilizado combinado DNA-RNA FISH para estudar XCI, para certificar-se de que as células só cariótipo estáveis ​​são avaliados na análise deste importante processo 22,32 -34. Tal como acontece com todas as técnicas de biologia molecular, vários protocolos diferentes excelentes foram publicados 35-38. Aqui apresenta-se a método, a partir da indução de diferenciação em células ES de ratinho, a fixação das células, a rotulagem de sondas FISH por Nick-translation, pré-tratamento de células fixas para permitir a permeabilização e subsequente absorção de sonda, a hibridação da sonda com o alvo, e, finalmente, a detecção da sonda por meio de anticorpos marcados com fluorescência. O protocolo aqui apresentado permite a detecção fiel de Xist RNA eo cromossomo X, no prazo de dois dias, e os princípios básicos desta técnica pode provavelmente ser adaptado para otseus sistemas e áreas de pesquisa.

<table><tbody><tr>células-tronco <td></td><td></td><td>embrionárias de camundongos fêmeas</td><td>serão disponibilizadas mediante solicitação</td></tr><tr><td>os fibroblastos embrionários de camundongos</td><td></td><td></td><td>podem ser derivados de embriões E13.5 ou por meio de fontes comerciais por exemplo Meio</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>de cultura de células Millipore ESDMEM, soro fetal de bezerro a 15%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, aminoácidos não essenciais, -mercaptoetanol 0,1 mM &#947;, e 1.000 U/ml de LIF. Filtre esterilize e armazene a 4 &#176; C por no máximo 2 semanas.</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960085</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal para Bezerros</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina&ndash; estreptomicina (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&#947;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>ES meio</td><td></td><td></td> de diferenciação celular <td>IMDM-Glutamax, soro fetal de bezerro inativado por calor a 15%, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 mg/ml, aminoácidos não essenciais, 37,8 &#956; l/L monotioglicerol e 50 &#956; g/ml de ácido ascórbico</td></tr><tr><td>IMDM-Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>31980-030</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico (50 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>monotioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>T25 placas de cultura de células</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 6 poços</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>grau de cultura celular PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25% (v/v) tripsina/0,2% (p/v) EDTA em PBS</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas 24 x 24 mm Gelatina</td><td>de 780882</td><td></td><td>Menzle</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>prepara uma solução de gelatina/cultura de células PBS a 0,2% e autoclave</td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7000</td><td>Diluir a 0,2% em HCl 0,01 M (pH 2,0)</td></tr> <tr><td>100% etanol absoluto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32221-2.5L</td><td>usa 100% etanol absoluto e água livre de RNAse para fazer soluções de etanol 70% e 90%</td></tr> Água <tr><td>livre de RNAse</td> Pontas <td>de</td> filtro estéreis <td>Baxter</td> TKF7114 <td></td></tr><tr><td>Rainin</td><td>Bio Clean</td><td>GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F</td><td></td></tr><tr><td>kit de marcação de digoxigenina (tradução DIG-Nick)</td><td>Kit</td> de marcação de biotina <td>Roche 11745816910</td><td></td></tr><tr><td>(tradução Biotin Nick)</td><td>Roche</td><td>11745824910</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5080</td><td></td></tr><tr><td>seringa de 2 ml</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>algodão</td><td></td><td></td><td></td>esterilizado</tr><tr><td>Eppendorf tubos Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>tRNA de levedura 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15401-029</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>berço de camundongo-1 DNA 1 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de bancada Eppendorf</td><td></td><td>Modelo 5417R</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrífuga refrigerada Eppendorf</td><td></td><td>Modelo 5810R</td><td></td></tr><tr><td>2 M NaAc, pH 5,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>50+ solução</td><td></td><td></td> de hibridização <td>50% formamida, 