Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

O objetivo geral deste procedimento é medir a corrente elétrica através de um único canal iônico. Isso é feito primeiro expressando heterologicamente o canal iônico de interesse em células que são fáceis de trabalhar e conduzem aos objetivos experimentais. O segundo passo é usar uma pipeta polida a fogo para obter uma vedação estável na membrana celular.

Em seguida, o experimentador deve determinar o número de canais presentes no patch e, se for corrente de registro de canal único, a etapa final é processar e analisar os dados. Em última análise, o registro de corrente de canais iônicos únicos é usado para investigar as propriedades biofísicas pelas quais essas proteínas de membrana agem, o que forma a base de como as células neuronais e outras células excitáveis se comunicam. Em contraste com os métodos que permitem medir correntes através de vários canais iônicos ativos, a vantagem dessa abordagem é que a medição de correntes através de um canal iônico individual permite visualizar e separar uma ampla gama de padrões de resposta inerentes a um canal específico.

Este método pode ser usado para responder a questões-chave no campo da neurociência, como moduladores fisiológicos e terapêuticos influenciam a comunicação entre os neurônios. Geralmente, os indivíduos que são novos nessa técnica terão dificuldades porque é difícil obter gravações de baixo ruído que contenham apenas um único canal iônico. Ao tentar esse método pela primeira vez, é muito útil ver alguém fazer isso porque para obter uma vedação realmente estável, que é a coisa mais importante nesse método, você precisa se aproximar da célula suavemente no ângulo específico e, o mais importante, você precisa ser persistente para se preparar para a transfecção.

As células HEK 2 93 são colocadas em placas de 35 milímetros com um dia de antecedência para levá-las a 50 a 60% de confluência em um tubo estéril. Prepare a mistura de transfecção. Adicione um micrograma de cada CDNA de interesse, 315 microlitros de água bidestilada e 350 microlitros de 42 pilhas milimolares.

Por fim, adicione 35 microlitros de cloreto de cálcio gota a gota para formar o precipitado. Vortex o tubo por cinco segundos e adicione 175 microlitros de suspensão de transfecção a cada um dos quatro pratos. Banhado no dia anterior.

Incube as células a 37 graus Celsius por duas horas. Após a incubação, remova o meio e lave com PBS. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de crescimento, suplementado com dois milimolares de cloreto de magnésio para evitar uma excitotoxicidade mediada pelo receptor MDA.

Primeiro, puxe duas pipetas de gravação simétricas de vidro de silicato de menino usando um extrator vertical. Em seguida, o polimento a fogo é necessário para obter o diâmetro e a resistência adequados. Em seguida, configure a gravação abrindo o software de aquisição de dados QUB e selecionando a janela de aquisição.

Sob layout. Abra um novo arquivo de dados QUB clicando em novos dados e insira os parâmetros experimentais a serem usados. Ajuste a escala de amplitude para 0,1 volts por pico amp clicando com o botão direito do mouse no arquivo de dados, selecionando propriedades e clicando na guia de dados.

Depois de substituir o meio por dois mililitros de PBS contendo cálcio e magnésio, monte o prato de células no microscópio stage. Concentre-se no campo celular usando microscopia de contraste de fase para avaliar se as células estão saudáveis e bem presas ao prato de forma monocamada. Mude para detecção de fluorescência para verificar se a transfecção foi bem-sucedida.

Em seguida, defina os parâmetros para gravação de canal único. Defina o modo para clamp de tensão e tensão aplicada para mais 100 milivolts com o comando de retenção de tensão. Na posição desligada, selecione o botão de teste de vedação com base na fluorescência e na aparência geral.

Escolha uma célula para remendar, verifique sob contraste de fase se a célula está bem presa ao prato, tem uma grande parte da superfície celular exposta para remendo e parece saudável. Encha uma pipeta recém-polida com uma solução adequada para receptores NMDA e experimentos ligados a células e agite suavemente para desalojar quaisquer bolhas de ar. Prenda a pipeta de gravação no ampcabeça do amplificador stage e certifique-se de que o fio prateado esteja imerso na solução da pipeta para evitar que a solução de banho entre na pipeta.

Durante a abordagem, use uma pequena seringa de plástico conectada ao porta-pipetas para aplicar suavemente pressão positiva. Em seguida, use o micro manipulador para direcionar a pipeta para o banho. Fechando o circuito elétrico, posicione-o diretamente sobre a célula selecionada para patching.

Observe o osciloscópio ao entrar no banho. A resistência da pipeta deve estar dentro da faixa ideal enquanto monitora visualmente a posição do tubo no microscópio e sua resistência elétrica no osciloscópio. Continue a abordagem em pequenos incrementos até que a pipeta colida suavemente com a célula.

O sinal de teste diminuirá ligeiramente para indicar aumento da resistência. Para formar uma vedação, pegue a seringa e aplique suavemente uma leve pressão negativa através do tubo lateral. Ao puxar a formação da vedação do êmbolo da seringa, é indicada por um achatamento completo da forma de onda do sinal de teste no osciloscópio.

No amplificador. Alterne a alternância de comando externo de teste de vedação para desativado. Mude o comando de retenção de tensão de desligado para positivo e aumente o ganho de 10 x para 100 x.

