Uma Ex vivo Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

O objetivo geral deste procedimento é dissecar uma cultura ex vivo, camundongo, implantes tireoidianos embrionários ou lobos para permitir o estudo de eventos morfogenéticos e de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tireoide. Isso é feito removendo primeiro a mandíbula superior e a parte inferior do corpo do dia embrionário. E 12.5 a E 14.5 embriões de camundongos para isolar a região do pescoço dos embriões.

Na segunda etapa, o tubo neural, os tecidos laterais e a língua são removidos para expor a parte superior da traqueia e do esôfago. Em seguida, o broto, as regiões ou os lobos da tireoide são limpos de quaisquer tecidos indesejados. Na etapa final, os implantes de tireoide são plaqueados para cultura em um micropoço revestido ou em um filtro.

Em última análise, imagens de lapso de tempo, coloração imunológica ou análise de expressão gênica podem ser realizadas para estudar a morfogênese epitelial, organização tridimensional e folículos, vascularização dos implantes ou diferenciação de progenitores da tireoide. Este método pode ajudar a responder ao desenvolvimento e diferenciação importantes. Pergunta sobre a organização das células epiteliais da tireoide em 3D, formação de lúmen, diferenciação celular, polarização e crescimento.

Demonstrando o procedimento estarão Fidel Marcel, um estudante de pós-graduação, e Myla LaCorte, um pós-doutorado, ambos do meu laboratório Sob condição estéril na capela de fluxo laminar. Duas horas antes do isolamento do tecido tireoidiano, diluir o colágeno tipo um estéril a 50 microgramas por mililitro. Concentração final em cloreto de hidrogênio 10 milimolar e coloque o colágeno no gelo.

Em seguida, cubra cada um dos poços de uma câmara de cultura de plástico com 200 microlitros de colágeno diluído e incube a câmara em temperatura ambiente Após duas horas, aspire o colágeno. Enxágue os poços com meio M1 99 e adicione um volume mínimo de 200 microlitros de meio de cultura a cada um. Bem, coloque as câmaras revestidas na incubadora e, em seguida, prossiga com a dissecção da tireoide.

Primeiro, coloque o útero dissecado em uma placa de 10 centímetros contendo HBSS. Em seguida, use uma pinça para segurar uma extremidade do útero e, em seguida, abra o útero com uma pequena tesoura para liberar consecutivamente cada um dos embriões. Use a tesoura para separar os embriões da placenta e, em seguida, transfira os embriões dentro de suas membranas embrionárias extras para uma nova placa de 10 centímetros contendo HBSS fresco.

Em seguida, continue a dissecção sob um microscópio estéreo para cada embrião. Primeiro, remova o saco vitelino e o âmnio. Em seguida, segurando agulhas de tungstênio em capilares de vidro como faca e garfo.

Remova a parte superior da cabeça, incluindo a mandíbula superior e as orelhas. Segure o embrião de costas. Em seguida, remova um pedaço extra do tubo neural e depois remova a parte inferior do embrião logo abaixo dos membros anteriores e acima do coração.

Para orientar o tecido, transfira a fatia do embrião contendo a língua e a região do pescoço para uma nova placa de 10 centímetros contendo HBSS fresco e remova o tubo neural e os tecidos posteriores ao esôfago e à traqueia. Agora separe suavemente a fatia de tecido ao longo de ambos os lados da língua. Em seguida, localize o esôfago e a traqueia, disseque a língua, deixando o inchaço retinóide e o tecido em ambos os lados do esôfago e da traqueia.

Depois de remover a língua, disseque o esôfago e coloque a traqueia com o lado ventral para cima. Em seguida, disseque os tecidos indesejados, como o timo e todos os tecidos localizados lateralmente às artérias do arco faríngeo. Em seguida, para os embriões E 13.5 ou E 14.5, visualize os lobos da tireoide em cada lado da traqueia e disseque ainda mais os lobos da traqueia.

Para embriões E 12.5, a dissecção pode ser realizada como demonstrado até depois da excisão da língua e do esôfago. Em seguida, depois de localizar as artérias do arco faríngeo, remova todos os tecidos laterais como para embriões E 13,5 a 14,5. Finalmente, usando uma ponta de filtro pré-umedecida em uma micropipeta P 200, transfira o tecido isolado para uma placa de cultura de 35 milímetros contendo meio de cultura pré-aquecido.

Antes de plaquear o E 13.5 a E 14.5 tireóide X explan. Primeiro, lave o tecido por transferência sucessiva para três poços de uma placa de 24 poços contendo um mililitro de meio de cultura pré-aquecido para colocar os lóbulos nas câmaras pré-revestidas. Primeiro, aspire o meio de cultura e use uma micropipeta com pontas filtradas para colocar cuidadosamente um lobo da tireoide em cada uma das câmaras de cultura.

Remova qualquer excesso de meio e, em seguida, coloque a câmara de cultura em uma incubadora de cultura de tecidos para permitir que os explantes se fixem à matriz. Então, após duas horas, adicione suavemente 200 a 300 microlitros de meio de cultura pré-aquecido a cada poço e coloque as câmaras de volta na incubadora para colocar a região da traqueia E 12,5 ou os lobos da tireoide em filtros semiporosos. Primeiro, encha os poços de uma placa de 24 poços com cento e 30 microlitros de cultura pré-quente.

Médio: coloque filtros no meio. Tomando cuidado para evitar prender bolhas de ar abaixo do filtro de cultura. Em seguida, use uma micropipeta com pontas filtradas para transferir cuidadosamente a explicação ou lóbulos da tireoide e um volume mínimo de meio para o centro de cada um dos filtros para um máximo de quatro x explicação por filtro.

Ao colocar o X explanando no filtro, é importante transferi-los para o centro do filtro com uma quantidade mínima de meio para evitar que o meio entre em contato e crie menisco com a parede do filtro. Finalmente, remova qualquer excesso de meio e use uma agulha de tungstênio para espaçá-los. Em seguida, coloque-os na incubadora de cultura de tecidos por até sete dias, trocando o meio de cultura a cada dois dias sob a capa de fluxo laminar.

Após um dia em cultura em um filtro, a linha média no laa é visível como um tecido alongado que abrange o comprimento superior e forma dois lobos de cada lado da traqueia. Com a cultura, os lobos se expandem passando pela organização morfogênica das células epiteliais em estruturas foliculares macroscopicamente visíveis. Conforme demonstrado nessas imagens, a organização e a polarização das células epiteliais positivas e coerentes podem ser visualizadas pela imunomarcação de ezrin.

Com o tempo, as estruturas intracelulares positivas para ezrina se fundiram com o pólo da célula que se tornará o pólo apical. Durante esse processo, as células endoteliais positivas quatro pcam proliferam e se organizam em torno dos folículos em desenvolvimento para formar unidades angiofoliculares. Para quantificar a diferenciação das células thro, cytes e C, a expressão gênica pode ser testada por R-T-Q-P-C-R de RNA, isolado dos lobos tireoidianos cultivados.

Embora a expressão do fator de transcrição tireoidiano, NK X 2.1, não mude durante a cultura, a expressão da tireoglobulina específica thy e da calcitonina específica das células C aumenta drasticamente, indicando uma diferenciação funcional. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar e cultivar o explanação da tireoide. Você não está pronto para realizar experimentos de ganho e perda de função usando embriões selvagens ou NOCO.