Name: Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a detectar produção de IFN-γ em nível de célula única usando ELISpot para avaliar resposta imune contra o vírus varicela-zoster. Este ensaio robusto quantifica respostas de células T com equipamento acessível.

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Os autores gostariam de agradecer os participantes do estudo e seus pais. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Réjean Lapointe (CHUM Notre-Dame, Montreal, Canadá) para o acesso ao seu leitor ELISpot, Dr. Lubo Alexandrov para análise estatística, e Denis Blais, Sandra Caron, Silvie Valois e Martine Caty para especialista técnico assistência. Apoiada por doações de le Fonds d&#39;opération pour les Projets de Recherche et d&#39;Clinique des evalution tecnologias (CHU Sainte-Justine) para HS e PO, por la Fondation Centre de Cancerologie Charles-Bruneau, e pelo Leukemia &amp; Lymphoma Society of Canadá. ISF foi apoiado por bolsas de estudo de la Fondation CHU Sainte-Justine e le Fonds de la recherche du Québec-santé (FRQS). AJG foi o destinatário de bolsas de estudo do Departamento de Microbiologia, Imunologia &amp; Infecciologia, Université de Montréal (Gabriel-Marquês de Bolsas de Estudo), FRQS, e do Canadian Institutes of Health Research (CIHR). NM foi apoiado por la Fondation CHU Sainte-Justine, a Fundação Cole, e FRQS.

