Um método de permeabilização de Drosophila Os embriões para Ensaios de pequena molécula Atividade

O objetivo geral do experimento a seguir é preparar embriões de drosófila viáveis com casca de ovo permeável para testar a bioatividade de drogas ou toxinas de pequenas moléculas introduzidas. Isso é feito tratando primeiro os embriões em estágio de desenvolvimento com alvejante diluído para remover as camadas externas da casca do ovo coriônico. O segundo passo é permear os embriões com um solvente que esgota a fina camada de casca de ovo cerosa que bloqueia solutos de pequenas moléculas.

O terceiro passo é tratar os embriões com uma droga ou toxina e um corante para avaliar simultaneamente a permeabilidade da casca do ovo e introduzir um composto de interesse. Após o desenvolvimento adicional, os embriões podem ser visualizados diretamente ou processados para imuno-histoquímica. Em última análise, os resultados podem mostrar a atividade de uma droga ou toxina no desenvolvimento dos tecidos, conforme determinado por microscopia fluorescente com imunorreagentes ou laços vitais.

Hoje apresentarei nosso método de permeação de embriões de drosófila para ensaios de atividade de pequenas moléculas. As principais vantagens desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de solventes orgânicos convencionais, como heptano para permanente. A casca do ovo é que nosso solvente de permeação embrionária, ou EPS, pode ser perdido em água e relativamente não tóxico.

Essas propriedades facilitam os tratamentos embrionários, nos quais as exposições a solventes podem ser controladas com mais precisão e podem ser realizadas em meios fisiologicamente relevantes, o que resulta em maior viabilidade embrionária. Tive a ideia desse método pela primeira vez quando pensei em como remover a camada cerosa da casca do ovo. Sendo um esquiador, refleti sobre o uso comum de solvente cítrico para remover a cera residual da base dos esquis.

Isso me levou a traduzir este aplicativo para a casca do ovo do embrião de mosca e, após algumas tentativas e erros, levou à resolução da composição do EPS, prepare gaiolas populacionais com pelo menos 500 moscas em idade de acasalamento das cepas desejadas. As gaiolas devem ser ajustadas com suco de uva de 10 centímetros. Aera com um pouco de pasta de fermento.

Troque essas placas duas vezes ao dia. Após alguns dias, as moscas serão condicionadas à cultura e colocarão embriões com mais regularidade. O EPS é feito de surfactantes e soluções de solventes limitantes e é bom por dois meses.

Quando armazenados em temperatura ambiente, aqueça os surfactantes a 37 graus Celsius ao misturar EPS fresco Para o tratamento com EPS, os embriões são manuseados com cestos feitos de três centímetros, ou seja, tubo de polipropileno de 50 mililitros e malha de náilon desbastada. As bordas de plástico derretem na malha mais facilmente durante as etapas posteriores de desenvolvimento. Os embriões também são manuseados com cestos feitos de tampas de tubos de 50 mililitros.

A tampa é perfurada e entalhada, e o rosqueamento entre a tampa e o tubo prende a malha. Alternativamente, uma câmara deslizante de máquina local é usada e preparada com um pedaço de oxigênio permeável. Faça a membrana presa sobre a abertura por um anel de retenção para colher os embriões.

Coloque um prato de uva fresca com pasta de fermento na cultura pela manhã. Após uma hora, troque o prato e descarte o primeiro prato coletado. Deixe a segunda placa coletar embriões por duas horas a 25 graus Celsius.

Em seguida, colete a placa e transfira-a para 18 graus Celsius. Permita que os embriões se desenvolvam até o estágio desejado. Quando os embriões estiverem prontos, defina-os antes do tratamento com EPS.

Enxágue-os do prato na cesta de purê com água e pincel. Em segundo lugar, enxágue-os em água corrente suave para remover quaisquer detritos. Terceiro, mergulhe-os em alvejante a 50% por dois minutos com circulação periódica da solução de alvejante.

Em seguida, enxágue-os imediatamente com água corrente. Agora encha seis pratos de 60 milímetros, cada um com 10 mililitros de PBS para funcionar como banhos, e faça uma diluição de um a 40 do estoque de EPS em MBIM agitando a mistura. Uma emulsão branca formará, borrará o excesso de água do fundo da cesta de malha usando um pano e mergulhará os embriões na diluição de EPS com movimento de redemoinho constante.

Depois de girar os embriões em EPS por 30 segundos, remova-os e seque o excesso de solução. Em seguida, mova a cesta entre os seis banhos PBS, esguichando suavemente para enxaguar e prosseguir com o tratamento com corante e medicamentos. Otimizar a permeabilidade e a viabilidade é a parte mais complicada deste protocolo.

