DNA-RNA combinado fluorescente Em situ A hibridização (FISH) para estudar inativação do cromossomo X em Diferenciada Feminino Rato Células-Tronco Embrionárias

O objetivo geral deste procedimento é estudar a inativação do cromossomo X em células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas diferenciadas por meio de DNA e RNA fluorescentes combinados simultaneamente em peixes de hibridização C dois ou D-N-A-R-N-A. Isso é feito primeiro induzindo a diferenciação em células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas. Como durante esse processo, que simula o desenvolvimento embrionário normal pós-implantação, a inativação do cromossomo X é iniciada, resultando em transcrição aprimorada e acúmulo de RNA do cisto, codificando o futuro cromossomo X inativo.

O segundo passo é fixar as células-tronco embrionárias diferenciadas usando paraldeído. Em seguida, prepare as sondas para detectar o DNA do cromossomo X e do RNA do cisto, marcando fragmentos de DNA com biotina ou digo genina. Usando a tradução do Nick.

A etapa final é realizar o procedimento D-N-A-R-N-A FISH. As células-tronco embrionárias diferenciadas são permanentes, desnaturadas e hibridizadas com as sondas de peixe marcadas, que são posteriormente detectadas usando anticorpos conjugados fluorescentes que detectam a biotina ou diggen em haps. Em última análise, a microscopia imunofluorescente é SU para mostrar a localização dos dois cromossomos nas células femininas e para visualizar a expressão do RNA do cisto do cromossomo X que sofre inativação.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos, como os métodos FISH, onde o RNA e o DNA são posteriormente detectados, é que, usando nosso protocolo, somos capazes de detectar os dois tipos de ácido nucléico simultaneamente na mesma amostra em menos de dois dias. Embora os peixes combinados de DNA e RNA possam ser difíceis de executar, pois as condições ideais para detectar DNA ou RNA diferem significativamente. Usando o protocolo aqui apresentado, somos capazes de detectar a existência de RNA e DNA derivados de ambos os cromossomos X em praticamente todas as células analisadas.

Isso nos permitiu estudar o cromossomo X em ativação, pois está acontecendo durante a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas ou desenvolvimento anormal de camundongos fêmeas. Embora este método possa fornecer informações sobre o X no processo de ativação, que é um processo importante e fascinante que ocorre durante o desenvolvimento embrionário inicial do camundongo, ele provavelmente também pode ser aplicado a outros sistemas biológicos onde é importante detectar transcritos de RNA que são derivados da cromatina nativa, pois os RNAs não codificantes estão sendo cada vez mais apreciados pela importância em sistemas biológicos e, muitas vezes, as abordagens de célula única são favorecidas em relação a abordagens alternativas onde populações inteiras de células estão sendo avaliadas. Prevemos que este protocolo será útil para uma ampla comunidade científica.

Células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas ou E ESL são cultivadas sob condições padrão de ESL em placas de cultura gelatinizadas revestidas com fibroblastos embrionários de camundongo ORMs para iniciar o procedimento de indução de diferenciação. Remova o meio ES da cultura ESL e lave duas vezes com cultura de células PBS Adicione 1,5 mililitros de TRIPSIN EDTA pré-aqueça a 37 graus Celsius e incube as células a 37 graus Celsius por sete minutos. Após 3,5 minutos, agite o prato suavemente para quebrar as colônias.

Inative a tripsina EDTA adicionando 3,5 mililitros de meios de diferenciação às células, pipete as células para cima e para baixo para obter uma solução de célula única e colete-as em um tubo de 15 mililitros. Gire por cinco minutos a 200 Gs.Depois de coletar células em 10 mililitros de meio de diferenciação, adicione a suspensão celular a uma placa de cultura não gelatinizada de 10 centímetros e incube por uma hora. Em uma incubadora de cultura de células, o MES será capaz de aderir à placa de cultura não gelatinizada, enquanto as células ES permanecerão em suspensão.

Enquanto isso, coloque lamínulas de vidro estéril em seis placas de poço, adicione 0,2% de gelatina e incube por no mínimo cinco minutos. À temperatura ambiente após uma hora, colete o snat da cultura ESL prepl, que consistirá principalmente em ESLs não aderentes. Depois de diluir a placa E ESLs em seis placas de poço contendo lamínulas.