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética Ética em Pesquisa do CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, no Canadá, onde o estudo foi realizado. O consentimento informado foi procurado e obtido de todos os participantes do estudo, seus pais ou responsáveis ​​legais. Todos os procedimentos realizados nos dias 1 e 2 deve ser realizado sob condições estéreis (isto é, sob uma câmara de fluxo laminar). Procedimentos de segurança padrão para o manuseio de sangue humano devem ser estritamente observados. 1. O revestimento das placas <ol><li> Permeabilizar o difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membranas na parte inferior de 96 poços placas ELISpot branco MultiScreen IP, adicionando a cada poço 20 ul de etanol a 35% durante 1 min. Membranas deve tornar-se um pouco translúcido. </li><li> Imediatamente lavar os poços 3 vezes com 200 ul de 1x tampão fosfato salino (PBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH 7,4) utilizando uma multichannel pipeta ou dispositivo semelhante. Esta etapa é fundamental, uma vez que os resíduos de álcool pode afetar a viabilidade celular e ligação do anticorpo de captura. Placas ELISpot são frágeis e devem ser manuseados com cuidado: não é recomendado o uso de uma placa de lavadora automática. </li><li> O revestimento das cavidades com 10 pi de rato purificada anticorpo anti-humano de captura de IFN-γ diluída em 1x PBS para uma concentração final de 10 ug / ml. Cubra as placas com filme plástico regular e incubar durante a noite a 4 ° C. </li></ol> 2. Bloqueio placas <ol><li> Esvaziar os poços, batendo-os secar e lavar placas 5 vezes com 200 mL de PBS 1x. </li><li> Encha as cavidades com 200 ul de meio completo RPMI 1640 e incubar as placas durante 2 horas a 37 ° C (passo de bloqueio). </li><li> Lavar as placas 5 vezes com 200 ul de PBS 1x e manter os poços cheios de PBS 1x até que as células estão prontas a ser revestida. </li></ol> 3. Celular chapeamento e Estimulação <ol><li> Prepare pAs células mononucleares do sangue eripheral (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso humano por centrifugação em gradientes de Ficoll-Paque, utilizando procedimentos padrão. Alternativamente, usando métodos padrão, descongelar alíquotas de PBMC congelados em azoto líquido. Após centrifugação os últimos, ressuspender as células em uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml e incubar durante a noite a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. </li><li> Retirar CMSP da incubadora e ressuspender-los em um volume final de 5 ml de meio completo de RPMI 1640. </li><li> Incubar de PBMC na presença de 10 ul de endonuclease de engenharia genética a partir de Serratia marcescens, durante 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Retirar uma aliquota de 50 ul de PBMC e misturar-se com 50 ul de corante azul de tripano. Contar as células e avaliar a viabilidade% utilizando um hemocitómetro e exame microscópico (método de exclusão de corante). Vários métodos automatizados para contagem de células e avaliação da viabilidade celular pode alentão ser utilizado. PBMC deve ser&gt; 95% viáveis. Descartar amostra quando a viabilidade for inferior a 95%. </li><li> Centrífuga PBMC a 700 xg durante 5 min, o sobrenadante de descarte, e ressuspender as células em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (HIS) a uma concentração final de 2 x 10 6 células / ml. Manter a 37 ° C até que as misturas de estimulação são adicionados à placa. </li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, 100 uL da mistura de estimulação adequado. Três misturas de estimulação devem ser utilizados como descrito abaixo: <ol><li> Utilização meio de AIM-V suplementado com 2% (v / v) de soro humano inactivado (IHS) como controlo negativo. </li><li> Use anticorpo monoclonal anti-CD3 (clone OKT3), diluída em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS para uma concentração final de 0,5 ug / ml como controlo positivo). </li><li> Use antigénio VZV, sob a forma de um ou outro irradiadas-γ (10.000 Gy, 30 min de tempo de exposição) vivo atenuado da vacina de VZV (unidades formadoras de placa 1350 UFP [] / ml) diluiçãoted a 1:200 em meio AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS) ou 1 ug de uma mistura equimolar de 67 péptidos (15 resíduos de aminoácidos) sintetizados com base na sequência do VZV imediatamente precoce (IE63) fosfoproteína . Controlar a eficácia da irradiação por monitorização da ausência de sinais visíveis de efeitos citopáticos após 4 dias em culturas de CMSP. </li><li> Prepare todos os poços em duplicado. </li></ol></li><li> Adicione às cavidades, uma gota de cada vez, a 100 ul de células preparado no passo 5.4 aos poços apropriados. Dois poços devem ser deixados sem células (controle negativo). Incubar durante 20 horas a 37 ° C sob uma atmosfera de CO2 a 5% numa incubadora com camisa de água. Não agite, mover ou empilhar as placas em cima uns dos outros durante a incubação. </li></ol> 4. Ponto de Desenvolvimento e Detecção <ol><li> Descartar as células e lava-se as placas 10 vezes com 1x de PBS suplementado com 0,05% (v / v) de Tween 20 (PBST). Tween 20 ajuda a separar as células que aderiram ao PVDF membrane após incubação durante a noite. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos, adicionar 100 ul de 0,5 mg / ml biotina conjugado anticorpo monoclonal anti-IFN-γ (clone 4S.B3) diluído em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA). Incubar as placas durante 2 horas à temperatura ambiente. </li><li> Lavar os poços 6x com PBST e adiciona cada poço 100 ul de estreptavidina conjugatd com fosfatase alcalina diluído 1:1000 em 1x PBS contendo 0,5% (w / v) de BSA. Cobrir as placas e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas 3x com PBST e 3x com PBS 1x. Adicionar 100 ul de um fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) nitro solução de substrato / azul de cloreto de tetrazólio (NBT) e incuba-se 5 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as placas com água corrente destilada. Retirar a parte inferior da placa de ELISpot e lavar ambos os lados da membrana, com água destilada. Air secar os pratos. </li><li> Examinar os poços e enumerar os pontos usando um d estereoscópicomicroscópio issection ou digitalizar as placas utilizando um contador local automatizado. Mantenha as placas ao abrigo da luz, se não podem ser examinados no mesmo dia. <ol><li> Calcule a média dos números de pontos contados em poços em duplicado correspondentes e subtrai o número de manchas contadas nos poços de controlo negativo (ausência de células) a partir do número de pontos contados em poços de teste. </li><li> Expressar a produção de IFN-γ como o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 10 6 PBMC. </li><li> Considere-se que as amostras de teste é positivo se o número de SFU é&gt; 50 por 10 6 PBMC e dois desvios padrão (DP) acima do controlo negativo (meio de células + AIM-V suplementado com 2% (v / v) IHS). </li><li> Use um valor de 400 SFU por bem quando os pontos são numerosas demais para serem contados. </li></ol></li><li> Teste se os dados ELISpot são normalmente distribuídos ou não pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando os dados são normalmente distribuídos, realizar comparações estatísticas utilizando tes t de Studentt (2 grupos) ou ANOVA e pós-teste de Bonferroni (comparações múltiplas). Se os dados não são normalmente distribuídos, use o teste de Mann-Whitney (2 grupos) ou Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn (comparações múltiplas). </li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Modificações e resolução de problemas: ensaios de IFN-γ ELISpot têm sido usados ​​para avaliar as respostas imunes mediadas por células dirigidas contra uma variedade de agentes patogénicos microbianos, incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) 24,25, vírus da hepatite C (HCV), 26, 27, e Mycobacterium tuberculosis 28,29, só para citar alguns. Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um ensaio ELISPOT IFN-γ para medir a imunidade celular contra, com a esperança...