2x SSC, tampão fosfato 50 mM pH 7, 10% sulfato de dextrano pH 7</td></tr><tr><td>formamida</td><td>Acros organics</td><td>3272350000</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de dextrano</td><td>Fluka</td><td>31403</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato 10 mM, pH 7</td><td></td><td></td><td>adicionar 57,7 ml de 1 M Na2HPO4 e 42,3 ml de 1 M NaH2PO4; use água tratada com DEPC e</td></tr><tr>tampão <td></td><td></td><td>de desnaturação</td> em autoclave <td>70% formamida/2x SSC/10 mM tampão fosfato pH 7</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>2 M Tris pH 7,5 solução</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solução Tris-salina-Tween solução de lavagem (TST)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10x solução salina, 50 ml 2M Tris, 500 &#956; l Tween-20, adicione água livre de RNAse até 1 L</td></tr><tr><td>de solução</td><td></td><td></td> salina 10x <td>dissolver 85 g de NaCl em 1 L de H2O livre de RNAse e autoclave</td></tr><tr><td>Tris-salina-BSA (TSBSA)</td><td></td><td></td><td>500 &#956; l 10x solução salina, 250 &#956; l 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml de RNAse livre de H2O</td></tr><tr><td>BSA, purificado, 100x</td> anticorpo anti-escavação de ovelhas <td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr> Os <tr><td></td><td>diagnósticos da</td><td></td> Roche <td>usam 1:500 diluído em anticorpo anti-ovelha de coelho TSBSA</td></tr><tr><td>conjugado com FITC</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td>usam 1:250 diluído em anticorpo anti-coelho de cabra TSBSA</td></tr><tr><td>conjugado com FITC</td><td>Jackson os</td><td></td> laboratórios <td>usam 1:250 diluído em</td></tr><tr><td>anticorpo anti-biotina de camundongo</td> TSBSA <td>Os diagnósticos da</td><td></td> Roche <td>usam 1:200 diluído em anticorpo anti-camundongo de burro TSBSA</td></tr><tr><td>conjugado com Rhodamine</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>usam 1:250 diluído em TSBSA</td></tr><tr><td>anticorpo anti-cavalo de cabra conjugado com Rhodamine</td><td>Jackson labs</td><td></td><td>usam 1:250 diluído em TSBSA</td></tr><tr><td>Solução de lavagem trissalina (TS)</td><td></td><td></td><td>10 ml de solução salina 10x, 5 ml de Tris 2 M, 85 ml de meio de montagem Vectashield H2O livre de RNAse</td></tr><tr><td>com verniz</td><td></td><td></td> de unhas DAPI Vectorlabs H-1200 <td></td></tr><tr><td>miscroscópio</td><td></td><td></td><td></td> fluorescente</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna-rna combinado fluorescente<em&gt; em situ</em&gt; a hibridização (fish) para estudar inativação do cromossomo x em diferenciada feminino rato células-tronco embrionárias

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Hibridização in situ fluorescente (FISH) é uma técnica molecular que permite a detecção de ácidos nucleicos em células. PEIXES DNA é frequentemente usado em citogenética e diagnóstico de câncer, e pode detectar aberrações do genoma, que muitas vezes tem importantes implicações clínicas. ARN FISH pode ser utilizado para detectar as moléculas de RNA nas células e proporcionou perspectivas importantes na regulação da expressão do gene. Combinando DNA e RNA FISH dentro da mesma célula é tecnicamente desafiador, como condições adequadas para DNA FISH pode ser muito dura para frágeis, único moléculas de ARN de cadeia. Temos aqui apresentam um protocolo facilmente aplicável, que permite que o conjunto, a detecção simultânea de Xist RNA e DNA codificado pelos cromossomas X. Este protocolo FISH DNA-RNA combinado pode provavelmente ser aplicada a outros sistemas em que tanto o ARN e ADN precisam ser detectado.

Usando o protocolo acima mencionado para combinado ADN-ARN FISH, temos sido capazes de visualizar X inactivação do cromossoma na diferenciação de células estaminais embrionárias fêmeas. Figura 1 mostra um exemplo representativo de uma experiência FISH de ADN-ARN, em que foram detectados tanto Xist (que é visível como uma chamada Xist RNA nuvem no cromossomo X inativo e um pontinho de transcrição basal no cromossomo X ativo), e uma região do cromossomo X, que é visível como um sinal de ...

Hibridização in situ fluorescente (FISH), permite a detecção de ácidos nucleicos no seu ambiente nativo dentro das células. Nós aqui descrever um protocolo para o combinado, a detecção simultânea de RNA e DNA, por meio de FISH, que pode ser usado para estudar inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias.