Comece este procedimento removendo o meio de diferenciação das culturas de diferenciação e lavando duas vezes com PBS de cultura de células. Certifique-se de adicionar PBS com cuidado para evitar que as células sejam lavadas. Fixe as células adicionando 4% de formaldeído PBS e incubando por 10 minutos em temperatura ambiente.

Após 10 minutos, remova o paraformaldeído e lave as lamínulas três vezes com etanol a 70%. Para preparar as sondas de DNA para rotulagem, primeiro dilua um micrograma de cada respectivo DNA em água em um volume total de 16 microlitros. Em seguida, adicione quatro microlitros de solução de marcação de genin de boi ou biotina misturada por vórtice e incube a 16 graus Celsius por 90 minutos.

Isso incorporará os nucleotídeos marcados com biotina ou oxigênio por tradução NIC. Enquanto isso, prepare as colunas G 50. Para remover nucleotídeos não integrados, pegue uma seringa de dois mililitros, remova o carimbo e adicione algodão esterilizado na seringa.

Adicione as bolas G 50 e a solução para encher a seringa. Em seguida, coloque uma seringa em uma centrífuga de tubo de 15 mililitros a 642 GS por um minuto. Após a centrifugação, aproximadamente 80% da seringa deve ser preenchida com G 50 Após 90 minutos, adicione 40 microlitros de água a cada mistura de reação de tradução NIC e transfira a reação para a coluna G 50.

Adicionar um tubo vazio por baixo da coluna e centrifugar a 642 Gs durante dois minutos. Colete o fluxo em um tubo de reação. Meça o volume do fluxo com uma pipeta e adicione água até atingir um volume total de 200 microlitros.

Para precipitar o fluxo, adicione esperma de salmão, camundongo TRNA de levedura de DNA capturado 1D NA e acetato de sódio de dois molares misturado por vórtice. Adicione 533 microlitros de etanol 100% gelado e agite a centrífuga tubular a 16.200 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Ao final da centrifugação, remova o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com centrífuga de etanol a 70% a 16.200 Gs por cinco minutos a quatro graus Celsius e seque o pellet ao ar.

Quando o pellet está seco. Adicione 50 microlitros, uma solução de hibridização de mais de 50 e incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Para facilitar a dissolução antes da permeação, reidratar as células fixas, descubra deslizamentos removendo o etanol a 70% e adicionando PBS de cultura de células às células.

Incube por cinco minutos, repita um total de três vezes para mobilizar as células. Remova o PBS da cultura de células e adicione 0,2% de pepina às seis placas de poço. Incube as placas em banho-maria a 37 graus Celsius por quatro minutos.

Depois disso, remova a pepina e inative com água livre de RNA. Fixe as células incubando-as com 4% de aldeído paraforme PBS por cinco minutos à temperatura ambiente após a fixação, lave duas vezes com cultura de células ou PBS por cinco minutos. Desidrate as células incubando com etanol a 70% por três minutos, etanol a 90% por três minutos e cem por cento de etanol por três minutos.

Depois disso, transfira as lamínulas das seis placas de poço e seque as lamínulas por vários minutos. Envelheça as células incubando as lamínulas a 65 graus Celsius por uma hora em uma placa quente. Enquanto isso, sondas de peixes pré-hibridizadas com revestimento de camundongo 1D NA, somando para cada lamínula a ser analisada.

25 microlitros de solução de hibridização de mais de 50. Um microlitro de biotina marcada com cisto Sonda um microlitro de oxigênio digo e sonda BAC marcada detectando o cromossomo X e 0,5 microlitros de revestimento de camundongo 1D NA misturado por vórtice e na natureza a 99 graus Celsius por cinco minutos. Incube imediatamente a 37 graus Celsius por 45 minutos para permitir que o berço 1D NA hibridize para repetir as sequências presentes na sonda.

Depois que as células das lamínulas envelhecerem, coloque 50 microlitros de tampão de dematuração em uma lâmina de vidro e coloque as lamínulas em cima das células voltadas para o tampão de dematuração. Incube a 65 graus Celsius por dois minutos. Fixe as células transferindo as lamínulas de volta para as placas de seis poços pré-preenchidas com etanol a 70% e incube por cinco minutos.