Observe o osciloscópio para a atividade do canal, que, se presente, será exibida como deflexões quadradas para baixo da linha de base anteriormente plana. Se a atividade do canal for exibida no osciloscópio, comece a adquirir dados no digital aberto anteriormente file no QUB pressionando o botão play, seguido pelo botão de gravação. Para interromper a aquisição de dados, pressione o botão de parada no QUB e salve o arquivo QDF um sinal que não se achata completamente ou uma linha de base que se torna ruidosa e instável pode indicar uma vedação fraca.

Neste caso, remova e descarte a pipeta e repita as etapas do processo com uma pipeta nova até obter uma vedação adequada. Para iniciar o processo de análise de dados, abra o arquivo de dados gravado no QUB e inspecione o rastreamento atual na pré-interface. Sob layout.

Remova o filtro digital para exibir o rastreamento gravado em largura de banda total, desmarcando a caixa identificada fc. Examine visualmente o traço para detectar irregularidades e artefatos Resumo. Os picos de corrente podem ser corrigidos destacando uma região limpa adjacente da mesma classe de condutância.

Clicando com o botão direito do mouse e selecionando definir buffer de apagamento primeiro, amplie o pico até que os pontos de amostra individuais estejam visíveis. Selecione a região a ser substituída destacando apenas essa região. Clique com o botão direito do mouse e selecione apagar para corrigir a linha de base de todo o registro.

Defina a linha de base atual zero selecionando uma parte inicial do registro em que a linha de base é estável. Realce o clique com o botão direito do mouse e selecione definir linha de base. Quando a diretriz básica for exibida, confirme por inspeção visual se ela representa com precisão o nível da linha de base.

Identifique pontos no registro em que a linha de base de dados brutos se desvia visivelmente da linha de base definida. Corrija isso selecionando uma pequena seção da linha de base dentro da região desviante. Clique com o botão direito do mouse e selecione o comando adicionar um nó de linha de base.

Quando o registro contém períodos ocasionais com excesso de ruído ou artefatos, que não podem ser facilmente corrigidos, essas partes devem ser excluídas, mas primeiro precisam ser divididas em segmentos consecutivos. Realce imediatamente antes da região a ser descartada. Clique com o botão direito do mouse e selecione quebrar segmento.

Em seguida, destaque a seção a ser descartada, clique com o botão direito, selecione, exclua e pressione Enter para idealizar os registros. Alterne para a interface MOD no layout. No painel de exibição de dados, selecione uma pequena parte do registro que contém eventos fechados e abertos.

Mova o cursor para o painel de alta resolução abaixo e, dentro do traço selecionado, realce um segmento limpo representativo da linha de base. Mova o cursor para o painel do modelo abaixo, clique com o botão direito do mouse no quadrado preto, que representará o estado fechado e selecione agarrar. Repita o procedimento para aberturas de canal destacando uma parte das características que representa a condutância aberta.

Clique com o botão direito do mouse no quadrado vermelho no painel do modelo e selecione agarrar. Execute a idealização para a parte selecionada do registro selecionando o botão SEL em fonte de dados. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na guia idealizada abaixo da seção de modelagem no painel pop-out.

Verifique se os parâmetros desejados para análise estão corretos e clique em executar. O resultado da idealização, juntamente com o histograma de amplitude para a parte selecionada, é sobreposto aos dados para permitir a inspeção visual da idealização. Se necessário, ajuste os parâmetros de idealização para obter o melhor resultado e repita, execute a idealização para todo o arquivo selecionando o botão de arquivo em fonte de dados.

Em seguida, clique com o botão direito do mouse na guia idealizada e clique em executar. Os resultados de todo o arquivo são exibidos. Sobreposto aos dados, inspecione cuidadosamente a correspondência entre o rastreamento idealizado e os dados registrados.

Ocasionalmente, são identificados falsamente eventos que podem ser excluídos do rastreamento idealizado. Selecione o evento falso clique com o botão direito do mouse e selecione ingressar IDL. Aqui são mostradas apenas correntes de íons de cálcio através de um único receptor NMDA em uma célula HEK 2 93.

Usando a técnica de patch clamp anexado à célula, a idealização de dados produz histogramas de amplitude, que se encaixam perfeitamente em duas classes distintas de condutância nesta célula. Gravação anexada de HEK 2 93 células, um canal sensível Meno é ativado em menos 20 milímetros. Pressão de mercúrio através da pipeta de remendo durante a aplicação constante de tensão.

A linha pontilhada vermelha indica o nível de corrente zero. Essas gravações de canais nativos mostram a atividade contínua do receptor NMDA registrada do soma de um neurônio que foi dissociado do córtex pré-frontal de um embrião de rato e mantido em cultura por cinco ou 27 dias. Uma vez masterizado, este procedimento pode ser feito em 30 minutos a uma hora, dependendo da duração da gravação.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como análise cinética e modelagem de estado, podem ser realizados para determinar o mecanismo de passagem de um canal e estimar as taxas de reação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como registrar e começar a analisar correntes através de uma proteína de canal iônico.