DNA-RNA combinado fluorescente<em&gt; Em situ</em&gt; A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias de camundongo fêmea diferenciadas por meio da hibridização fluorescente combinada simultaneamente de DNA e RNA em duas hibridizações ou FISH de DNA-RNA. Isso é realizado primeiramente induzindo a diferenciação em células-tronco embrionárias de camundongo fêmea. Como durante esse processo, que simula o desenvolvimento embrionário normal pós-implantação, a inativação do cromossomo X é iniciada, resultando no aumento da transcrição e no acúmulo de RNA-Xist, codificado pelo futuro cromossomo X inativo.O segundo passo é fixar as células-tronco embrionárias diferenciadas utilizando paraformaldeído. Em seguida, prepare as sondas para detectar tanto o DNA do cromossomo X quanto o RNA de cisto, marcando fragmentos de DNA com biotina ou digoxigenina por meio da tradução de nick.O passo final é realizar o procedimento FISH de DNA-RNA. As células-tronco embrionárias diferenciadas são permeabilizadas, desnaturadas e hibridizadas com as sondas marcadas, que posteriormente são detectadas usando anticorpos conjugados com fluorescência que reconhecem a biotina ou a digoxigenina nos haptenos. Por fim, a microscopia de imunofluorescência é utilizada para mostrar a localização dos dois cromossomos em células femininas e para visualizar a expressão do RNA cístico do cromossomo X que sofre inativação.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como os métodos FISH, nos quais o RNA e o DNA são detectados sequencialmente, é que, utilizando o nosso protocolo, somos capazes de detectar simultaneamente ambos os tipos de ácidos nucleicos no mesmo espécime em menos de dois dias. Embora a combinação de FISH de DNA e RNA possa ser desafiadora de realizar, uma vez que as condições ideais para detectar DNA ou RNA diferem significativamente. Utilizando o protocolo aqui apresentado, somos capazes de detectar RNA existente e DNA derivados de ambos os cromossomos X em praticamente todas as células analisadas.Isso permitiu-nos estudar a inativação do cromossomo X enquanto ela ocorre durante a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas ou no desenvolvimento anômalo de camundongos fêmeas. Embora este método possa fornecer informações sobre o processo de inativação do X, um processo importante e fascinante que ocorre durante o desenvolvimento embrionário inicial do camundongo, ele provavelmente também pode ser aplicado a outros sistemas biológicos nos quais é importante detectar transcritos de RNA derivados da cromatina nativa, uma vez que os RNAs não codificantes estão sendo cada vez mais valorizados por sua importância em sistemas biológicos, e abordagens em nível de célula única frequentemente são preferidas em relação a abordagens alternativas nas quais populações inteiras de células são avaliadas. Prevemos que este protocolo será útil para uma ampla comunidade científica.Células-tronco embrionárias de camundongo fêmeas ou E ESL são cultivadas sob condições padrão de ESL em placas de cultura recobertas com gelatina e fibroblastos embrionários de camundongo ORMs para iniciar o procedimento de indução da diferenciação. Remova o meio de ES da cultura de ESL e lave duas vezes com PBS de cultura celular. Adicione 1,5 mililitros de TRIPSINA EDTA pré-aquecido a 37 graus Celsius e incube as células a 37 graus Celsius por sete minutos. Após 3,5 minutos, agite suavemente a placa para dissociar as colônias.Inative a tripsina EDTA adicionando 3,5 mililitros de meio de diferenciação às células, pipete as células para cima e para baixo para obter uma solução de células isoladas e colete-as em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue por cinco minutos a 200 Gs. Após coletar as células em 10 mililitros de meio de diferenciação, adicione a suspensão celular a uma placa de cultura de 10 centímetros não gelatinizada e incube por uma hora. Em um incubador de cultura celular, as células MES serão capazes de aderir à placa de cultura não gelatinizada, enquanto as células ES permanecerão em suspensão.Enquanto isso, coloque lâminas de vidro estéreis em placas de seis poços, adicione gelatina a 0,2% e incube por um mínimo de cinco minutos. À temperatura ambiente, após uma hora, colete o sobrenadante da cultura prévia de ESLs, que consistirá principalmente de ESLs não aderentes. Após diluir os ESLs, plaque-os em placas de seis poços contendo lâminas. Inicie este procedimento removendo o meio de diferenciação das