Desidrate as células por incubação subsequente em etanol a 70% por três minutos, etanol a 90% por três minutos e etanol a 100% por três minutos. Remova as lamínulas das placas de seis poços e deixe-as secar ao ar por vários minutos. Coloque a sonda pré-hibridizada em uma lâmina de vidro e incube uma lamínula na parte superior.

Coloque as lâminas em uma câmara umidificada com 50 mililitros de 50% IDE dois XSSC e incube durante a noite a 37 graus Celsius. Após a incubação noturna, transfira as lamelas de vidro para seis placas de parede que foram preenchidas com dois XSSC pré-aquecidos a 42 graus Celsius. Incube a 42 graus Celsius por cinco minutos.

Remova dois XSSC e adicione 50% de MI dois XSSC. Incube por 10 minutos a 42 graus Celsius. Lave com 50% de forma IDE dois X-S-S-C-A no total de três vezes por 10 minutos a 42 graus Celsius por lavagem.

Após a terceira lavagem, remova o 50% dos meus dois XSSC e lave as lâminas com interpolação trissalina ou TST duas vezes por cinco minutos em temperatura ambiente para bloquear 50 microlitros de tris salina BSA ou TSPSA. Sua lamínula em novas lâminas de vidro e coloque as lamínulas de cabeça para baixo na lâmina de vidro incube por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara escura umidificada TST. Após 30 minutos, transfira as lamínulas de volta para as placas de seis poços e lave duas vezes por cinco minutos com TST para o primeiro anticorpo Incubação local, 50 microlitros de antígeno de ovelha e anticorpo por lamínula em novas lâminas de vidro e coloque as lamínulas de cabeça para baixo na lâmina de vidro incubar por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara escura umidificada TST.

Posteriormente, as lamínulas são incubadas com uma série de anticorpos marcados com fluorescência para melhorar o sinal original, conforme detalhado no manuscrito que acompanha. Após a incubação com uma série de anticorpos marcados com fluorescência, desidrate as células por incubação por três minutos cada em etanol a 70%, etanol a 90% e etanol a 100%. Remova as lamínulas das placas de seis poços e deixe-as secar ao ar por vários minutos.

Por fim, localize uma gota de meio de montagem com dappy em cada lâmina de vidro. Adicione uma lamínula de cabeça para baixo na parte superior e sele as lâminas com esmalte. O uso deste protocolo para a inativação combinada do cromossomo D-N-A-R-N-A FISH pode ser visualizado na diferenciação de células ES femininas.

Esta figura mostra um exemplo representativo de experimento com peixes A-D-N-A-R-N-A onde o RNA do cisto e uma região do cromossomo X são detectados simultaneamente. O cisto de RNA é um RNA não codificante essencial para o processo de inativação do cromossomo X. Ao diferenciar o cisto feminino de ESL, o RNA é detectado usando uma sonda CD NA marcada com biotina, que é visualizada usando anticorpos conjugados à rumina e indicados em vermelho.

O cromossomo X é detectado usando um xigen na sonda BAC marcada, que é visualizada usando anticorpos conjugados ao FITC indicados em núcleos verdes são contra-corados com DPI indicado em azul. Em quase todas as células, dois cromossomos x são detectados. São detectados grandes acúmulos de cistos nos cromossomos X inativos ou nuvens de cistos e a expressão basal de cistos do cromossomo X ativo ou pontos de cisto.

A localização do cisto não é detectada em todos os núcleos porque, após a diferenciação, essa expressão basal do cisto cessa no futuro cromossomo X ativo. Observe que alguns dos sinais precisos derivados do cromossomo X estão localizados dentro de nuvens de cistos, mostrando assim que a nuvem de cistos está de fato localizando e codificando o cromossomo X Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em menos de dois dias e com um resultado confiável se for realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como induzir a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos fêmeas, como consertar essas células e como prepará-las para permitir que você execute peixes D-N-A-R-N-A combinados. Lembre-se de que é importante para o sucesso de seus experimentos manter as temperaturas e os tempos de incubação constantes, conforme indicado neste protocolo. Além disso, é importante trabalhar em um ambiente limpo.

Se você estiver usando um tipo de célula diferente ou estudando um sistema biológico diferente, pode ser necessária alguma otimização para fornecer um resultado ideal. Boa sorte com seus experimentos.