Primeiro realizada em 1989, UCBT é cada vez mais utilizado como parte do tratamento de várias doenças do sangue neoplásicas e não-neoplásicas em crianças 1. VZV é um alphaherpesvirus humano citopático que causa duas doenças diferentes, varicela (após a infecção primária) e herpes zoster (após reativação). Após a infecção primária, VZV persiste durante toda a vida do hospedeiro abrigada dentro de nervos sensoriais dos gânglios da raiz dorsal. Uma das complicações infecciosas mais ameaçadores seguintes UCBT está associada com VZV 2-4. No nosso centro clínico, na ausência de VZV profilaxia, a incidência cumulativa de doença VZV VZV doença em 3 anos foi de 46% postUCBT 2. Nesses pacientes, a infecção de novo com ou reativação do VZV é freqüentemente associada com a disseminação visceral para o sistema nervoso central, pulmões e fígado 5-7. Como resultado, o aciclovir, o valaciclovir ou famciclovir profilaxia é vulgarmente administrada em UBDestinatários CT 8,9. No entanto, esta estratégia de tratamento não ter em conta o potencial protector dos linfócitos T específicos de VZV ou a cinética de reconstituição de VZV respostas de células T específicas. Os problemas potenciais associados com o uso crescente de profilaxia anti-herpéticas longo prazo incluem a) overtreatment paciente; b) o desenvolvimento de resistência ao medicamento antiviral 10,11; e c) diminuição da VZV reconstituição imune específica 12,13. Como a detecção de VZV linfócitos T específicos funcionais correlaciona-se com a presença de proteção a longo prazo contra a infecção VZV e melhor evolução clínica 4,14,15, monitoramento mediadas por células respostas imunes dirigidas contra VZV durante o período pós-transplante pode resultar em um uso mais racional de antiviral tratamento, permitindo que os médicos a distinguir os pacientes que se beneficiariam de VZV profilaxia daqueles cujo sistema imunológico é capaz de controlar a replicação VZV 4,13. O ensaio ELISPOT de IFN-γ é amplamente utilizado para a monitorização de células de respostas imunes mediadas por uma variedade de sistemas experimentais e condições clínicas. Pontos são gerados após a clivagem de um substrato cromogénico, gerando um precipitado visível e estável no local da reacção. Cada foco individual representa, assim, a presença de uma célula produtora de citoquina indivíduo. IFN-γ ELISpot não só mede a capacidade das células individuais ex vivo para a produção de IFN-γ em resposta à estimulação in vitro com antigénio relacionado, mas também fornece uma estimativa da frequência de resposta de células numa determinada população celular 16,17. Para além da sua elevada sensibilidade, o IFN-γ ELISpot é simples de realizar, tornando possível a sua utilização no âmbito dos protocolos clínicos personalizados destinados a orientar a iniciação ou paragem do tratamento anti-viral. O procedimento detalhado abaixo descrevendoes um ensaio ELISPOT que é projetado especificamente para detectar e medir a produção de IFN-γ pelas células mononucleares do sangue periférico após estimulação in vitro com antígenos VZV derivados.