culturas de diferenciação e lavando duas vezes com PBS para cultura celular. Certifique-se de adicionar o PBS cuidadosamente para evitar que as células sejam removidas. Fixe as células adicionando PBS com paraformaldeído 4% e incubando por 10 minutos à temperatura ambiente.Após 10 minutos, remova o paraformaldeído e lave as lamínulas três vezes com etanol 70%. Para preparar as sondas de DNA para marcação, dilua primeiro um micrograma de cada DNA respectivo em água, em um volume total de 16 microlitros. Em seguida, adicione quatro microlitros da solução de marcação com oxigenina ou biotina, misture por vortex e incube a 16 graus Celsius por 90 minutos.Isso incorporará os nucleotídeos marcados com biotina ou digoxigenina por meio da tradução NIC. Enquanto isso, prepare colunas G 50. Para remover os nucleotídeos não incorporados, pegue uma seringa de dois mililitros, remova o êmbolo e adicione algodão esterilizado dentro da seringa.Adicione as esferas G 50 e solução para preencher a seringa. Em seguida, coloque a seringa em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrifugue a 642 ×g por um minuto. Após a centrifugação, aproximadamente 80% da seringa deve estar preenchida com G 50. Após 90 minutos, adicione 40 microlitros de água a cada mistura de reação de tradução NIC e transfira a reação para a coluna G 50.Adicione um tubo vazio sob a coluna e centrifugue a 642 Gs por dois minutos. Colete o fluxo passante em um tubo de reação. Meça o volume do fluxo passante com uma pipeta e, em seguida, adicione água para atingir um volume total de 200 microlitros.Para precipitar o fluxo, adicione DNA de esperma de salmão, TRNA de levedura, DNA de camundongo capturado em 1D NA e acetato de sódio 2 M, misturando por vortex. Adicione 533 microlitros de etanol a 100% gelado e agite o tubo. Centrifugue a 16.200 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Ao final da centrifugação, remova o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com etanol 70%, centrifugando a 16.200 ×g por cinco minutos a quatro graus Celsius, e seque o pellet ao ar.Quando o pellet estiver seco, adicione 50 microlitros, uma solução híbrida de 50 mais, e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para facilitar a dissolução antes da permeabilização, reidrate as células fixadas descobrindo-as removendo o etanol a 70% e adicionando PBS de cultura celular às células.Incube por cinco minutos, repetindo um total de três vezes para permeabilizar as células. Remova o PBS do cultivo celular e adicione pepin 0,2% às placas de seis poços. Incube as placas em banho-maria a 37 graus Celsius por quatro minutos.Depois disso, remova o pepino e inative com água livre de RNA. Pós-fixe as células incubando-as com PBS contendo 4% de paraformaldeído por cinco minutos em temperatura ambiente; após a fixação, lave duas vezes com meio de cultura celular ou PBS por cinco minutos. Desidrate as células incubando com etanol 70% por três minutos, etanol 90% por três minutos e etanol 100% por três minutos.Em seguida, transfira as lamínulas para fora das placas de seis poços e seque-as por vários minutos. Envelheça as células incubando as lamínulas a 65 graus Celsius por uma hora em uma placa aquecedora. Enquanto isso, pré-hibridize as sondas FISH com o revestimento de camundongo 1D NA adicionando-os juntos para cada lamínula a ser analisada.25 microlitros de solução de hibridização 50 plus. Um microlitro da sonda marcada com biotina Cyst, um microlitro da sonda BAC marcada com digoxigenina detectando o cromossomo X e 0,5 microlitros de DNA cot-1 de camundongo misturados por vortex e desnaturados a 99 graus Celsius por cinco minutos. Incubar imediatamente a 37 graus Celsius por 45 minutos para permitir que o DNA cot-1 hibridize com as sequências repetidas presentes na sonda.Uma vez que as células nos lamínulas tenham envelhecido, coloque 50 microlitros de tampão de desmaturação sobre uma lâmina de vidro e posicione as lamínulas por cima, com as células voltadas para o tampão de desmaturação. Incube a 65 graus Celsius por dois minutos. Pós-fixe as células transferindo as lamínulas de volta para as placas de seis poços previamente preenchidas com etanol gelado a 70% e incube por cinco minutos.Desidrate as células por meio de incubação subsequente em etanol 70% por três minutos, etanol 90% por três minutos e etanol 100% por três minutos. Remova as lamínulas das placas de seis poços e deixe secar ao ar por vários minutos. Coloque o sonda