A permeabilidade é sensível ao estágio de desenvolvimento do embrião. A temperatura na qual os embriões são envelhecidos também pode variar muito entre as linhagens individuais de moscas. Os melhores parâmetros para diluição de EPS e tempo de exposição devem ser obtidos empiricamente.

Primeiro, prepare uma solução micromolar de 50 micromolares de corante de ácido carboxílico de ficção científica em M-B-I-M-T um mililitro em um tubo de microficha é suficiente. Uma toxina ou medicamento pode ser adicionado nesta fase para que o vórtice de tratamentos agudos se misture. Transfira os embriões permanentes da cesta para o tubo de micro fuga com um pincel.

Tampe o tubo e inverta-o várias vezes. Em seguida, carregue o tubo em um mutador e deixe-o incubar por 15 minutos. Depois que os embriões se estabelecerem, remova o corante com uma pipeta e adicione novamente um mililitro de M-B-I-M-T para uma lavagem. Resus.

Suspenda os embriões, deixe-os assentar e substitua o M-B-I-M-T. Em seguida, faça isso pela terceira e quarta vez. Quando a quarta lavagem estiver concluída, remova todo o M-B-I-M-T e mova os embriões para uma cesta de desenvolvimento por longos períodos de desenvolvimento.

Para a cesta de desenvolvimento primeiro, prepare a cesta com um enxágue de 70% de etanol e depois di água, seque o sangue com um lenço umedecido. Quando terminar. Em seguida, transfira a cesta para um prato de 60 milímetros com seis mililitros de meio de incubação contendo o medicamento ou toxina desejada.

Transfira os embriões para a malha na cesta com um pincel, soltando suavemente o meio de incubação sobre eles, disperse os embriões em uma monocamada. Tenha cuidado para não prender bolhas de ar sob a malha. Para usar uma câmara deslizante primeiro, prepare a câmara, inverta a câmara deslizante e coloque uma fina camada de graxa a vácuo ao redor da borda da abertura.

Em seguida, 150 microlitros do meio desejado na superfície da membrana dentro da abertura. Agora, transfira os embriões para a mídia usando um pincel e disperse-os sobre a membrana. Finalize aplicando uma lamínula circular de 25 milímetros achatando o meio.

Aplique uma leve pressão ao redor do perímetro para garantir a vedação. Há um efeito robusto da criação de embriões a 18 graus Celsius em sua capacidade de serem permanentes por EPS e absorverem corante nos estágios finais de desenvolvimento. Isso é ilustrado pela ausência de absorção de Rumine BD em embriões tratados com EPS criados a 25 graus Celsius A absorção de corante de ácido carboxílico de ficção científica vista aqui em vermelho revela os vários níveis de permeabilidade normalmente vistos em embriões tratados com EPS.

A distribuição dinâmica do corante de ficção científica vermelho distante durante o desenvolvimento e sua consolidação na gema dentro do intestino desenvolvido visto com autofluorescência azul revelam um critério usado para avaliar a viabilidade. O corante de ficção científica também pode determinar o embrião permeável anterior após a fixação de formaldeído e imunocoloração. Depois que os embriões de EPS foram tratados com corante de ficção científica e toxina de metilmercúrio, eles são corados com Antifa dois vistos em verde para rotular neurônios motores e anti E lab em vermelho para rotular corpos celulares de neurônios.

O corante de ficção científica é pseudocolorido em azul. O metilmercúrio tem efeito sobre a padronização dos corpos celulares dos neurônios cortonais marcados pelas setas nos embriões de tratamento controle. Esses neurônios têm um fascialmente mais ordenado dois mostrados aqui em branco ilustram a ramificação normal dos neurônios segmentares no tratamento de controle observado pelas pontas das setas.

Em comparação, o tratamento com metilmercúrio altera o padrão de ramificação marcado pelas setas verdes sólidas. A seta verde oca marca onde a ramificação foi deslocada. Uma vez dominado, os tratamentos de permeação embrionária nesta técnica podem ser feitos em cerca de 30 ou 40 minutos, se forem realizados corretamente.

Após este procedimento, outros métodos, como fixação e imunocoloração dos embriões, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como quais tecidos específicos são alvo de uma droga ou toxina durante o desenvolvimento. Agradeço por assistir a este procedimento e desejo-lhe boa sorte ao colocar esses métodos em prática em seu laboratório.