<table><tbody><tr><td>Tubo de leucocep</td><td>VWR</td><td>89048-936/89048-932</td><td>Tubos de 12 ml ou 50 ml podem ser usados dependendo do volume de sangue.</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Proteger da luz.</td></tr><tr><td>Nuclease de benzonagem</td><td>Novagen</td><td>70746-3</td><td>Manter a -20 &#176;C.</td></tr><tr><td>Placa de Filtro MultiScreenHTS-IP</td><td>Millipore</td><td>MSIPS4W10</td><td>Estéril com tamanho de poro de 0,45 &micro;m.&nbsp;</td></tr><tr><td>Camundongo anti-humano IFN-&gama; captura de anticorpo</td><td>BD Biosciences</td><td>551221</td><td>clone NIB42.&nbsp;</td></tr><tr><td>Pepmix VZV IE63&nbsp;</td><td>JPT Peptide Technologies</td><td>PM-VZV-IE63</td><td>Dissolva o conteúdo de um frasco em 40 &#956; l de DMSO. Use dentro de 6 meses.</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal conjugado com biotina anti-IFN-&gama;</td> clone <td>BD Biosciences</td><td>554550</td><td>4SB3.</td></tr><tr><td>Estreptavidina conjugada com fosfatase alcalina&nbsp;</td><td>Bio-Rad Life Science</td><td>170-3554</td><td>Diluir para uso no mesmo dia.</td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Bio-Rad Ciências da Vida</td><td>170-6432</td><td>Proteger da luz.</td></tr></tbody></table>

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Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

A varicela zoster (VZV) é uma importante causa de morbidade e mortalidade após um transplante de sangue do cordão umbilical (UCBT). Por esta razão, a profilaxia anti-herpética é administrado sistematicamente aos destinatários UCBT pediátricas para prevenir as complicações associadas à infecção por VZV, mas não há evidência com base consenso forte, que define a sua duração óptima. Porque a imunidade mediada por células T é responsável pelo controlo de infecção VZV, avaliando a reconstituição de VZV respostas de células T específicas a seguir UCBT poderia fornecer indicações quanto ao facto de a profilaxia deve ser mantido ou pode ser descontinuado. Para este fim, um interferão gama específica de VZV (IFN-γ) enzyme-linked immunospot (ELISPOT) foi desenvolvido para caracterizar a produção de IFN-γ por linfócitos T em resposta à estimulação in vitro com uma vacina de VZV vivo atenuado irradiado. Este ensaio proporciona uma medição rápida, reprodutível e sensível de VZV c específicaell imunidade mediada adequado para o monitoramento da reconstituição da imunidade específica VZV em um ambiente clínico e avaliar a capacidade de resposta imunitária a antigénios VZV.

O protocolo de ELISpot de IFN-γ detalhado acima, foi desenvolvido e optimizado no nosso laboratório para medir a magnitude e a qualidade das respostas celulares imunes mediadas dirigidos contra VZV 4. Várias fontes de antigénio VZV pode ser utilizado para o passo de estimulação. Estes incluem: a) detergentes comercialmente disponíveis extratos inativadas de VZV infectadas células Vero 18; b) piscinas de sobreposição de peptídeos sintéticos a partir de proteínas codificadas VZV específicos, incluind...

Novel gerações de ensaios funcionais, tais como o interferão gama (IFN-γ) ELISpot, que detectam a produção de citoquinas ao nível de células individuais e fornecer tanto a caracterização quantitativa e qualitativa das respostas das células T pode ser utilizado para avaliar as respostas imunes mediadas por células contra a varicela zoster vírus (VZV).

Desenvolvimento de uma varicela-zoster imunidade mediada por células específicas do vírus ELISpot Ensaio para Avaliar-γ IFN Após Cordão Umbilical Transplante de Sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

O objetivo geral do procedimento a seguir é detectar a produção de IFN gama ao nível de célula única para avaliar a resposta imune mediada por células direcionada contra o vírus da varicela-zóster ou VZV. Isso é realizado primeiramente revestindo os poços de uma placa de microtitulação com 96 poços com anticorpo monoclonal capturador de IFN gama. Na segunda etapa, as células são semeadas e estimuladas com antígeno do VZV.Em seguida, as células são removidas e o IFN gama capturado é marcado com um anticorpo de detecção, permitindo, por fim, quantificar a produção de IFN gama, bem como a magnitude e a qualidade das respostas imunes mediadas por células direcionadas contra o VZV. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o PMHC, tremores e coloração intracelular de citocinas, é que o ensaio de manchas de interferon gama é um método robusto, reprodutível e informativo, que pode ser realizado em amostras de sangue venoso utilizando equipamentos relativamente simples, como incubadoras, centrífugas e microscópios estereoscópicos.Para preparar as placas para o procedimento, comece adicionando 20 microlitros de etanol 35% em cada poço das placas multi-screen I

development-an-ifn-elispot-assay-to-assess-varicella-zoster-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.

Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos

Um protocolo rápido, simples e de baixo custo para a geração de doador-derivado multivirus específico CTLs (rctl) para infusão de células-tronco hematopoéticas alogênico transplante (TCTH) destinatários em risco de desenvolver infecções CMV, EBV ou Adv. Este processo de fabricação é compatível com GMP e deve garantir a mais ampla implementação de T-cell imunoterapia além de centros especializados.

Geração de células T específicas Multivirus para Prevenir / tratar infecções virais após transplante de células-tronco hematopoéticas alogênico

Aqui descrevemos a prática de fabricação primeiro (BPF) compatível com método de produção de vírus específicos linfócitos T citotóxicos (CTL) de sangue de cordão umbilical, fonte de células T predominantemente ingênua.

Expandindo linfócitos T citotóxicos do sangue do cordão umbilical que citomegalovírus Target, vírus de Epstein-Barr, e Adenovirus

A caracterização de epítopos de células T de patógenos que causam infecções localizadas, como o papilomavírus humano, é um desafio devido ao número limitado de células T em circulação. É descrito um método no qual células T raras foram isoladas e caracterizadas a partir de um número muito pequeno de células.

O uso de interferão-γ Enzyme-linked Assay immunospot Caracterizar Novel epitopos de células T de papilomavírus humano

O objetivo deste protocolo é fabricar células T de grau clínico específicas para patógenos usando um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração automatizado de bancada que incorpora um sistema fechado de captura de citocinas e não requer equipe dedicada ou uso de uma instalação GMP. As células T específicas do citomegalovírus pp65 geradas podem ser administradas diretamente aos pacientes.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

Ensaio enzyme-linked immunospot cultivadas interferão-γ longo termo é usado como uma medida das respostas de memória central e correlaciona-se com a resposta à vacina anti-micobacterianos de protecção. Com este ensaio, as células mononucleares de sangue periférico são estimuladas com antigénios micobacterianos e interleucina-2 durante 14 dias, permitindo a diferenciação e a expansão das células T de memória central.

Aplicação de longo prazo cultivadas Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Ensaio para a Avaliação e efetoras de memória T respostas de células em gado

Um protocolo para avaliar as respostas de células T antígeno-específicas nos órgãos immunoprivileged do Ifnar1- / - modelo murino para a infecção de vírus (ZIKV) Zika é descrito. Este método é essencial para investigar os mecanismos celulares da proteção e imunopatogênese das vacinas ZIKV e também é valioso para sua avaliação de eficácia.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

O desenvolvimento do ensaio ELISpot para cobaia PBMCs interferão-gama permite a caracterização das respostas de células T neste modelo altamente relevantes para o estudo de doenças infecciosas. Temos aplicado o ensaio para medir respostas de células T associadas a intradérmica entrega de vacinas de DNA.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

O presente protocolo combina estimulação ex vivo e citometria de fluxo para analisar perfis polifuncionais de células T (TPF) em células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em crianças vacinadas com o vírus da encefalite japonesa (JEV). O método de detecção e o esquema de cores da citometria de fluxo de TPFs específicos do JEV foram testados para fornecer uma referência para estudos semelhantes.

Detecção de Células T Polifuncionais em Crianças Vacinadas com Encefalite Japonesa através da Técnica de Citometria de Fluxo

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Este protocolo demonstra a injeção de veias temporais para a entrega intravenosa de células cancerígenas pediátricas a camundongos neonatais, permitindo modelagem precisa e reprodutível das respostas imunes em início de vida contra o câncer. O método permite avaliar o impacto de intervenções, como imunomodulação ou terapia, quando aplicadas durante o período neonatal.

Um modelo de transplante intravenoso neonatal para avaliação das atividades imunológicas na infância contra células cancerígenas

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