pré-hibridizada sobre uma lâmina de vidro e coloque uma lamínula em cima para incubação.Coloque as lâminas em uma câmara umidificada contendo 50 mililitros de 50%IDE em dois XSSC e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação durante a noite, transfira as lamínulas das lâminas de vidro para placas de seis poços que foram preenchidas com dois XSSC pré-aquecidos a 42 graus Celsius. Incube a 42 graus Celsius por cinco minutos.Remova dois XSSC e adicione 50%form MI dois XSSC. Incube por 10 minutos a 42 graus Celsius. Lave com 50%form IDE dois X-S-S-C-A, no total de três vezes, por 10 minutos a 42 graus Celsius por lavagem.Após a terceira lavagem, remova a 50% form a partir do meu dois XSSC e lave as lâminas com tris salina tween ou TST duas vezes por cinco minutos à temperatura ambiente para o bloqueio. Adicione 50 microlitros de tris salina BSA ou T-S-P-S-A. Coloque a lamínula sobre lâminas de vidro novas e posicione as lamínulas de cabeça para baixo sobre a lâmina de vidro, incubando por 30 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida escura com TST. Após 30 minutos, transfira as lamínulas de volta para as placas de seis poços e lave duas vezes por cinco minutos com TST para a incubação do primeiro anticorpo. Adicione 50 microlitros de anticorpo e antígeno de ovelha por lamínula em lâminas de vidro novas, coloque as lamínulas de cabeça para baixo sobre a lâmina de vidro e incube por 30 minutos à temperatura ambiente em uma câmara úmida escura com TST.Posteriormente, as lamínulas são incubadas com uma série de anticorpos marcados com fluoróforos para realçar o sinal original, conforme detalhado no manuscrito suplementar. Após a incubação com uma série de anticorpos marcados com fluoróforos, desidrate as células por meio de incubação de três minutos cada em etanol 70%, etanol 90% e etanol 100%. Remova as lamínulas das placas de seis poços e deixe secar ao ar por vários minutos.Por fim, aplique uma gota de meio de montagem com dappy em cada lâmina de vidro. Adicione uma lamínula com o lado invertido para cima e selar as lâminas com esmalte de unha. Utilizando este protocolo de FISH combinado de DNA-RNA, a inativação do cromossomo X pode ser visualizada em células ES femininas em diferenciação.Esta figura mostra um exemplo representativo de um experimento A-D-N-A-R-N-A fish no qual o RNA do cisto e uma região do cromossomo X são detectados simultaneamente. O RNA do cisto é um RNA não codificante essencial para o processo de inativação do cromossomo X. Em ESL femininas em diferenciação, o RNA do cisto é detectado utilizando uma sonda de CD NA marcada com biotina, que é visualizada por meio de anticorpos conjugados à rumina e indicada em vermelho.O cromossomo X é detectado usando uma sonda BAC marcada com xigen, que é visualizada por meio de anticorpos conjugados à FITC indicados em verde; os núcleos são contra-estainados com DPI indicado em azul. Em quase todas as células, dois cromossomos X são detectados. São detectados tanto grandes acúmulos de cistos nas cromatina sexual, ou nuvens de cistos, quanto expressão basal de cistos no cromossomo X ativo, ou pontos de cistos.Os pontos precisos de cisto não são detectados em todos os núcleos porque, durante a diferenciação, essa expressão basal de cisto é interrompida no cromossomo X futuro ativo. Observe que alguns dos sinais pontuais derivados do cromossomo X estão localizados dentro das nuvens de cisto, demonstrando assim que a nuvem de cisto realmente se localiza ao longo e codifica o cromossomo X. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de dois dias e com um resultado confiável, se for executada corretamente.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como induzir a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo fêmea, como fixar essas células e como prepará-las para permitir a realização do teste combinado D-N-A-R-N-A fish. Lembre-se de que é importante para o sucesso dos seus experimentos manter as temperaturas e os tempos de incubação constantes, conforme indicado neste protocolo. Além disso, é fundamental trabalhar em um ambiente limpo.Se você estiver usando um tipo celular diferente ou estudando um sistema biológico distinto, algumas otimizações podem ser necessárias para fornecer um resultado ideal. Boa sorte com seus experimentos.

combined-dna-rna-fluorescent-situ-hybridization-fish-to-study-x

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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